SN/T 3436-2012
基本信息
标准号： SN/T 3436-2012
中文名称：藜草花叶病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3436-2012.Detection and identification of sowbane mosaic virus.
1范围
SN/T 3436规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。
SN/T 3436适用于可能带有藜草花叶病毒的植物的种子、苗木及植物产品的检疫鉴定。
2原理
学名:sowbane mosaic virus
缩写:SoMV
分类地位:南方菜豆花叶病毒属(sobemovirus)成员。
抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。
详细资料参见附录A。
3仪器、设备与试剂
3. 1仪器设备和用具
微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001 g)、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、可调移液器(1000μL、200μL、20μL、2μL)、96孔酶标板、研钵等;防虫温室。
3.2试剂
主要试剂和缓冲液见附录B和附录C.
4检测样品的制备
4.1种子样 品制备
挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中,待长出3~4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号,采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。
4.2苗木
有症状(如叶片畸形、花叶、斑驳等)的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同4.1。
1范围
SN/T 3436规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。
SN/T 3436适用于可能带有藜草花叶病毒的植物的种子、苗木及植物产品的检疫鉴定。
2原理
学名:sowbane mosaic virus
缩写:SoMV
分类地位:南方菜豆花叶病毒属(sobemovirus)成员。
抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据。
详细资料参见附录A。
3仪器、设备与试剂
3. 1仪器设备和用具
微量研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001 g)、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、可调移液器(1000μL、200μL、20μL、2μL)、96孔酶标板、研钵等;防虫温室。
3.2试剂
主要试剂和缓冲液见附录B和附录C.
4检测样品的制备
4.1种子样 品制备
挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中,待长出3~4片叶后将表现症状的植株编号,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号,采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。
4.2苗木
有症状(如叶片畸形、花叶、斑驳等)的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同4.1。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3436-2012
藜草花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of sowbane mosaic virus2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3436—2012
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈青、李桂芬、黄峰、陈红运、廖富荣、林石明。1范围
藜草花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。SN/T3436—2012
本标准适用于可能带有黎草花叶病毒的植物的种子，苗术及植物产品的检疫鉴定。2原理
学名：sowbane mosaic virus
缩写：SoMV
分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）成员。抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据详细资料参见附录A。
3仪器、设备与试剂wwW.bzxz.Net
3.1仪器设备和用具
微量研磨仪、酶标仪，洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪，电泳仪.水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、可调移液器（1000μL、200μL20μL、2μL）、96孔酶标板、研钵等；防虫温室。
3.2试剂
主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。4检测样品的制备
4.1种子样品制备
挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中，待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。4.2苗木
有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等)的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同4.1。
4.3植物产品
植物产品有症状的部分（如：叶片畸形、花叶、斑驳等）单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样，分组编号，分组方法和检测方法同4.1。SN/T3436—2012
5检测与鉴定
5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被SoMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了SoMV的植物组织作阳性对照），样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。5.2RT-PCR检测
