SN/T 3440-2012
基本信息
标准号： SN/T 3440-2012
中文名称：烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3440-2012.Detection and identification of tobacco rattle virus.
1范围
SN/T 3440规定了烟草脆裂病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、鉴别寄主反应和免疫电镜四种检测和鉴定方法。
SN/T 3440适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中烟草脆裂病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3原理
3.1烟草脆裂病毒基本信息
中文名:烟草脆裂病毒
学名:tobacco rattle virus
缩写:TRV
分类地位:烟草脆裂病毒属(tobravirus)
烟草脆裂病毒的其他信息参见附录A。
3.2检疫鉴定依据
烟草脆裂病毒的粒子形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据,采用DAS-ELISA、RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。
4仪器、设施、用具和试剂
4.1 仪器
PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000 g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器等。
1范围
SN/T 3440规定了烟草脆裂病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、鉴别寄主反应和免疫电镜四种检测和鉴定方法。
SN/T 3440适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中烟草脆裂病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1840植物病毒 免疫电镜检测方法
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3原理
3.1烟草脆裂病毒基本信息
中文名:烟草脆裂病毒
学名:tobacco rattle virus
缩写:TRV
分类地位:烟草脆裂病毒属(tobravirus)
烟草脆裂病毒的其他信息参见附录A。
3.2检疫鉴定依据
烟草脆裂病毒的粒子形态特征、为害症状、血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据,采用DAS-ELISA、RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。
4仪器、设施、用具和试剂
4.1 仪器
PCR仪、酶标仪、电子天平(1/1000 g)、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、-80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器等。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3440—2012
烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of tobacco rattle virus2012-12-12发布bzxz.net
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
屋盘直房
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3440-2012
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于翠、杨翠云、冯藜霞、李桂芬、廖富荣、戚龙君。范围
烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
SN/T3440--2012
本标准规定了烟草脆裂病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、鉴别寄主反应和免疫电镜四种检测和鉴定方法。
本标准适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中烟草脆裂病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
3.1烟草脆裂病毒基本信息
中文名：烟草脆裂病毒
学名：tobacco rattlevirus
缩写：TRV
分类地位：烟草脆裂病毒属（tobravirus）烟草脆裂病毒的其他信息参见附录A。3.2检疫鉴定依据
烟草脆裂病毒的粒子形态特征、为害症状，血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据，采用DAS-ELISA、RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。4
仪器、设施、用具和试剂
4.1仪器
PCR仪、酶标仪、电子天平（1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器等。4.2设施
