SN/T 4877.1-2017
基本信息
标准号： SN/T 4877.1-2017
中文名称：基因条形码筛查方法第1部分:检疫性棒形杆菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：6357030
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4877.1-2017.DNA barcoding screening method-Part 1 :Quarantine Clavibacter spp.
1范围
SN/T 4877.1规定了检疫性棒形杆菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。
SN/T 4877.1适用于检疫性棒形杆菌的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1135.5马铃 薯环腐病菌检疫鉴定方法
SN/T2568番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法
SN/T 2666苜 蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码
生物体内能够代表该物种的,标准的.有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
3.216S rRNA 基因
原核生物核糖体30 S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中,16 S rRNA基因的进化相对保守,被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺,基因序列具有高度的保守性和特异性。
16SrRNA基因序列是细菌检测鉴定与分类研究中应用最多的基因序列,是细菌种间鉴定的重要依据。
3.3gyrB基因
编码DNA解旋酶B亚单位的基因,是单拷贝的看家基因,普遍存在于各种细菌中,本部分中gyrB基因序列作为细菌条形码基因进行种及种下阶元的筛查鉴定。
1范围
SN/T 4877.1规定了检疫性棒形杆菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。
SN/T 4877.1适用于检疫性棒形杆菌的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1135.5马铃 薯环腐病菌检疫鉴定方法
SN/T2568番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法
SN/T 2666苜 蓿细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码
生物体内能够代表该物种的,标准的.有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
3.216S rRNA 基因
原核生物核糖体30 S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中,16 S rRNA基因的进化相对保守,被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺,基因序列具有高度的保守性和特异性。
16SrRNA基因序列是细菌检测鉴定与分类研究中应用最多的基因序列,是细菌种间鉴定的重要依据。
3.3gyrB基因
编码DNA解旋酶B亚单位的基因,是单拷贝的看家基因,普遍存在于各种细菌中,本部分中gyrB基因序列作为细菌条形码基因进行种及种下阶元的筛查鉴定。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.1—2017
基因条形码筛查方法
第1部分：检疫性棒形杆菌
DNA barcoding screening method-Part 1:Quarantine Clavibacter spp2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体。
本部分为SN/T4877的第1部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4877.1—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黄岛出人境检验检疫局，中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：赵文军、夏明星、张凤娟、田茜、高文娜、冯建军、廖芳1范围
基因条形码筛查方法
第1部分：检疫性棒形杆菌
SN/T4877.1—2017
SN/T4877的本部分规定了检疫性棒形杆菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于检疫性棒形杆菌的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件SN/T1135.5马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法SN/T2568番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法SN/T2666首细菌性萎蒿病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码
生物体内能够代表该物种的，标准的有足够变异的，易扩增且相对较短的DNA片段，3.2
16SrRNA基因
原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，基因序列具有高度的保守性和特异性。16SRNA基因序列是细菌检测鉴定与分类研究中应用最多的基因序列，是细菌种间鉴定的重要依据。
gyrB基因
编码DNA解旋酶B亚单位的基因，是单拷贝的看家基因，普遍存在于各种细菌中，本部分中gyrB基因序列作为细菌条形码基因进行种及种下阶元的筛查鉴定。4棒形杆菌的基本信息
学名：Clavibacter
分类地位：细菌界（Bacteria），放线菌门（Actinobacteria），放线菌纲（Actinobacteria），放线菌目（Actinomycetales），微杆菌科（Microbacteriaceae）。目前棒形杆菌属的植物病原细菌只有一个种密执安棒形杆菌（Clavibactermichiganensis），该种包括如下5个亚种，其中前4个为进境植物检疫性有害生物：
SN/T4877.1-2017
首细菌性萎焉病菌（Clavibactermichiganensissubsp.insidiosus）；番茄溃疡病菌（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis）：玉米内州菱為病菌（Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis）；马铃薯环腐病菌（Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus）；小麦细菌性花叶病菌（Clavibactermichiganensissubsp.tessellarius）。5方法原理
根据细菌核糖体16SrRNA基因序列分析确定目标细菌是否为棒形杆菌，然后根据gyrB基因序列分析确定目标细菌为某个亚种。仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备