开MPGR
这转零合成A高进
分别提取样品和对照的总RNA
照，感染SoMV的植物组织作阳性对想用纯兆修真过6结果判定
如果2种方法检测结果为阳性，即可弹该进RT-PCR检测为阳性即可判断为样品尊#！行生物接种试验。
7结果记录与样品保存
7.1结果记录
完整的实验记录包括：样品的来，游类、时间
增。健康的植物组织作阴性对
体见附录C。
品带藜草花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，种接检测，出现阳性结果时，需进去验的时间
实验人员的签字。酶联测定需有酶威度的原给据7.2样品保存
地点防法和结果等，并要有经手人和PCR检测需有电泳结果照片。
经检验确定携带SoMV的样品战庭适系解手保存，种子者一80℃冰箱中，做好标记和登记维2
℃，病叶冻干保存在20℃或
A。1藜草花叶病毒学名和分类地位学名：sowbanemosaicvirus
缩写：SoMV
附录A
（资料性附录）
藜草花叶病毒相关资料
分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）成员A.2抗原特性
SoMV抗原性强。
A.3粒体形态
藜草花叶病毒粒体为球形，直径约为39nm。A.4基因组
SN/T3436—2012
该病毒粒体包含20%核酸和80%的蛋白，基因组为ssRNA，长4.2kb，含有26%的G，23.2%的us病毒基因组为单分体基因组，病毒RNA的3\端既无poly-AA，27.2%的C,23.2%的U.Sobem
结构，也无tRNA结构，其RNA的5端有十个VP，可能是侵染所必需的A.5寄主范围
藜草花叶病毒寄主范围有限，自然寄主为藜科（Chepopodiaceae）植物，但是欧洲也发现很多果树和葡萄也感染藜草花叶病毒。有实验证明葡萄的分离物可经实验方法侵染其他科植物。A.6病害症状
昆诺藜：系统侵染，叶片斑驳、褪绿斑点，畸形，植株矮化。苋色藜：系统侵染，叶片斑驳、褪绿斑点，畸形，植株矮化。菠菜：系统隐症侵染。
墙生藜：斑驳。
甜菜：局部隐症侵染。
A.7分布
SoMV是1952年在加利福尼亚河边甜菜田里墙生藜（Chenopodiummurale）上首次发现的，目前SoMV广泛分布于南美、中美、北美、南非、澳大利亚、保加利亚、加拿大、前捷克斯洛伐克、意大利、日本、3
SN/T3436—2012
美国和前南斯拉夫南。
A.8传播途径
SoMV具有高度的传染性，易于机械传播，在温室中极易污染用作指示植物的科植物。可以通过汁液传播、昆虫传播和花粉、种子传播，可通过豌豆潜叶蝇、蚜虫、叶蝉等昆虫介体非持久性传毒；通过墙生藜（Chenopodiummurale）种传，种传率可高达7o%，也可通过昆诺藜及（Atriplerpacifica）和灰藜种传，在昆诺藜上的种传率高达60%，SoMV还可通过菠菜（Spinaciaoleracea）种子传播，病株上的花通过粉或者表面污染病毒的花粉都可作为侵染源。B.1试材
B.1.1酶联板。
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
包被抗体：特异性的藜草花叶病毒抗体。B.1.3酶标抗体：碱性磷酸酯酶标记的藜草花叶病毒抗体。B.1.4
底物：对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。B.1.5
PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）Nacl
吐温-20
蒸馏水定容至1L。
B.1.6样品抽提缓冲液（pH7.4）NaSO
PVP（MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存。
B.1.7包被缓冲液（pH9.6)
NaHCOs
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）BSA(牛血清白蛋白）或脱脂奶粉PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)MgCl2
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馅水定容至1L，4℃储存。B.2程序
B.2.1包被抗体
SN/T3436—2012
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100uL/孔，37℃孵育4h，清空孔中溶液，5
SN/T3436-—2012
PBST洗涤3次。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7500g离心10min，上清液即为制备好的待测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行；空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔（或48孔）酶联板，包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100μ洗涤3次。
B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释孵育2h，PBST洗涤3次。
B.2.5加底物
将底物bNPP加人到底物缓冲液
板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
用酶标仪在30min、1h和2h于
注：实际检测时，解育温度，PBST洗漆B.3结果判定
B.3.1对照孔的OD405值（缓冲液阴性对照孔的OD405值阳性对照OD405值/阴性对照
同一样品的OD405值应基本
处读？
色读数
中照孔），店
B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原费上可判定如下
样品OD405值/阴性对照OD405值>2，判为阳性：箱孵育过夜，酶联板用PBST
加人到酶联板中，100uL/孔，37℃)，按100μl/孔，加人到酶联
试剂盒中说明书的规定执行。
质量控制范围内，即：
一样品OD405值/阴性对照OD405值接近阈值，判为可疑样品，需重做一一次或用其他方法验证：一样品OD值/阴性对照OD值<2.判为阴性B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。6
c.1试剂
C.1.1RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