隔离检疫温室（10℃～30℃）。4.3用具
可调式微量移液器（2L、10μL、100uL、200uL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无SN/T3440-2012
RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、镊子、放大镜等。4.4试剂
TRV抗体、Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇（75%）、β-巯基乙醇、AMV反转录酶、TagDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B。5症状观察及抽样
5.1症状观察
现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状，TRV为害症状描述参见附录A。5.2抽样
取有疑似病毒症状的植物的不同部位如叶校等分别进行单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，则按SN/T2122中规定进行抽样、并送实验室检疫鉴定。6检测鉴定方法
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶研磨，并按植物组织重量和抽提缓冲液1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，低速离心后吸取上清液待用于ELISA检测。具体检测步骤见附录C。
6.2RT-PCR检测
样品用液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA。/RT-PC具体操作步骤见附录D。6.3鉴别寄主接种
在裁种于隔离检疫温室中的鉴别舒主植物真叶长出后用于摩擦接种。将可疑样品加人适量接种缓冲液研磨成汁液后用于接种。当住意-种鉴别寄主出现如下描述症状时，判定带有TRV。色藜（Chenopodiumamarantiilor）或昆诺蔡（C.qui些有扩散趋势，绝大多数分离物是局部侵染。oa）部坏死斑在3d～5d即可形成，有黄瓜（Cucumissatiuus）：褪绿或局部坏死斑，非系统性侵染。烟草（NicotianatabacumcvSamsunNN）：在接种叶片中典型症状是坏死斑或坏死环，以及系统性的扭曲和坏死，然而，症状也同时受到环境条件的影响，一些病株产生症状或根本就不产生症状。菜豆（Phaseolusuulgaris）：2d～4d可形成局部坏死斑，非系统性侵染。6.4免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为20nm～23nm，长度在78nm~114nm或185nm197nm的刚直杆状病毒粒子，判定免疫电镜结果阳性。7结果判定
7.16.1、6.2、6.3和6.4中两项或两项以上结果为阳性，可判定该样品烟草脆裂病毒阳性。2
SN/T3440—2012
7.2样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带烟草脆裂病毒。7.3如果RT-PCR结果阳性，且序列测定分析结果证实为烟草脆裂病毒，可判定样品携带烟草脆裂病毒。
7.4样品经DAS-ELISA阳性，而RT-PCR检测结果为阴性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带烟草脆裂病毒。7.5样品经DAS-ELISA阴性，而RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带烟草脆裂病毒。8样品与记录结果保存
8.1经检测确定携带烟草脆裂病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。种子类样品在干燥条件下保存6个月，其他繁殖材料发现烟草脆裂病毒的采病叶经液氮干燥后在一20℃下保存。做好登记和标记工作。
8.2记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据。SN/T3440—2012
A.1寄主范围和症状
附录A
（资料性附录）
烟草脆裂病毒相关资料
TRV寄主范围很广，超过50个科400种双子叶和单子叶植物易受侵染。自然条件下能侵染郁金香、风信子、黄水仙、一串红、旱金莲、矮牵牛、番茄、黄瓜、芜荽、茄子、向日葵、马铃薯、萝卜、豌豆、菠菜、罗勒、烟草、大豆、甜菜等花卉、蔬菜及其他经济作物。侵染甜菜、菠菜等引起褪绿、局部坏色斑和系统斑驳；侵染马铃薯等产生局部坏死斑或坏死条纹；侵染烟草等引起局部坏死，坏死或褪绿环斑，系统坏死，条纹或斑驳；侵染风信子和黄水仙等则产生斑驳症状诊断寄主为苋色藜、黄瓜、烟草和菜豆。A.2分布地区
欧洲：奥地利，比利时，白俄罗斯，保加利亚，捷克，斯洛伐克，丹麦，芬兰，南斯拉夫，法国，德国，希腊，匈牙利，爱尔兰，意大利，拉脱维亚，立陶宛，马其顿，摩尔多瓦，荷兰，挪威，波兰，俄罗斯，塞尔维亚及黑山，瑞典，瑞士，英国。
亚洲孟加拉，中国（福建，河北，江苏，云南），印度，以色列，日本，韩国，乌兹别克斯坦。非洲：南非，埃及，突尼斯。
美洲：美国，加拿大，巴西，古巴。大洋洲：澳大利亚，新西兰。
A.3传播方式
A.3.1介体传播
自然界中主要通过拟毛刺线虫和毛刺线虫传播，病毒在线虫体内能持久存留，但虫体蜕皮后即不再带毒。A.3.2种子传毒
汁液、种子或冤丝子也能传播。A.4粒体形态
病毒粒子为刚直杆状，无包膜，直径20nm～23nm，有两种典型长度，分别为78nm～114nm和185nm~197nm.
