中华人民共和国进出口商品检验行业标准 SN/T0549-1996 出口蜂王浆及干粉中维生素B6检验方法 Method for determination of vitamin B6 in fresh royal jelly and lyophilized royal jelly powder for export 前言 本标准是根据 GB/T 1.1-1993《标准化工作导则 第1部分：标准编写的基本规定》进行编写的，同时参考了 SN/T0001-1995《出口商品中农药、兽药残留及生物毒素检验方法编写的基本规定》（以下简称《规定》）。标准的起草依据日本等国对蜂王浆及干粉中添加的维生素B6含量的要求，参考国内外有关文献及《规定》内容而制定。本标准由中华人民共和国国家进出口商品检验局提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国浙江进出口商品检验局。本标准主要起草人：鲍晓霞、陈笑梅。 1 范围 本标准规定了出口强化蜂王浆及干粉中维生素B6的抽样、制样和液相色谱测定方法。本标准适用于出口强化蜂王浆及干粉中维生素B6的测定。 2 抽样和制样 2.1 检验批 鲜王浆以不超过 300kg 为一检验批。王浆冻干粉以不超过 100kg 为一检验批。同一检验批的商品应具有相同特征，如包装、产地、规格和等级等。 2.2 抽样方式和数量 每批抽样不少于 3 箱，每箱取 60g。若从冷库中取出鲜王浆，需经解冻；干粉需升温至室温取样，共约 180g，作为原始样品。 注：车间取样（仅限鲜蜂王浆）以每个拼配锅为一个生产批号作为取样单位，但不得超过 300kg；抽取样品不超过 500g，充分混匀后，密封保存。 2.3 试样制备 从每袋原始样品中取出部分有代表性样品，充分混匀，用四分法缩分出不少于 50g 试样。装入清洁容器内，加封后，标明标记，送实验室作检验样。 2.4 样品保存 将样品于 -18℃ 以下冷冻保存。 注：在抽样及制样过程中，必须防止样品受到污染或发生含量的变化。 3 测定方法 3.1 方法提要 试样用 10% 偏磷酸提取，沉淀样品中的蛋白质，离心，取上清液，用高效液相色谱仪测定，外标法定量。 3.2 试剂和材料 除特殊规定外，试剂均为分析纯。 3.2.1 乙腈：液相色谱专用。 3.2.2 偏磷酸 (H3PO3)。 3.2.3 10% 偏磷酸水溶液：称取 10g 偏磷酸 (H3PO3) 溶于水中，用水稀释定容至 100mL。 3.2.4 磷酸二氢钾 (KH2PO4)。 3.2.5 0.03 mol/L 磷酸二氢钾水溶液：称取 4.0824g 磷酸二氢钾 (KH2PO4) 溶于水中，用水稀释定容至 100mL。 3.2.6 维生素B6标准品：吡哆醇，生物标准品，纯度大于 99%。 3.2.7 维生素B6标准储备液：称取 100mg 维生素B6 溶于水中，用水稀释定容至 100mL。该液 1mL 相当于 1mg 维生素B6。保存于 4℃ 冰箱中。 3.2.8 维生素B6标准工作液：吸取维生素B6标准储备液 1.0mL，用水稀释定容至 100mL。该液 1mL 相当于 10μg 维生素B6。保存于 4℃ 冰箱中。 3.3 仪器和设备 3.3.1 高效液相色谱仪，配有荧光检测器。 3.3.2 旋涡混匀器或超声波提取仪。 3.3.3 离心机。 3.3.4 50mL 容量瓶。 3.3.5 微量进样器，10μL。 3.4 测定步骤 3.4.1 样品处理 准确称取有代表性的均匀样品约 0.5g（精确到 0.0001g），于 50mL 容量瓶中，加 25mL 10% 偏磷酸，在旋涡混匀器或超声波提取器上提取 5min，用水稀释定容至刻度，摇匀。取部分溶液离心。取上清液用水稀释至适当浓度，作高效液相色谱测定用。 3.4.2 液相色谱测定 3.4.2.1 液相色谱条件 a) 色谱柱：ODS-C18 柱 (4.0mm × 250mm)。 b) 流动相：0.03 mol/L 磷酸二氢钾/乙腈 (80:20，以稀磷酸调至 pH 2.3)。 c) 流速：1.0 mL/min。 d) 检测器：荧光检测器，Ex 290 nm, Em 390 nm。 3.4.2.2 维生素B6色谱图 图1 维生素B6色谱图 3.4.2.3 色谱测定