Trizol裂解液、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇。C.1.2
反转录试剂
SN/T3436-2012
M-MLV反转录酶（200U/μL)、5X反转录缓冲液aNTP(10mmerl/L)、RNasin(40U/μL)、DEPC处理过的ddH2O。
C.1.3PCR试剂
10XPCR缓冲液、dNTP(10mml/L)、Tag酶（5U/μL）C.1.4
电泳试剂
50XTAE
冰醋酸
NazEDTA·2H,0
加去离子水定容至1L。
用时加水稀释
6×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝
40%（质量浓度）蔗糖水溶液
实验步骤
C.2.1总RNA提取
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3min;4℃，12000g离心10min，取上清液；加人200uL三氯甲烷，上下颠倒混勾，室温静止3min；4℃，12000g离心10min，取上层水相；加等体积的异丙醇，颠倒混勾；4℃，12000g离心10min，弃上清液：加1ml75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30μL经DEPC（焦炭酸二乙酯）处理的ddHzO，一20℃保存备用。C.2.2RT-PCR反应
C.2.2.1引物与产物
RT-PCR检测引物见表C.1。
SN/T3436--2012
引物名称
SoMVCP510f
SoMVCP510r
C.2.3cDNA合成
表C.1PCR引物序列、产物
序列（5\-3\）
TGTTATGGGCAGGGCTATG
TGTAAATCGCAAGGGCAG
扩增产物
反转录总体系为12.5μuL。在PCR管中依次加人3uL总RNA，1μLSoMV下游引物（CP510r，浓度为20pmol/uL），在65℃温浴7min，然后，冰浴5min，瞬时离心，再向PCR管中加人下列试剂：MMLVRT(200U/μL)0.5μL.5XRT缓冲液2.5μL、dNTP(10mmoL/L)0.5μL、RNasin(40U/μl)0.5μL、DEPC处理的ddHzO4.5μl。反应参数：37℃60min，95℃10min。合成的cDNA于-20℃冰箱保存备用。
C.2.4PCR扩增
PCR反应体系见表C.2。反应参数：95℃5min95℃30s，54℃45s.72℃45s，35个循环72℃10min。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。表C.2PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液
dNTP(10 mmol/L)
SoMVCP510f(20pmol/μL)
SoMV CP510r(20pmol/μL)
Taq酶(5U/μL)
cDNA模板
琼脂糖电泳
制备凝胶
加样量
补足反应总体积至25μl
将1×TAE和电泳级琼脂糖按1.5%（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。C.2.5.2加溴化乙锭(EB)
加人溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，混勾，倒人已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加人足够量的TAE(缓冲液没过凝胶表面约1mm）。C.2.5.3加样
用5μl.样品PCR产物与加样缓冲液（6X）按规定比例混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加人到琼脂糖凝胶孔中。C.2.5.4电泳
SN/T3436--2012
接通电源，电压120V下使DNA向阳极移动。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。5结果判断
阳性对照在510bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，如果样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性；如果样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。9
SN/T3436-2012
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
藜草花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T3436--2012
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)64275323
网址：spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张1字数20千字
2013年6月第一版
2013年6月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-25286
定价18.00元
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藜草花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of sowbane mosaic virus2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3436—2012
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：陈青、李桂芬、黄峰、陈红运、廖富荣、林石明。1范围
藜草花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了藜草花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。SN/T3436—2012
本标准适用于可能带有黎草花叶病毒的植物的种子，苗术及植物产品的检疫鉴定。2原理
学名：sowbane mosaic virus
缩写：SoMV
分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）成员。抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的主要依据详细资料参见附录A。
3仪器、设备与试剂wwW.bzxz.Net
3.1仪器设备和用具
