SN/T 4877.4-2017
基本信息
标准号： SN/T 4877.4-2017
中文名称：基因条形码筛查方法第4部分:检疫性茎点霉
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4877.4-2017.DNA barcoding screening method-Part 4:Quarantine Phoma spp.
1范围
SN/T 4877.4规定了检疫性茎点霉DNA条形码筛查方法。
SN/T 4877.4适用于进境植物及其产品中检疫性茎点霉的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1135.8马铃 薯环疽病菌检疫鉴定方法
SN/T 2589植物病原真菌检测规范
SN/T 3288柠檬干枯病菌 检疫鉴定方法
SN/T3682葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法
SN/T 3755豌豆脚腐病 菌检疫鉴定方法
3术语 和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
3.2内部间隔转录区序列internal tramnscribed spacer;ITS
在真核生物中,核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5'~3'依次为:外部转录间隔区.18 S基因、内部转录间隔区1(ITS1) .5.8 s基因、内部转录间隔区2(ITS2)28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18 S rDNA、5.8 s rDNA和28 S rDNA之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区,受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点,在种内的不同菌株之间高度保守,而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性,能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。
1范围
SN/T 4877.4规定了检疫性茎点霉DNA条形码筛查方法。
SN/T 4877.4适用于进境植物及其产品中检疫性茎点霉的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1135.8马铃 薯环疽病菌检疫鉴定方法
SN/T 2589植物病原真菌检测规范
SN/T 3288柠檬干枯病菌 检疫鉴定方法
SN/T3682葡萄茎枯病菌检疫鉴定方法
SN/T 3755豌豆脚腐病 菌检疫鉴定方法
3术语 和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
3.2内部间隔转录区序列internal tramnscribed spacer;ITS
在真核生物中,核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成,其基因组序列从5'~3'依次为:外部转录间隔区.18 S基因、内部转录间隔区1(ITS1) .5.8 s基因、内部转录间隔区2(ITS2)28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18 S rDNA、5.8 s rDNA和28 S rDNA之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区,受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点,在种内的不同菌株之间高度保守,而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性,能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.4—2017
基因条形码筛查方法
第4部分：检疫性茎点霉
DNA barcoding screening method-Part 4:Quarantine Phoma spp2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
一第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉：
第6部分：检疫性嗜酸菌；
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌；
第9部分：检疫性腥黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第4部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T4877.4—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国天津出人境检验检疫局，中国检验检疫科学研究院。本部分起草人：段维军、蔡磊、陈倩、廖芳、郭立新、张慧丽、陈先锋、朱水芳。1
1范围
基因条形码筛查方法
第4部分：检疫性茎点霉
SN/T4877的本部分规定了检疫性茎点霉DNA条形码筛查方法本部分适用于进境植物及其产品中检疫性茎点霉的筛查。2规范性引用文件
SN/T4877.4—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1135.8马铃薯环疽病菌检疫鉴定方法SN/T2589
植物病原真菌检测规范
SN/T3288
SN/T3682
SN/T3755
3术语和定义
柠檬干枯病菌检疫鉴定方法
葡萄茎枯病菌检疫鉴定方
豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2
内部间隔转录区序列internaltranseribed spacer;ITs在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5'～3'依次为：外部转录间隔区、18S基因、内部转录间隔区1(ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。3.3