5基因组
TRV基因组为二分体基因组，RNA的3'端无Poly(A)，5\端有-个序列为m7G5pPp5\Ap的甲基化核苷酸帽子结构。基因组RNA1的编码4个非结构蛋白，包括参与复制和在植物体内系统扩散的蛋白，RNA2编码22kDa～24kDa的外壳蛋白。4
B.110×PBST缓冲液(pH7.4)
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH2PO4）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI)
吐温-20（Tween-20）
附录B
（规范性附录）
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至7.4，并定容至1000mL。B.2样品抽提缓冲液（pH7.4)
亚硫酸钠（NazSO）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
叠氮化钠（NaN.）
吐温-20（Tween-20)
溶于900mL的1XPBST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000mL。B.3包被抗体缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCOa）
溶解于900mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.6，并定容至1000mL。B.4酶标抗体缓冲液（pH7.4）
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
用无菌蒸馏水定容至1000mL。
B.5底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）二乙醇胺
叠氮化钠（NaN）
SN/T3440-2012
溶解于600mL的无菌蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.8，然后用蒸馏水定容至1000mL。5
SN/T3440--2012
反应终止液
氢氧化钠（NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中，浓度3mol/L。电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸
0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA）用时加蒸馏水稀释至1XTAE。
C.1检测
附录C
（规范性附录）
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）SN/T3440--2012
C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。C.1.2每孔加人100uL的TRV的包被抗体溶液，封口膜包好，37孵育2h～4h（或4℃冰箱过夜）。
C.1.3将酶联板孔中溶液控干，用200μL的1XPBST洗涤液洗涤酶联板3次，每次3min，然后在干净毛巾或滤纸上扣干。
C.1.4将100μL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中，对照孔中也各加人100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好，37.℃孵育2h～3h或4℃冰箱过夜）。C.1.5洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.6用酶标抗体稀释缓冲液按要求稀释酶标抗体，每孔加人100L酶标抗体溶液，封口膜包好，并于37℃孵育2h～4h。
C.1.7洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为mg/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液，室温孵育0.5h2h。必要时每孔加人50L的3m61/L氢氧化钠溶液终止反应。C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值屏记录。C.2结果判定
C.2.1质量控制要求：缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于6.15阴性对照孔的OD405值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，孔的重复惟以样品@D值的平行允许率控制，按照式(C.1)进行计算：
P=(OD:PSDD× 1/2×100%
式中：
平行允许率，%；
重复样品1OD值；
OD，—重复样品2OD值。
当重复检测样品OD值平行允许率（P)小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。C.2.3在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定：一样品OD405/阴性对照OD405值明显大于2，结果判定为阳性：(c.1)
一样品OD405/阴性对照OD405值在阅值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证：
样品OD40/阴性对照ODa05值明显小于2.判为阴性。7
SN/T3440—2012
D.1植物总RNA提取
附录D
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
D.1.1样品用液氮研细，取0.1g加人1mLTrizol,混匀，倒人1.5ml离心管中。D.1.2加入0.2mL三氯甲烷，猛烈振荡15s，4℃11000r/min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中。
