SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 3449—2012 昆虫介体中植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of candidatus phytoplasma in insect vector 2012-12-12 发布 2013-07-01 实施 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照 GB/T 1.1-2009 起草，由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁夏出入境检验检疫局。主要起草人：赵文军、陈岩、杨毅、杨旭光、牟海青、朱水芳。 1 范围 本标准规定了昆虫介体中植原体的检疫和鉴定方法，适用于进出境及国内监测中同翅目和半翅目（具刺吸式口器）昆虫体内植原体的检疫和鉴定。 2 原理 根据传播植原体的昆虫介体种类（参见附录A）及植原体的分子生物学特性进行鉴定。 3 仪器和试剂 3.1 仪器设备 PCR 仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、移液器、电泳仪、凝胶成像系统。 3.2 主要试剂 甘油、75%乙醇、无水乙醇、冰醋酸、三氯甲烷、卡诺固定液（无水乙醇：冰醋酸：三氯甲烷=6:1:3）、昆虫保存液（75%乙醇，1%甘油）、PCR 缓冲液、MgCl2、dNTPs、Taq DNA 聚合酶、引物、TAE 电泳缓冲液、DNA 相对分子质量标准、SYBR Green I。 4 检测鉴定方法 4.1 昆虫的前处理 昆虫饥饿处理 12 h，以防止肠道内食物 DNA 污染。 4.2 昆虫体内植原体基因组 DNA 提取 参见附录B 的方法。 4.3 巢式 PCR 扩增及凝胶电泳检测 用两对植原体扩增通用引物进行巢式 PCR 扩增，并进行凝胶电泳检测，详见附录C。 4.4 虚拟 RFLP 指纹图谱检测 见附录D。 5 结果判定 5.1 若通用引物 R16F2n/R16R2 第二轮 PCR 扩增产物经凝胶电泳检测结果为阳性，片段大小约 1.2 kb，可初步判定昆虫样品中携带植原体，但需通过 4.4 方案进一步确认。 5.2 在 4.4 检测中，克隆并测序植原体 16SrDNA 序列，经 17 种限制性内切酶虚拟酶切获得 RFLP 指纹图谱，如与已知植原体一致，可判定样品携带该植原体。 6 样品保存与复核 6.1 样品保存与处理 样品经登记并由经手人签字后，同批检出植原体的昆虫蛋冻于 -20℃ 冰箱中保存。昆虫处理 12 h 后浸泡于卡诺固定液 20 min，然后转入昆虫保存液，存于 -20℃ 冰箱中。所有样品保存期满后应经高压灭菌处理。 6.2 结果记录与资料保存 完整实验记录包括样品来源、种类、时间，实验时间、地点、方法和结果，并有实验人员和审核人员签字。PCR 凝胶电泳结果及测序序列和比对文件应保存。 6.3 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定单位或人员负责，主要考察实验记录和照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核试验。 附录 A（资料性附录） 植原体主要昆虫传播介体种类 表 A.1 寄主植物及昆虫介体 叶蝉科（Cicadellidae）：Acinopterus angulatus, Alebroides nigroscutellatus, Amrasca devastans, Aphrodes bicincta（双带脊冠叶蝉）, Austroagalica torride, Butruchomorphus punctatus, Circulifer haematoceps, Circulifer lenellus（甜菜叶蝉）, Colladonus clitellarius（鞍形叶蝉）, Colladonus geminatus, Colladonus montanus（深山叶蝉）, Dalbulus elimatus（墨西哥玉米叶蝉）, Dalbulus maidis（玉米叶蝉）, Empoasca papayae, Endriginimicus（胭脂叶蝉）, Escelidius lineolatus, Euscelidius variegates（秧叶蝉）等。