β-微管蛋白基因beta-tubulin，TUBβ-微管蛋白基因既有保守的外显子又有许多内含子，已被用于真菌各级分类水平上的系统发育研究。并且发现其无论在低分类阶元的系统发育研究中，还是复合种的研究中，甚至对于种内不同地域菌株间的亲缘关系研究有重要意义。β-微管蛋白基因已在茎点霉属部分物种的研究中显示出较好的区分程度。
SN/T4877.4—2017
检疫性茎点霉QuarantinePhomaspp.农业部和国家质检总局于2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中将植物病原真菌茎点霉属（Phoma）中的马铃薯环疽病菌PhomaeriguaDesmazieresf.sp.foveata（Foister）Boerema、葡萄茎枯病菌Phomaglomerata（Corda）WollenweberetHochapfel、豌豆脚腐病菌Phomapinodella（L.K.Jones）Morgan-JonesetK.B.Burch和柠檬干枯病菌Phomatracheiphila（Petri）L.A.Kantsch，etGikaschvili列为我国禁止进境检疫性有害生物。马铃薯环疽病菌、葡萄茎枯病菌、豌豆脚腐病菌和柠檬干枯病菌详细分类信息见SN/T1135.8、SN/T3682、SN/T3755、SN/T3288。4方法原理
根据茎点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS）和β微管蛋白片段（TUB)的序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性茎点霉进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性茎点霉及其种属归类。仪器用具和试剂
5.1仪器设备与用具
显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5μL，2.5μL，10μL，20μL200μL，1000μL）、常规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、DNA提取仪，5.2主要试剂
购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA·2H,O)、氢氧化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI)、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡咯烷酮(PVP）、冰醋酸（CH,COOH)、蒸馏水、氯仿（CHCI）、异戊醇、7O%乙醇。PCR和电泳检测所需试剂：10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ErTaq聚合酶、引物（表1)、超纯水、DNA片段标记物、琼脂糖、核酸凝胶染料。6筛查鉴定方法
6.1样品的采集与处理
样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589进行6.2核酸的制备
采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法，参见附录A。6.3DNA纯度与浓度的测定
用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9。6.4序列扩增测序
SN/T4877.42017
利用通用引物对ITS和TUB基因进行扩增测序（具体步骤参见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中茎点毒属ITS和TUB基因序列相似性均大于98%，则进行6.5操作。6.5序列分析
4种检疫性茎点霉属的ITS和TUB基因参考序列参见附录C。将ITS和TUB基因序列在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对分析，采用邻接法构建基于ITS和TUB基因序列的NJ树。7结果判定
ITS基因序列长度大于500bp，在美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中茎点霉属ITS基因序列同源性大于98%，则判定该菌为茎点霉属。
TUB基因序列长度大于300bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中茎点霉属某种ITS基因序列同源性大于98%，且在系统进化树中聚在同一分支，则初步判定为该茎点霉属该种。wwW.bzxz.Net
若判定为目标检疫性茎点霉，利用相应标准的需要根据标准方法进行最终鉴定，无相应标准的按照常规真菌鉴定方法进行最终鉴定8样品保存
8.1样品保存
分离并最终鉴定为检疫性自标真菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低温冰箱中保存，定期（30d～60d）转接，必要时冻干后长期保存。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源，种类，时间，实验的时间，地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。3
SN/T4877.4—2017
附录A
（资料性附录）
DNA提取方法
A.1取适量菌丝体（500mg）和灭菌的玻璃珠放在2mL离心管中，加入500μL2×CTAB（60℃），置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温30min～60min，偶尔振荡混勾。A.2加人500μL（1：1，等体积）氯仿-异戊醇（24：1），混合均匀后（3min），12000r/min，离心15min。
A.3提取上清液，加入250μL（1：1，等体积）氯仿-异戊醇（24：1），12000r/min，离心15min重复此步骤一次。
A.4提取上清液，加人等体积异丙醇，混勾，沉淀30min。A.5出现沉淀后，12000r/min离心10minA.6
弃去液相，加入400μL70%乙醇，振荡洗涤，再12000r/min离心5min；重复此步骤一次。弃去液相，超净工作台中干燥DNA，约20 min加人50μL或100μL双蒸水（视情况而定）溶解DNA样品，将样品于一20℃保存备用。S
扩增引物见表B.1。