D.1.3加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置10min，4℃12000r/min离心15min，保留沉淀。D.1.4加人1mL75%冷乙醇，悬浮沉淀，4℃8000r/min离心10min，干燥沉淀。D.1.5加人30uLDEPC-HzO，溶解沉淀（必要时，55℃~60℃水浴10min，加速溶解），存于-80℃备用。
注：也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作。D.2引物序列
上游物TRV-F：5'-ATGGGTGACATGTACGATG-3”下游弓物TRV-R：5\-GAGGCGTCATCGAATTTGT-3预计扩增片段长度为450bp。
D.3反转录
利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。首先加人3μL模板RNA，1ul.下游引物（20μmol/L），8uLH.O混合后70℃温育5min；立即置于冰上，2min后加人4ulAMV缓冲液，1μLdNTP(10mmol/L），1μLAMV反转录酶（10U/uL），1μLRNA酶抑制剂（40U/uL），42℃反应1h。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。注：如不立即进行PCR扩增，应将逆转录产物置于一20℃保存。D.4核酸扩增
D.4.1PCR反应体系
反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以合烟草脆裂病毒材料的cDNA或含有烟草脆裂病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。表D.1RT-PCR反应体系
PCR缓冲液
储存液浓度
2.5mmol/L
终浓度
200μmol/L
加样量
上游引物
下游引物
无菌水
总体积
PCR反应循环参数
储存液浓度
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
表D.1（续）
终浓度
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.05U/μL
SN/T3440-2012
加样量
25 μL
普通PCR反应参数见表D.2，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。表D.2
94℃4min
D.4.3PCR扩增产物的电泳检测
扩增条件
普通RT-PCR反应参数
循环次数
94℃,30s
52℃,45s
72℃,45s
72℃.10min
用电泳缓冲液配制2.0%的琼脂糖凝胶（55℃～60℃时加人溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml，也可在电泳后进行染色）。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9μLPCR扩增产物。加1μL10×上样缓冲液上样。恒压5V/cm～6V/cm电泳40min～50min。凝胶成像系统中观察电泳结果，拍照并记录结果。
结果判定
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品未出现预期大小的条带，则判定结果为阴性。
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品出现预期大小条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列分析证实为烟草脆裂病毒，则判定结果为阳性，若序列分析结果表明不是烟草脆裂病毒，则判定为阴性。9
SN/T3440-2012
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
SN/T3440—2012
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)64275323
网址spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1字数20千字2013年6月第一版2013年6月第一次印刷印数11600
书号：155066·2-25290
定价18.00元
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烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of tobacco rattle virus2012-12-12发布bzxz.net
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
屋盘直房
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3440-2012
本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局。本标准主要起草人：于翠、杨翠云、冯藜霞、李桂芬、廖富荣、戚龙君。范围
烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
SN/T3440--2012
本标准规定了烟草脆裂病毒的DAS-ELISA、RT-PCR、鉴别寄主反应和免疫电镜四种检测和鉴定方法。
本标准适用于进出境活体植物材料，包括无性繁殖材料、组培苗、种子和苗木中烟草脆裂病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1840植物病毒免疫电镜检测方法SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3原理
3.1烟草脆裂病毒基本信息
中文名：烟草脆裂病毒
学名：tobacco rattlevirus
缩写：TRV