生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、核酸蛋白分析仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统、冰箱等。
6.2主要试剂
细菌DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水.DNAmarker等7筛查鉴定方法
7.1DNA制备
对细菌进行液体培养或平板培养，利用商品化细菌DNA提取试剂盒制备细菌总DNA，测定DNA浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用7.216SrRNA基因序列扩增测序
利用通用引物进行16SrRNA基因扩增测序（具体步骤见附录A）
将序列在Genbank数据库或中
国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据房库中棒形杆菌16SrRNA基因序列相似性大于97%，则进行7.3操作。
7.3gyrB基因序列的扩增
利用通用引物进行gyrB基因序列扩增测序（具体步骤见附录B）。7.4序列分析
4种检疫性棒形杆菌的gyrB基因参考序列参见附录C。将g.yrB基因序列在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对分析，采用邻接法构建基于g.yrB基因序列的NJ树。结果判定
16SrRNA基因序列长度大于1200bp，在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中棒形杆菌16SrRNA基因序列同源性大于97%，则判定该菌为棒2
形杆菌。
SN/T 4877.1—2017
gyrB基因序列长度大于500bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中密执安棒形杆菌某亚种的gyrB基因序列同源性大于98%，且在NJ树中聚在同一分支，则初步判定为该棒形杆菌为该亚种。若判定为目标检疫性棒形杆菌，有相应标准的需要根据标准方法（SN/T1135.5或SN/T2666或SN/T2568)进行最终鉴定，无相应标准的按照常规细菌鉴定方法进行最终鉴定9样品保存
9.1样品保存
分离并最终鉴定为检疫性目标细菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记记和经手人签字后置于4℃
低温冰箱中保存，定期（30天～60天）转接，必要时冻干后长期保存。结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片地点、方法和结果等，并要有实验人员测序序列需要保存电子文件。
SN/T4877.1—2017
A.1引物序列
附录A
（规范性附录）
16S rRNA基因扩增程序
16sF-LYP-3:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-316sR-LYP-3:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGACGGGCGGTGTGTRCA-3注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（R=G或A)。A.2PCR体系及扩增程序
推荐用50μL体系，采用商品化的PCRPremix进行PCR扩增，反应体系中引物浓度为200nmol/L，DNA模板量为10ng~100ng。
PCR反应程序：94℃5min94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。该引物为通用引物，每次PCR反应应做空白对照，以确认是否污染。A.3电泳及测序
取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：约1200bp左右。测序引物为M13-47及RV-M(或M13-48)。
B.1引物序列
附录B
（规范性附录）
gyrB基因扩增程序
SN/T4877.1—2017
GyrbclaF:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGA-3GyrbclaR:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGACCTCGGTGTTGCCSARCTT-3注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（R=G或A，S=G或C)。B.2
PCR体系及扩增程序
推荐用50μLPCR反应体系，采用商品化的PCRPremix，反应体系中引物浓度为200nmol/L，DNA模板量为10ng100ng。
反应程序：94℃2min；94℃30s，60℃30s.72℃1min，35个循环；72℃8min。该引物为通用引物，每次PCR反应应做空对照，以确认是否污染。B.3www.bzxz.net
电泳测序
取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：530bp，由于添加了测序引物，在电泳显示为600bp左右。测序引物为M13-47及RV-M（或M13-48）。SN/T4877.1—2017
附录C
（资料性附录）
检疫性棒形杆菌gyrB基因参考序列>Clavibactermichiganensis subsp.insidiosus(ATCC10253)TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCCTGCGCGCGCGGTTCCAGCAGATGGCGTTCCTCAACAAGGGCCTGGCCCTCACGCTGCACGATGAGCGCGGCGTGGACGGCGCGGAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTCTATGAGCGCGGCCTCGTCGACTACGTCGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGAGGTCGTCAACGCCGACGTCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACACGG
TCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTGCACACGTACGCGAACACCATCAATACGCACGAGGGGGGCACOCCACGAGGAGGGCTTCCGCGCG
GCGCTCACCACGCTGGTGAACCGCTACGCCCGCGAGAACAAGCTGCTCCGCGAGAAGGACGAGAACCTCACGGGCGACGACGTGCGCGAGGGCCTCAACCGCCGTCATCTCCGTGAAGCTCGGC
GAGCCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTCGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
subsp.michiganensis(QB0725)
>Clavibacter michiganensis
TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCOTCCGCGCGCGCTTCCAGCAGAT
GGCGTTCCTCAACAAGGGGC
CGAGCGCGAGGTGGACGGCGCC
GAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTCTACGAGCGGGGCCTCGTCGACTACGTGGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGA
CGTCAACGCCGACGT
TCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACAC
GGTCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTCCACACCTACGCGAACACCATCAACACGCACGCGGCGCTCACCACGCTCGTCA
CGAGAACCTCACGGGCGACGA
GGCGAGCCGCAGTTCGAGGG
AAATTGTTATCC
>Clavibacter michiganensis sulCCGCT
GGGCGGCA
CGCACGAGGAGGGGTTCCGCG
GCGCGAGAACAAGCTGCTCCGCGAGAAGGAGGGCCTCACGGCCGTCATCTCGGTGAAGCTCCGTCCGCGA
CCAAGACCAAGTTCGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGBensisCATO
TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCCTGCGCGCGCGGTTCCAGCAGATGGCGTTCCTCAACAAGGGCCTGGCCCTCACGCTGCACGACGAGCGCGAGGTCGACGGCGCGGAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTCTACGAGCGCGGCCTCGTCGACTACGTGGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGAGGTCGTCAACGCCGACGTCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACACGGTCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTGCACACCTACGCGAACACCATCAACACGCACGAGGGCGGCACCCACGAGGAGGGCTTCCGCGCGGCGCTCACCACGCTGGTGAACCGCTACGCGCGGGAGAACAAGCTCCTCCGCGAGAAGGACGAGAACCTGACGGGCGACGACGTCCGCGAGGGCCTCACCGCCGTCATCTCCGTGAAGCTCGGCGAGCCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTCGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
>Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus (ICMP9733)TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCCTGCGCGCGCGCTTCCAGCAGAT6
SN/T4877.1—2017
GGCGTTCCTTAACAAGGGCCTCGCCCTCACGCTGCACGATGAGCGCGAGGAGGACGGCGCCGAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTGTACGAGCGGGGCCTCGTCGACTACGTCGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGAGGTCGTCAACGCCGACGTCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACACGGTCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTCCACACGTACGCGAACACCATCAACACGCACGAGGGCGGCACGCACGAGGAGGGGTTCCGCGCGGCGCTCACCACGCTCGTCAACCGCTATGCGCGCGAGAACAAGCTGCTGCGTGAGAAGGACGAGAACCTCACCGGCGACGATGTCCGCGAGGGCCTCACCGCCGTGATCTCCGTGAAGCTCGGCGAGCCGCAGTTCGAGGGCCAGACGAAGACGAAGCTGGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
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基因条形码筛查方法
第1部分：检疫性棒形杆菌
DNA barcoding screening method-Part 1:Quarantine Clavibacter spp2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体。
本部分为SN/T4877的第1部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T4877.1—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黄岛出人境检验检疫局，中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。
本部分主要起草人：赵文军、夏明星、张凤娟、田茜、高文娜、冯建军、廖芳1范围
基因条形码筛查方法
第1部分：检疫性棒形杆菌
SN/T4877.1—2017
SN/T4877的本部分规定了检疫性棒形杆菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于检疫性棒形杆菌的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件SN/T1135.5马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法SN/T2568番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法SN/T2666首细菌性萎蒿病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码
生物体内能够代表该物种的，标准的有足够变异的，易扩增且相对较短的DNA片段，3.2
16SrRNA基因
原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，基因序列具有高度的保守性和特异性。16SRNA基因序列是细菌检测鉴定与分类研究中应用最多的基因序列，是细菌种间鉴定的重要依据。
gyrB基因
编码DNA解旋酶B亚单位的基因，是单拷贝的看家基因，普遍存在于各种细菌中，本部分中gyrB基因序列作为细菌条形码基因进行种及种下阶元的筛查鉴定。4棒形杆菌的基本信息
学名：Clavibacter
分类地位：细菌界（Bacteria），放线菌门（Actinobacteria），放线菌纲（Actinobacteria），放线菌目（Actinomycetales），微杆菌科（Microbacteriaceae）。目前棒形杆菌属的植物病原细菌只有一个种密执安棒形杆菌（Clavibactermichiganensis），该种包括如下5个亚种，其中前4个为进境植物检疫性有害生物：