附录B
（资料性附录）
DNA条形码引物和反应条件
PCR反应体系（25μL)见表B.2。PCR反应程序(ITS)见表B.3。
PCR反应程序（TUB)见表B.4。
表B.1扩增引物
目标基因
预变性
引物序列
V9G.TTACGTCCCTGCCCTTTGTA
ITS4:TCCTCCGC
TATTGATATGC
T1:AACATGCGTGAGAT
TGTAAGT
CRGAYTGRCCRAARACRAAGTTGTC
TUB4Rd:C
表B.2PCR反应体系（25UL）
dNTP混合物（各10mmg
10×PCR缓冲液（含
正向引物
反向引物
Taq酶
DNA模板
双蒸水
表B.3PCR反应程序（ITS）
反应温度/℃
SN/T4877.4—2017
扩增片段
体积/μL
循环数
SN/T4877.4—2017
预变性
PCR反应程序（TUB）
反应温度/℃
循环数
附录C
（资料性附录）
茎点霉属真菌参考序列的GenBank登录号（ITS，TUB）茎点霉属真菌参考序列的GenBank登录号见表C.1。表c.1
物种名称
Ascochyta pinodes
Ascochyta pinodes
Phoma americand
Phoma americana
Phoma anserina
Phoma anserina
Phoma arachidicola
Phoma arachidicola
Phoma aurea
Phoma bellidis
Phoma bellidis
Phoma boeremae
Phoma calidophila
Phoma calidophila
Phoma calorpreferens
Phoma calorpreferens
Phoma caricae papayae
Phoma caricae papayae
Phoma clematidina
Phoma clematidina
Phoma coffeae-arabicae
Phoma cofeae-arabicae
Phoma crinicola
菌株编号
CBS159.78
CBS285.49
CBS185.85PD80/1191
CBS568.97;PD94/1544;
ATCC44494
CBS360.84
CBS363.91PD79/712
CBS315.90PD80/1190
CBS333.75';ATCC28333
IMI386092PREM44889
CBS269.93;PD78/1087
CBS714.85;PD74/265
PD94/886
CBS109942*;PD84/402
CBS448.83号
PD84/109
CBS109.92#：PD73/1405
CBS630.97;ATCC96683;
IMI361196:PD96/2022
CBS248.90
PD06/03082531
CBS102.66
CBS108.79*;PD78/522
CBS123380#：PD84/1013
CBS123398:PD84/1014
CBS109.79:PD77/747
Pisum sativum
Primula auricula
Zea mays
Glycine mar
Potatoflour
Pisum sativum
Arachis hypogaea
Arachis hypogaea
Medicago
polymorpha
Bellis perennis
Bellis sp.
Medicago
littoralis C
Harbinger
Cucumis sativus
Undefined food
material
Heterodera
glycines
Carica papaya
Carica papaya
Clematis sp.
Clematis sp.
Coffea arabica
Coffea arabica
Crinum pouellii
采集地
Switzerland
Netherlands
Netherlands
Zimbabwe
South Africa
Zealand
Netherlands
Netherlands
Australia
Europe
Netherlands
Brazil
Netherlands
Ethiopia
Ethiopia
Netherlands
SN/T4877.42017
GenBank登录号
GU237786
GU237823
FJ426972
FJ426974
GU237839
GU237840
GU237827
GU237833
GU237818
GU237904
GU237923
FJ426982
FJ427059
FJ427060
FJ426983
GU237925
GU237807
GU237912
FJ426988
FJ426989
FJ426993
FJ426994
GU237737
GU237569
GU237571
FJ427088
FJ427090
GU237551
GU237552
GU237553
GU237554
GU237557
GU237587
GU237581
FJ427097
FJ427168
FJ427169
FJ427098
GU237560
GU237680
GU237681
FJ427099
FJ427100
FJ427104
FJ427105
GU237489
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基因条形码筛查方法
第4部分：检疫性茎点霉
DNA barcoding screening method-Part 4:Quarantine Phoma spp2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
一第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉：
第6部分：检疫性嗜酸菌；
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌；
第9部分：检疫性腥黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第4部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T4877.4—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中国科学院微生物研究所、中华人民共和国天津出人境检验检疫局，中国检验检疫科学研究院。本部分起草人：段维军、蔡磊、陈倩、廖芳、郭立新、张慧丽、陈先锋、朱水芳。1