分类地位：烟草脆裂病毒属（tobravirus）烟草脆裂病毒的其他信息参见附录A。3.2检疫鉴定依据
烟草脆裂病毒的粒子形态特征、为害症状，血清学特性和分子生物学特征是检疫鉴定该病毒的主要依据，采用DAS-ELISA、RT-PCR、免疫电镜和鉴别寄主反应等方法进行检疫鉴定。4
仪器、设施、用具和试剂
4.1仪器
PCR仪、酶标仪、电子天平（1/1000g）、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、电子透射显微镜、水浴锅、高速冷冻离心机、一80℃超低温冰箱、高压灭菌锅、制冰机、微波炉、涡旋振荡器等。4.2设施
隔离检疫温室（10℃～30℃）。4.3用具
可调式微量移液器（2L、10μL、100uL、200uL、1000μL、5000μL）及相应的无RNase吸头、无SN/T3440-2012
RNase离心管、PCR管、研钵、样品袋、标签、镊子、放大镜等。4.4试剂
TRV抗体、Trizol、焦碳酸二乙酯（DEPC）、液氮、三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇（75%）、β-巯基乙醇、AMV反转录酶、TagDNA聚合酶、DNA分子标记、溴化乙锭、琼脂糖、溴酚蓝等。除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯。血清学和分子生物学检测试剂配制见附录B。5症状观察及抽样
5.1症状观察
现场检疫主要观察植物材料上病毒为害的症状，TRV为害症状描述参见附录A。5.2抽样
取有疑似病毒症状的植物的不同部位如叶校等分别进行单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，则按SN/T2122中规定进行抽样、并送实验室检疫鉴定。6检测鉴定方法
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）对种苗叶片或由种子催生长出的第一对真叶研磨，并按植物组织重量和抽提缓冲液1：10的比例稀释，制备的汁液分别盛装于离心管中，低速离心后吸取上清液待用于ELISA检测。具体检测步骤见附录C。
6.2RT-PCR检测
样品用液氮研细，取0.1g用于提取植物总RNA。/RT-PC具体操作步骤见附录D。6.3鉴别寄主接种
在裁种于隔离检疫温室中的鉴别舒主植物真叶长出后用于摩擦接种。将可疑样品加人适量接种缓冲液研磨成汁液后用于接种。当住意-种鉴别寄主出现如下描述症状时，判定带有TRV。色藜（Chenopodiumamarantiilor）或昆诺蔡（C.qui些有扩散趋势，绝大多数分离物是局部侵染。oa）部坏死斑在3d～5d即可形成，有黄瓜（Cucumissatiuus）：褪绿或局部坏死斑，非系统性侵染。烟草（NicotianatabacumcvSamsunNN）：在接种叶片中典型症状是坏死斑或坏死环，以及系统性的扭曲和坏死，然而，症状也同时受到环境条件的影响，一些病株产生症状或根本就不产生症状。菜豆（Phaseolusuulgaris）：2d～4d可形成局部坏死斑，非系统性侵染。6.4免疫电镜检测
按照SN/T1840中的方法进行电镜观察。如观察到直径为20nm～23nm，长度在78nm~114nm或185nm197nm的刚直杆状病毒粒子，判定免疫电镜结果阳性。7结果判定
7.16.1、6.2、6.3和6.4中两项或两项以上结果为阳性，可判定该样品烟草脆裂病毒阳性。2
SN/T3440—2012
7.2样品经DAS-ELISA或者RT-PCR检测结果为阴性，判定该样品不携带烟草脆裂病毒。7.3如果RT-PCR结果阳性，且序列测定分析结果证实为烟草脆裂病毒，可判定样品携带烟草脆裂病毒。
7.4样品经DAS-ELISA阳性，而RT-PCR检测结果为阴性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带烟草脆裂病毒。7.5样品经DAS-ELISA阴性，而RT-PCR检测结果为阳性，经免疫电镜观察到病毒颗粒或者接种鉴别寄主植物出现相应的症状时，可判定样品携带烟草脆裂病毒。8样品与记录结果保存
8.1经检测确定携带烟草脆裂病毒的样品应保存在适合的条件下以备复核。种子类样品在干燥条件下保存6个月，其他繁殖材料发现烟草脆裂病毒的采病叶经液氮干燥后在一20℃下保存。做好登记和标记工作。
8.2记录包括：样品来源、种类、取样人员、实验的时间、地点、方法和结果、检验检疫员的签字等。酶联免疫吸附测定法检测应有酶联板反应的数值，生物学测定应有鉴别寄主的症状照片，RT-PCR检测应有电泳结果照片及序列测定分析数据。SN/T3440—2012
A.1寄主范围和症状
附录A
（资料性附录）
烟草脆裂病毒相关资料
TRV寄主范围很广，超过50个科400种双子叶和单子叶植物易受侵染。自然条件下能侵染郁金香、风信子、黄水仙、一串红、旱金莲、矮牵牛、番茄、黄瓜、芜荽、茄子、向日葵、马铃薯、萝卜、豌豆、菠菜、罗勒、烟草、大豆、甜菜等花卉、蔬菜及其他经济作物。侵染甜菜、菠菜等引起褪绿、局部坏色斑和系统斑驳；侵染马铃薯等产生局部坏死斑或坏死条纹；侵染烟草等引起局部坏死，坏死或褪绿环斑，系统坏死，条纹或斑驳；侵染风信子和黄水仙等则产生斑驳症状诊断寄主为苋色藜、黄瓜、烟草和菜豆。A.2分布地区
欧洲：奥地利，比利时，白俄罗斯，保加利亚，捷克，斯洛伐克，丹麦，芬兰，南斯拉夫，法国，德国，希腊，匈牙利，爱尔兰，意大利，拉脱维亚，立陶宛，马其顿，摩尔多瓦，荷兰，挪威，波兰，俄罗斯，塞尔维亚及黑山，瑞典，瑞士，英国。
亚洲孟加拉，中国（福建，河北，江苏，云南），印度，以色列，日本，韩国，乌兹别克斯坦。非洲：南非，埃及，突尼斯。
美洲：美国，加拿大，巴西，古巴。大洋洲：澳大利亚，新西兰。
A.3传播方式
A.3.1介体传播
自然界中主要通过拟毛刺线虫和毛刺线虫传播，病毒在线虫体内能持久存留，但虫体蜕皮后即不再带毒。A.3.2种子传毒
汁液、种子或冤丝子也能传播。A.4粒体形态
病毒粒子为刚直杆状，无包膜，直径20nm～23nm，有两种典型长度，分别为78nm～114nm和185nm~197nm.