微量研磨仪、酶标仪，洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪，电泳仪.水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽、pH计、可调移液器（1000μL、200μL20μL、2μL）、96孔酶标板、研钵等；防虫温室。
3.2试剂
主要试剂和缓冲液见附录B和附录C。4检测样品的制备
4.1种子样品制备
挑取畸形、不成熟种子播于灭菌土中，待长出3～4片叶后将表现症状的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联测定和分子生物学检测。也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测。4.2苗木
有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等)的苗木编号单独检测。没有症状的分组并编号检测，分组方法和检测方法同4.1。
4.3植物产品
植物产品有症状的部分（如：叶片畸形、花叶、斑驳等）单独编号检测。没有症状或无法观察症状的植物产品，应按比例取样，分组编号，分组方法和检测方法同4.1。SN/T3436—2012
5检测与鉴定
5.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定把制备的样品上清液加人已包被SoMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测，每个样品平行加到两个孔中。设阴性对照和阳性对照（健康的植物组织作阴性对照，感染了SoMV的植物组织作阳性对照），样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。5.2RT-PCR检测
开MPGR
这转零合成A高进
分别提取样品和对照的总RNA
照，感染SoMV的植物组织作阳性对想用纯兆修真过6结果判定
如果2种方法检测结果为阳性，即可弹该进RT-PCR检测为阳性即可判断为样品尊#！行生物接种试验。
7结果记录与样品保存
7.1结果记录
完整的实验记录包括：样品的来，游类、时间
增。健康的植物组织作阴性对
体见附录C。
品带藜草花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，种接检测，出现阳性结果时，需进去验的时间
实验人员的签字。酶联测定需有酶威度的原给据7.2样品保存
地点防法和结果等，并要有经手人和PCR检测需有电泳结果照片。
经检验确定携带SoMV的样品战庭适系解手保存，种子者一80℃冰箱中，做好标记和登记维2
℃，病叶冻干保存在20℃或
A。1藜草花叶病毒学名和分类地位学名：sowbanemosaicvirus
缩写：SoMV
附录A
（资料性附录）
藜草花叶病毒相关资料
分类地位：南方菜豆花叶病毒属（sobemovirus）成员A.2抗原特性
SoMV抗原性强。
A.3粒体形态
藜草花叶病毒粒体为球形，直径约为39nm。A.4基因组
SN/T3436—2012
该病毒粒体包含20%核酸和80%的蛋白，基因组为ssRNA，长4.2kb，含有26%的G，23.2%的us病毒基因组为单分体基因组，病毒RNA的3\端既无poly-AA，27.2%的C,23.2%的U.Sobem
结构，也无tRNA结构，其RNA的5端有十个VP，可能是侵染所必需的A.5寄主范围
藜草花叶病毒寄主范围有限，自然寄主为藜科（Chepopodiaceae）植物，但是欧洲也发现很多果树和葡萄也感染藜草花叶病毒。有实验证明葡萄的分离物可经实验方法侵染其他科植物。A.6病害症状
昆诺藜：系统侵染，叶片斑驳、褪绿斑点，畸形，植株矮化。苋色藜：系统侵染，叶片斑驳、褪绿斑点，畸形，植株矮化。菠菜：系统隐症侵染。
墙生藜：斑驳。
甜菜：局部隐症侵染。
A.7分布
SoMV是1952年在加利福尼亚河边甜菜田里墙生藜（Chenopodiummurale）上首次发现的，目前SoMV广泛分布于南美、中美、北美、南非、澳大利亚、保加利亚、加拿大、前捷克斯洛伐克、意大利、日本、3
SN/T3436—2012
美国和前南斯拉夫南。
A.8传播途径
SoMV具有高度的传染性，易于机械传播，在温室中极易污染用作指示植物的科植物。可以通过汁液传播、昆虫传播和花粉、种子传播，可通过豌豆潜叶蝇、蚜虫、叶蝉等昆虫介体非持久性传毒；通过墙生藜（Chenopodiummurale）种传，种传率可高达7o%，也可通过昆诺藜及（Atriplerpacifica）和灰藜种传，在昆诺藜上的种传率高达60%，SoMV还可通过菠菜（Spinaciaoleracea）种子传播，病株上的花通过粉或者表面污染病毒的花粉都可作为侵染源。B.1试材
B.1.1酶联板。
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
包被抗体：特异性的藜草花叶病毒抗体。B.1.3酶标抗体：碱性磷酸酯酶标记的藜草花叶病毒抗体。B.1.4
底物：对硝基苯磷酸二钠（pNPP）。B.1.5
PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）Nacl
吐温-20
蒸馏水定容至1L。
B.1.6样品抽提缓冲液（pH7.4）NaSO
PVP（MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存。
B.1.7包被缓冲液（pH9.6)
NaHCOs
蒸馏水定容至1L，4℃储存。
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）BSA(牛血清白蛋白）或脱脂奶粉PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存。
B.1.9底物(pNPP)缓冲液(pH9.8)MgCl2
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馅水定容至1L，4℃储存。B.2程序
B.2.1包被抗体
SN/T3436—2012
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100uL/孔，37℃孵育4h，清空孔中溶液，5
SN/T3436-—2012
PBST洗涤3次。
B.2.2样品制备
待测样品按1：10（质量：体积）加入抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7500g离心10min，上清液即为制备好的待测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行；空白对照为样品抽提缓冲液。