1范围
基因条形码筛查方法
第4部分：检疫性茎点霉
SN/T4877的本部分规定了检疫性茎点霉DNA条形码筛查方法本部分适用于进境植物及其产品中检疫性茎点霉的筛查。2规范性引用文件
SN/T4877.4—2017
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1135.8马铃薯环疽病菌检疫鉴定方法SN/T2589
植物病原真菌检测规范
SN/T3288
SN/T3682
SN/T3755
3术语和定义
柠檬干枯病菌检疫鉴定方法
葡萄茎枯病菌检疫鉴定方
豌豆脚腐病菌检疫鉴定方法
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2
内部间隔转录区序列internaltranseribed spacer;ITs在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5'～3'依次为：外部转录间隔区、18S基因、内部转录间隔区1(ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、28S基因和基因间隔序列。内转录间隔区是存在于18SrDNA、5.8SrDNA和28SrDNA之间的区域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。3.3
β-微管蛋白基因beta-tubulin，TUBβ-微管蛋白基因既有保守的外显子又有许多内含子，已被用于真菌各级分类水平上的系统发育研究。并且发现其无论在低分类阶元的系统发育研究中，还是复合种的研究中，甚至对于种内不同地域菌株间的亲缘关系研究有重要意义。β-微管蛋白基因已在茎点霉属部分物种的研究中显示出较好的区分程度。
SN/T4877.4—2017
检疫性茎点霉QuarantinePhomaspp.农业部和国家质检总局于2007年5月29日发布的第862号公告《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中将植物病原真菌茎点霉属（Phoma）中的马铃薯环疽病菌PhomaeriguaDesmazieresf.sp.foveata（Foister）Boerema、葡萄茎枯病菌Phomaglomerata（Corda）WollenweberetHochapfel、豌豆脚腐病菌Phomapinodella（L.K.Jones）Morgan-JonesetK.B.Burch和柠檬干枯病菌Phomatracheiphila（Petri）L.A.Kantsch，etGikaschvili列为我国禁止进境检疫性有害生物。马铃薯环疽病菌、葡萄茎枯病菌、豌豆脚腐病菌和柠檬干枯病菌详细分类信息见SN/T1135.8、SN/T3682、SN/T3755、SN/T3288。4方法原理
根据茎点霉属真菌的核糖体转录间隔区（ITS）和β微管蛋白片段（TUB)的序列特征，应用DNA条形码技术对检疫性茎点霉进行种类筛查，确定目标真菌是否为检疫性茎点霉及其种属归类。仪器用具和试剂
5.1仪器设备与用具
显微镜、高压灭菌锅、超净工作台、组织破碎仪、恒温水浴锅、台式冷冻离心机、微量分光光度仪、电子天平、超纯水仪、漩涡振荡器、冰箱、微量移液器（0.5μL，2.5μL，10μL，20μL200μL，1000μL）、常规PCR仪、核酸电泳仪、凝胶成像系统、DNA提取仪，5.2主要试剂
购置如下试剂或者相应的真菌基因组提取试剂盒：乙二胺四乙酸钠盐（Na2EDTA·2H,O)、氢氧化钠（NaOH）、Tris碱、浓盐酸（HCI)、溴化十六烷基三甲铵（CTAB）、氯化钠（NaCI）、聚乙烯吡咯烷酮(PVP）、冰醋酸（CH,COOH)、蒸馏水、氯仿（CHCI）、异戊醇、7O%乙醇。PCR和电泳检测所需试剂：10XPCR缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸（dNTPs）、ErTaq聚合酶、引物（表1)、超纯水、DNA片段标记物、琼脂糖、核酸凝胶染料。6筛查鉴定方法
6.1样品的采集与处理
样品的采集、分离、纯化和培养按照SN/T2589进行6.2核酸的制备
采用基因组提取试剂盒制备DNA，或采用改良的CTAB提取法，参见附录A。6.3DNA纯度与浓度的测定
用微量紫外分光光度计测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD260μg/mL
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值应为1.7~1.9。6.4序列扩增测序
SN/T4877.42017
利用通用引物对ITS和TUB基因进行扩增测序（具体步骤参见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据库中茎点毒属ITS和TUB基因序列相似性均大于98%，则进行6.5操作。6.5序列分析
4种检疫性茎点霉属的ITS和TUB基因参考序列参见附录C。将ITS和TUB基因序列在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对分析，采用邻接法构建基于ITS和TUB基因序列的NJ树。7结果判定
ITS基因序列长度大于500bp，在美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中茎点霉属ITS基因序列同源性大于98%，则判定该菌为茎点霉属。
TUB基因序列长度大于300bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中茎点霉属某种ITS基因序列同源性大于98%，且在系统进化树中聚在同一分支，则初步判定为该茎点霉属该种。wwW.bzxz.Net
若判定为目标检疫性茎点霉，利用相应标准的需要根据标准方法进行最终鉴定，无相应标准的按照常规真菌鉴定方法进行最终鉴定8样品保存
8.1样品保存
分离并最终鉴定为检疫性自标真菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低温冰箱中保存，定期（30d～60d）转接，必要时冻干后长期保存。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源，种类，时间，实验的时间，地点，方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。3