5基因组
TRV基因组为二分体基因组，RNA的3'端无Poly(A)，5\端有-个序列为m7G5pPp5\Ap的甲基化核苷酸帽子结构。基因组RNA1的编码4个非结构蛋白，包括参与复制和在植物体内系统扩散的蛋白，RNA2编码22kDa～24kDa的外壳蛋白。4
B.110×PBST缓冲液(pH7.4)
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH2PO4）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI)
吐温-20（Tween-20）
附录B
（规范性附录）
试剂配制
溶于900mL的蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至7.4，并定容至1000mL。B.2样品抽提缓冲液（pH7.4)
亚硫酸钠（NazSO）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
叠氮化钠（NaN.）
吐温-20（Tween-20)
溶于900mL的1XPBST中，用HCl调节pH至7.4，定容至1000mL。B.3包被抗体缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NaCO）
碳酸氢钠（NaHCOa）
溶解于900mL蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.6，并定容至1000mL。B.4酶标抗体缓冲液（pH7.4）
1XPBST缓冲液
牛血清白蛋白（BSA）
聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）
用无菌蒸馏水定容至1000mL。
B.5底物（pNPP）缓冲液（pH9.8）二乙醇胺
叠氮化钠（NaN）
SN/T3440-2012
溶解于600mL的无菌蒸馏水中，用浓盐酸（HCI)调节pH至9.8，然后用蒸馏水定容至1000mL。5
SN/T3440--2012
反应终止液
氢氧化钠（NaOH)120g溶于1000mL的无菌蒸馏水中，浓度3mol/L。电泳缓冲液TAE（50×）
三羟甲基氨基甲烷(Tris)
冰乙酸
0.5mol/L乙二胺四乙酸钠（EDTA）用时加蒸馏水稀释至1XTAE。
C.1检测
附录C
（规范性附录）
双抗体酶联免疫吸附测定方法（DAS-ELISA）SN/T3440--2012
C.1.1根据检测需要将适量的孔条放于酶联板架上，包括2个阳性对照孔，2个阴性对照孔，2个空白对照孔和多个待检测样品孔。待测样品孔重复两次。C.1.2每孔加人100uL的TRV的包被抗体溶液，封口膜包好，37孵育2h～4h（或4℃冰箱过夜）。
C.1.3将酶联板孔中溶液控干，用200μL的1XPBST洗涤液洗涤酶联板3次，每次3min，然后在干净毛巾或滤纸上扣干。
C.1.4将100μL制备的待测样品溶液加入到设计的待检测孔中，对照孔中也各加人100μL相应的阴性对照、阳性对照和空白对照。封口膜包好，37.℃孵育2h～3h或4℃冰箱过夜）。C.1.5洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.6用酶标抗体稀释缓冲液按要求稀释酶标抗体，每孔加人100L酶标抗体溶液，封口膜包好，并于37℃孵育2h～4h。
C.1.7洗涤，步骤同C.1.3。
C.1.8将pNPP溶于底物缓冲液中，使最终浓度为mg/mL。每孔加人100μL配好的底物溶液，室温孵育0.5h2h。必要时每孔加人50L的3m61/L氢氧化钠溶液终止反应。C.1.9酶标仪405nm波长下检测各孔的吸收值屏记录。C.2结果判定
C.2.1质量控制要求：缓冲液孔和阴性对照孔的OD值小于6.15阴性对照孔的OD405值小于0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，孔的重复惟以样品@D值的平行允许率控制，按照式(C.1)进行计算：
P=(OD:PSDD× 1/2×100%
式中：
平行允许率，%；
重复样品1OD值；
OD，—重复样品2OD值。
当重复检测样品OD值平行允许率（P)小于20%时，判定检测结果有效。C.2.2若满足不了C.2.1的质量要求，则不能进行结果判定。C.2.3在满足了C.2.1的质量要求后，则按如下原则作出判定：一样品OD405/阴性对照OD405值明显大于2，结果判定为阳性：(c.1)
一样品OD405/阴性对照OD405值在阅值附近，判为可疑样品，需重做一次或者用其他方法进行验证：
