SN/T 4877.5-2017.DNA barcoding screening method-Part5:Quarantine Phomopsis SPp.
1范围
SN/T 4877.5规定了大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜黑色根腐病菌等4种检疫性拟茎点霉DNA条形码筛查方法。
SN/T 4877.5适用于进境植物及其产品中大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜黑色根腐病菌等4种检疫性拟茎点霉的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1899大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法
SN/T 2589植物病原真菌检测规范
SN/T 3423黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法
SN/T 3432向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1凭证标本voucher specimen
为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息(采集及鉴定信息等)而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分， 也可以是生物体的遗传物质。凭证标本的保存非常重要,需要有详细的标本编号、存放地点等详细信息,以便于日后查证。
3.2DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的,标准的、有足够变异的.易扩增且相对较短的DNA片段。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.5—2017
基因条形码筛查方法bzxZ.net
第5部分：检疫性拟茎点霉
DNAbarcoding screening methodPart5:Quarantine Phomopsis spp2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌；
一第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭菌；
-第9部分：检疫性腥黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第5部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.5—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中国检验检疫科学技术研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中国科学院微生物研究所。本部分起草人：黄国明、胡佳续、段维军、赵文军、蔡磊、高雅惠、廖芳、罗加风、张莹。1范围
基因条形码筛查方法
第5部分：检疫性拟茎点霉
SN/T4877.5—2017
SN/T4877的本部分规定了大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜黑色根腐病菌等4种检疫性拟茎点霉DNA条形码筛查方法本部分适用于进境植物及其产品中大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方茎溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜黑色根腐病菌等4种检疫性拟茎点霉的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件SN/T1899大豆茎溃疡病菌检疫鉴定方法SN/T2589
SN/T3423
SN/T3432
3术语和定义
植物病原真菌检测规范
黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法向日葵茎溃疡病菌检疫鉴定方法下列术语和定义适用于本文件。3.1
voucher specimen
凭证标本
为鉴定或研究提供实物依据并具有足够存档信息（采集及鉴定信息等）而长期保存的标本，它可以是完整的生物个体或其一部分，也可以是生物体的遗传物质。凭证标本的保存非常重要，需要有详细的标本编号、存放地点等详细信息，以便于日后查证。3.2
DNA条形码
DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.3
Internaltranscribed spacer;ITs内部间隔转录区序列
用于鉴定拟茎点霉属病原真菌的DNA条形码：内部间隔转录区序列（Internaltranscribedspacer，简称ITS），在rDNA基因中，18SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为（ITS），它的长度和序列变化较大，将其扩增物进行序列分析，可用于对植物病原真菌的属、种、甚至种下阶元进行分类鉴定。检疫性拟茎点霉基本信息
农业部和国家质检总局2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中将植物病原真菌拟茎点霉属（Phomopsis）中的大豆北方茎溃疡病菌Diaporthe1
SN/T4877.5—2017
phaseolorum（CookeetEll.)Sacc.varcaulivoraAthowetCaldwell(无性态为Phomopsisphaseoli），大豆南方茎渍疡菌Diaporthephaseolorum（CookeetEll.)Sacc.var.meridionalisF.A.Fernandez(无性态为Phomopsisphaseoli）、向日葵茎溃疡病菌DiaporthehelianthiMuntanola一CvetkovicMihaljcevicetpetrov(无性态为PhomopsishelianthiMunt.-Cvetk.，Mihaljc.&M.Petrov）、黄瓜黑色根腐病菌PhomopsissclerotioidesvanKesteren、蓝莓果腐病菌DiaporthevacciniiShear（无性态为PhomopsisvacciniiShearN.E.Stevens&H.F.Bain），苹果果腐病菌DiaportheperniciosaE.J.Marchal(无性态为Phomopsisprunorum（Cooke)Grove）、列为我国禁止进境检疫性有害生物。大豆北方茎溃疡病菌、大豆南方基溃疡病菌、向日葵茎溃疡病菌、黄瓜黑色根腐病菌相关分类地位、传播途径等信息分别见SN/T1899、SN/T3432、SN/T3423。5方法原理
根据拟茎点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS)序列特征，将序列在DNA条码数据库和NCBI数据库中拟茎点霉属ITS序列进行同源性比对，应用DNA条形码技术对检疫性拟茎点霉进行种类筛查本标准建立的方法不应完全取代形态学和其他分子生物学等鉴定方法，而应作为形态学和其他分子生物学鉴定方法的一种补充，相互佐证。6仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备
生物显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、常规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、测序仪、全自动DNA提取仪。