SN/T4877.4—2017
附录A
（资料性附录）
DNA提取方法
A.1取适量菌丝体（500mg）和灭菌的玻璃珠放在2mL离心管中，加入500μL2×CTAB（60℃），置于组织破碎仪上破碎组织细胞壁，水浴保温30min～60min，偶尔振荡混勾。A.2加人500μL（1：1，等体积）氯仿-异戊醇（24：1），混合均匀后（3min），12000r/min，离心15min。
A.3提取上清液，加入250μL（1：1，等体积）氯仿-异戊醇（24：1），12000r/min，离心15min重复此步骤一次。
A.4提取上清液，加人等体积异丙醇，混勾，沉淀30min。A.5出现沉淀后，12000r/min离心10minA.6
弃去液相，加入400μL70%乙醇，振荡洗涤，再12000r/min离心5min；重复此步骤一次。弃去液相，超净工作台中干燥DNA，约20 min加人50μL或100μL双蒸水（视情况而定）溶解DNA样品，将样品于一20℃保存备用。S
扩增引物见表B.1。
附录B
（资料性附录）
DNA条形码引物和反应条件
PCR反应体系（25μL)见表B.2。PCR反应程序(ITS)见表B.3。
PCR反应程序（TUB)见表B.4。
表B.1扩增引物
目标基因
预变性
引物序列
V9G.TTACGTCCCTGCCCTTTGTA
ITS4:TCCTCCGC
TATTGATATGC
T1:AACATGCGTGAGAT
TGTAAGT
CRGAYTGRCCRAARACRAAGTTGTC
TUB4Rd:C
表B.2PCR反应体系（25UL）
dNTP混合物（各10mmg
10×PCR缓冲液（含
正向引物
反向引物
Taq酶
DNA模板
双蒸水
表B.3PCR反应程序（ITS）
反应温度/℃
SN/T4877.4—2017
扩增片段
体积/μL
循环数
SN/T4877.4—2017
预变性
PCR反应程序（TUB）
反应温度/℃
循环数
附录C
（资料性附录）
茎点霉属真菌参考序列的GenBank登录号（ITS，TUB）茎点霉属真菌参考序列的GenBank登录号见表C.1。表c.1
物种名称
Ascochyta pinodes
Ascochyta pinodes
Phoma americand
Phoma americana
Phoma anserina
Phoma anserina
Phoma arachidicola
Phoma arachidicola
Phoma aurea
Phoma bellidis
Phoma bellidis
Phoma boeremae
Phoma calidophila
Phoma calidophila
Phoma calorpreferens
Phoma calorpreferens
Phoma caricae papayae
Phoma caricae papayae
Phoma clematidina
Phoma clematidina
Phoma coffeae-arabicae
Phoma cofeae-arabicae
Phoma crinicola
菌株编号
CBS159.78
CBS285.49
CBS185.85PD80/1191
CBS568.97;PD94/1544;
ATCC44494
CBS360.84
CBS363.91PD79/712
CBS315.90PD80/1190
CBS333.75';ATCC28333
IMI386092PREM44889
CBS269.93;PD78/1087
CBS714.85;PD74/265
PD94/886
CBS109942*;PD84/402
CBS448.83号
PD84/109
CBS109.92#：PD73/1405
CBS630.97;ATCC96683;
IMI361196:PD96/2022
CBS248.90
PD06/03082531
CBS102.66
CBS108.79*;PD78/522
CBS123380#：PD84/1013
CBS123398:PD84/1014
CBS109.79:PD77/747
Pisum sativum
Primula auricula
Zea mays
Glycine mar
Potatoflour
Pisum sativum
Arachis hypogaea
Arachis hypogaea
Medicago
polymorpha
Bellis perennis
Bellis sp.
Medicago
littoralis C
Harbinger
Cucumis sativus
Undefined food
material
Heterodera
glycines
Carica papaya
Carica papaya
Clematis sp.
Clematis sp.
Coffea arabica
Coffea arabica
Crinum pouellii
采集地
Switzerland
Netherlands
Netherlands
Zimbabwe
South Africa
Zealand
Netherlands
Netherlands
Australia
Europe
Netherlands
Brazil
Netherlands
Ethiopia
Ethiopia
Netherlands
SN/T4877.42017
GenBank登录号
GU237786
GU237823
FJ426972
FJ426974
GU237839
GU237840
GU237827
GU237833
GU237818
GU237904
GU237923
FJ426982
FJ427059
FJ427060
FJ426983
GU237925
GU237807
GU237912
FJ426988
FJ426989
FJ426993
FJ426994
GU237737
GU237569
GU237571
FJ427088
FJ427090
GU237551
GU237552
GU237553
GU237554
GU237557
GU237587
GU237581
FJ427097
FJ427168
FJ427169
FJ427098
GU237560
GU237680
GU237681
FJ427099
FJ427100
FJ427104
FJ427105
GU237489
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