样品OD40/阴性对照ODa05值明显小于2.判为阴性。7
SN/T3440—2012
D.1植物总RNA提取
附录D
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
D.1.1样品用液氮研细，取0.1g加人1mLTrizol,混匀，倒人1.5ml离心管中。D.1.2加入0.2mL三氯甲烷，猛烈振荡15s，4℃11000r/min离心10min，小心吸取上层无色水相到新离心管中。
D.1.3加入等体积异丙醇，混匀，-20℃静置10min，4℃12000r/min离心15min，保留沉淀。D.1.4加人1mL75%冷乙醇，悬浮沉淀，4℃8000r/min离心10min，干燥沉淀。D.1.5加人30uLDEPC-HzO，溶解沉淀（必要时，55℃~60℃水浴10min，加速溶解），存于-80℃备用。
注：也可按照商品RNA提取试剂盒进行操作。D.2引物序列
上游物TRV-F：5'-ATGGGTGACATGTACGATG-3”下游弓物TRV-R：5\-GAGGCGTCATCGAATTTGT-3预计扩增片段长度为450bp。
D.3反转录
利用提取的RNA在PCR管中进行反转录。首先加人3μL模板RNA，1ul.下游引物（20μmol/L），8uLH.O混合后70℃温育5min；立即置于冰上，2min后加人4ulAMV缓冲液，1μLdNTP(10mmol/L），1μLAMV反转录酶（10U/uL），1μLRNA酶抑制剂（40U/uL），42℃反应1h。也可采用RT-PCR一步法试剂盒，操作步骤按使用说明进行。注：如不立即进行PCR扩增，应将逆转录产物置于一20℃保存。D.4核酸扩增
D.4.1PCR反应体系
反应体系见表D.1，每个样品设2个平行处理。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。检测时以合烟草脆裂病毒材料的cDNA或含有烟草脆裂病毒目标片断的质粒作为阳性对照，以健康植物材料作为阴性对照，以水代替模板作为空白对照。表D.1RT-PCR反应体系
PCR缓冲液
储存液浓度
2.5mmol/L
终浓度
200μmol/L
加样量
上游引物
下游引物
无菌水
总体积
PCR反应循环参数
储存液浓度
10μmol/L
10μmol/L
5U/μL
表D.1（续）
终浓度
0.2μmol/L
0.2μmol/L
0.05U/μL
SN/T3440-2012
加样量
25 μL
普通PCR反应参数见表D.2，不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。表D.2
94℃4min
D.4.3PCR扩增产物的电泳检测
扩增条件
普通RT-PCR反应参数
循环次数
94℃,30s
52℃,45s
72℃,45s
72℃.10min
用电泳缓冲液配制2.0%的琼脂糖凝胶（55℃～60℃时加人溴化乙锭至终浓度为0.5μg/ml，也可在电泳后进行染色）。在电泳槽中加人电泳缓冲液，使液面刚刚没过凝胶。将9μLPCR扩增产物。加1μL10×上样缓冲液上样。恒压5V/cm～6V/cm电泳40min～50min。凝胶成像系统中观察电泳结果，拍照并记录结果。
结果判定
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品未出现预期大小的条带，则判定结果为阴性。
如果阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的条带，样品出现预期大小条带，可通过测序的方式进一步确认。如果PCR产物序列分析证实为烟草脆裂病毒，则判定结果为阳性，若序列分析结果表明不是烟草脆裂病毒，则判定为阴性。9
SN/T3440-2012
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
烟草脆裂病毒检疫鉴定方法
SN/T3440—2012
中国标准出版社出版
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中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷*
开本880×12301/16印张1字数20千字2013年6月第一版2013年6月第一次印刷印数11600
书号：155066·2-25290
定价18.00元
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