6.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。应购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：二水合乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H.O）、氢氧化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI）、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡略咯烷酮（PVP）、冰醋酸（CH,COOH）、蒸馏水、氯仿（CHCI）、异戊醇、70%乙醇。
PCR和电泳检测所需试剂：10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ErTaqDNA聚合酶、引物（表B.1）、超纯水，DNA标记物、琼脂糖、GelRed核酸凝胶染料。7DNA条形码鉴定
7.1样品的采集与处理
样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589植物病原真菌检疫鉴定方法进行。7.2核酸的制备
采用市售基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法（参见附录A）。7.3DNA纯度与浓度的测定
用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核2
酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50×OD260（μg/mL）
PCR级DNA溶液的OD260/ODz8o比值应为1.7～1.9。7.4PCR检测
7.4.1PCR扩增
引物序列PCR扩增体系，PCR反应程序参见附录B7.4.2PCR产物的检测和测序
SN/T4877.5—2017
5μL的PCR产物与1μL的6×上样缓冲液混合，120V下电泳，染色后在凝胶成像系统中观察目的片段并成像留存，对扩增产物进行序列测定，测序引物为通用测序引物M13F-47和M13R-48，或者直接将PCR扩增产物直接送专业测序公司测序。7.5
5序列分析
测序结果利用生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列。利用NCBI在线数据库和BOLD在线数据库中比对ITS片段序列。结果判定
ITS序列长度药为7OObP，若与DNA条码数据库和NCBI数据库中拟茎点霉属ITS序列同源性大于99%，且菌落特征、寄主等与相关行业标准相符，即可判定为该物种，9
样品保存
样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出检疫性拟茎点霉的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。9.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为检疫性拟茎点毒的菌株，应按照相应行业标准的保存方法要善保存。对不需要长期保存的菌株应及时高压灭菌处理。9.3结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、方法和结果等，并要有实验人员和复核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。3
SN/T4877.5—2017
附录A
（资料性附录）
DNA提取方法
A.1取适量菌丝体（500mg）和灭菌的玻璃珠放在2mL离心管中，加人500μL2×CTAB（60℃），置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温30min～60min，偶尔震荡混勾。A.2加人500μL（1：1，等体积）氯仿-异戊醇（24：1），混合均匀后（3min），12000r/min，离心15min
A.3提取上清液，加人250μL（1：1，等体积）氯仿-异戊醇（24：1）12000r/min，离心15min，重复此步骤一次。
A.4提取上清液，加人等体积异丙醇，混勾，沉淀30min。A.5出现沉淀后，12000r/min离心1oA.6弃去液相，加人400μL70%乙醇，震荡洗涤，再12A.7弃去液相，超净工作台中干燥DNA，约20minooor/min离
5min重复此步骤一次。
A.8加人50μL或100μL双蒸水（视情况而定）溶解DNA样品，将样品于一20℃保存备用。或采用全自动DNA提取仪根据仪器和试剂盒使用说明进行操作提取DNA。S
扩增引物见表B.1。
PCR反应体系（30μL)见表B.2。PCR反应程序(ITS)见表B.3。
附录B
（资料性附录）
DNA条形码引物和反应条件
5-AGCGGATAACAATTTCAC
CTCCGCTTATTGA
TATGC-3
5'-CGCCA6GGTTTTCCCA6TCACGACGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3\注：下划线部分为通用测序引物M13F-42和M13R-48，全部序列都要合成。表B.2PCR反应体系（30L
试剂名称
10XPCR缓冲液
2.5mmol/LdNT
10μmol/L
10pμmol/
primer
5U/μLTaqDNA
L模板
10ng/μ
加双蒸水至
预变性
反应温度/℃
PCR反应程序（ITS)
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目的基因
加样量/μL
循环数
SN/T4877.5—2017
参考文献
[1]UdayangaD,LiuXZ,McKenzieEHC,etal.TilegenusPhomopsis:biology,applications,species conceptsand namesof common phytopathogens[JJ.FungalDiversity.2011,5o(1):189-225.[2]Botella L,Diez JJ.Phylogenic diversity of fungal endophytes in Spanish stands of Pinushalepensis[J].FungalDiversity，201l，47(1)：9-18.[3]lriartX,BinoisR,FlorA,etal.Eumycetoma caused byDiaporlhephaseolorum（Pho-mopsis phaseoli):a casereport and a mini-review of Diaporthe/Phomopsis spp invasive infections inhumans.Clinical Microbiology and Infection，2011,17(10):1492-1494.[4J Wang JY, Xu XH, Mao LJ, et al. Endophytic Diaporthe from southeast China are geneti-cally diverse based on multi-locus phylogeny analyses.World Journal of Microbiology and Biotechnolo-gy，2014,30(1)：237-243.
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