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔（或48孔）酶联板，包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100μ洗涤3次。
B.2.4加酶标抗体
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释孵育2h，PBST洗涤3次。
B.2.5加底物
将底物bNPP加人到底物缓冲液
板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
用酶标仪在30min、1h和2h于
注：实际检测时，解育温度，PBST洗漆B.3结果判定
B.3.1对照孔的OD405值（缓冲液阴性对照孔的OD405值
同一样品的OD405值应基本
处读？
色读数
中照孔），店
B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原费上可判定如下
样品OD405值/阴性对照OD405值>2，判为阳性：箱孵育过夜，酶联板用PBST
加人到酶联板中，100uL/孔，37℃)，按100μl/孔，加人到酶联
试剂盒中说明书的规定执行。
质量控制范围内，即：
一样品OD405值/阴性对照OD405值接近阈值，判为可疑样品，需重做一一次或用其他方法验证：一样品OD值/阴性对照OD值<2.判为阴性B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。6
c.1试剂
C.1.1RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
Trizol裂解液、三氯甲烷、异丙醇、75%乙醇。C.1.2
反转录试剂
SN/T3436-2012
M-MLV反转录酶（200U/μL)、5X反转录缓冲液aNTP(10mmerl/L)、RNasin(40U/μL)、DEPC处理过的ddH2O。
C.1.3PCR试剂
10XPCR缓冲液、dNTP(10mml/L)、Tag酶（5U/μL）C.1.4
电泳试剂
50XTAE
冰醋酸
NazEDTA·2H,0
加去离子水定容至1L。
用时加水稀释
6×加样缓冲液
0.25%溴酚蓝
40%（质量浓度）蔗糖水溶液
实验步骤
C.2.1总RNA提取
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移人灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀，室温静置3min;4℃，12000g离心10min，取上清液；加人200uL三氯甲烷，上下颠倒混勾，室温静止3min；4℃，12000g离心10min，取上层水相；加等体积的异丙醇，颠倒混勾；4℃，12000g离心10min，弃上清液：加1ml75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心5min，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30μL经DEPC（焦炭酸二乙酯）处理的ddHzO，一20℃保存备用。C.2.2RT-PCR反应
C.2.2.1引物与产物
RT-PCR检测引物见表C.1。
SN/T3436--2012
引物名称
SoMVCP510f
SoMVCP510r
C.2.3cDNA合成
表C.1PCR引物序列、产物
序列（5\-3\）
TGTTATGGGCAGGGCTATG
TGTAAATCGCAAGGGCAG
扩增产物
反转录总体系为12.5μuL。在PCR管中依次加人3uL总RNA，1μLSoMV下游引物（CP510r，浓度为20pmol/uL），在65℃温浴7min，然后，冰浴5min，瞬时离心，再向PCR管中加人下列试剂：MMLVRT(200U/μL)0.5μL.5XRT缓冲液2.5μL、dNTP(10mmoL/L)0.5μL、RNasin(40U/μl)0.5μL、DEPC处理的ddHzO4.5μl。反应参数：37℃60min，95℃10min。合成的cDNA于-20℃冰箱保存备用。
C.2.4PCR扩增
PCR反应体系见表C.2。反应参数：95℃5min95℃30s，54℃45s.72℃45s，35个循环72℃10min。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。表C.2PCR反应体系
试剂名称
10×PCR缓冲液
dNTP(10 mmol/L)
SoMVCP510f(20pmol/μL)
SoMV CP510r(20pmol/μL)
Taq酶(5U/μL)
cDNA模板
琼脂糖电泳
制备凝胶
加样量
补足反应总体积至25μl
将1×TAE和电泳级琼脂糖按1.5%（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混勾，冷却至55℃左右。C.2.5.2加溴化乙锭(EB)
加人溴化乙锭浓度为0.5μg/mL，混勾，倒人已封好的凝胶平台上，插上样品梳。待凝胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，加人足够量的TAE(缓冲液没过凝胶表面约1mm）。C.2.5.3加样
用5μl.样品PCR产物与加样缓冲液（6X）按规定比例混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加人到琼脂糖凝胶孔中。C.2.5.4电泳
SN/T3436--2012
接通电源，电压120V下使DNA向阳极移动。当加样缓冲液中的溴酚蓝迁移至足够分离DNA片段时，关闭电源。将整个胶置于紫外透射仪上观察。5结果判断
阳性对照在510bp左右处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，如果样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性；如果样品未出现与阳性对照一致的扩增条带，判定结果为阴性。9
SN/T3436-2012
中华人民共和国出人境检验检疫行业标准
藜草花叶病毒检疫鉴定方法
SN/T3436--2012
中国标准出版社出版
北京市朝阳区和平里西街甲2号（100013）北京市西城区三里河北街16号（100045）总编室：（010)64275323
网址：spc.net.cn
中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷开本880×12301/16
印张1字数20千字
2013年6月第一版
2013年6月第一次印刷
印数1-1600
书号：155066·2-25286
定价18.00元
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