SN/T4877.1-2017
首细菌性萎焉病菌（Clavibactermichiganensissubsp.insidiosus）；番茄溃疡病菌（Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis）：玉米内州菱為病菌（Clavibactermichiganensis subsp.nebraskensis）；马铃薯环腐病菌（Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus）；小麦细菌性花叶病菌（Clavibactermichiganensissubsp.tessellarius）。5方法原理
根据细菌核糖体16SrRNA基因序列分析确定目标细菌是否为棒形杆菌，然后根据gyrB基因序列分析确定目标细菌为某个亚种。仪器设备和主要试剂
6.1仪器设备
生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、核酸蛋白分析仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统、冰箱等。
6.2主要试剂
细菌DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水.DNAmarker等7筛查鉴定方法
7.1DNA制备
对细菌进行液体培养或平板培养，利用商品化细菌DNA提取试剂盒制备细菌总DNA，测定DNA浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用7.216SrRNA基因序列扩增测序
利用通用引物进行16SrRNA基因扩增测序（具体步骤见附录A）
将序列在Genbank数据库或中
国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对，若与数据房库中棒形杆菌16SrRNA基因序列相似性大于97%，则进行7.3操作。
7.3gyrB基因序列的扩增
利用通用引物进行gyrB基因序列扩增测序（具体步骤见附录B）。7.4序列分析
4种检疫性棒形杆菌的gyrB基因参考序列参见附录C。将g.yrB基因序列在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库比对分析，采用邻接法构建基于g.yrB基因序列的NJ树。结果判定
16SrRNA基因序列长度大于1200bp，在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中棒形杆菌16SrRNA基因序列同源性大于97%，则判定该菌为棒2
形杆菌。
SN/T 4877.1—2017
gyrB基因序列长度大于500bp，在中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，若与数据库中密执安棒形杆菌某亚种的gyrB基因序列同源性大于98%，且在NJ树中聚在同一分支，则初步判定为该棒形杆菌为该亚种。若判定为目标检疫性棒形杆菌，有相应标准的需要根据标准方法（SN/T1135.5或SN/T2666或SN/T2568)进行最终鉴定，无相应标准的按照常规细菌鉴定方法进行最终鉴定9样品保存
9.1样品保存
分离并最终鉴定为检疫性目标细菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记记和经手人签字后置于4℃
低温冰箱中保存，定期（30天～60天）转接，必要时冻干后长期保存。结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片地点、方法和结果等，并要有实验人员测序序列需要保存电子文件。
SN/T4877.1—2017
A.1引物序列
附录A
（规范性附录）
16S rRNA基因扩增程序
16sF-LYP-3:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGCGTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-316sR-LYP-3:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGACGGGCGGTGTGTRCA-3注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（R=G或A)。A.2PCR体系及扩增程序
推荐用50μL体系，采用商品化的PCRPremix进行PCR扩增，反应体系中引物浓度为200nmol/L，DNA模板量为10ng~100ng。
PCR反应程序：94℃5min94℃1min，60℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。该引物为通用引物，每次PCR反应应做空白对照，以确认是否污染。A.3电泳及测序
取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：约1200bp左右。测序引物为M13-47及RV-M(或M13-48)。
B.1引物序列
附录B
（规范性附录）
gyrB基因扩增程序
SN/T4877.1—2017
GyrbclaF:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGA-3GyrbclaR:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGACCTCGGTGTTGCCSARCTT-3注：下划线部分为测序引物，全部序列都要合成（R=G或A，S=G或C)。B.2
PCR体系及扩增程序
推荐用50μLPCR反应体系，采用商品化的PCRPremix，反应体系中引物浓度为200nmol/L，DNA模板量为10ng100ng。
反应程序：94℃2min；94℃30s，60℃30s.72℃1min，35个循环；72℃8min。该引物为通用引物，每次PCR反应应做空对照，以确认是否污染。B.3www.bzxz.net
电泳测序
取5μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，PCR产物大小：530bp，由于添加了测序引物，在电泳显示为600bp左右。测序引物为M13-47及RV-M（或M13-48）。SN/T4877.1—2017
附录C
（资料性附录）
检疫性棒形杆菌gyrB基因参考序列>Clavibactermichiganensis subsp.insidiosus(ATCC10253)TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCCTGCGCGCGCGGTTCCAGCAGATGGCGTTCCTCAACAAGGGCCTGGCCCTCACGCTGCACGATGAGCGCGGCGTGGACGGCGCGGAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTCTATGAGCGCGGCCTCGTCGACTACGTCGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGAGGTCGTCAACGCCGACGTCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACACGG
TCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTGCACACGTACGCGAACACCATCAATACGCACGAGGGGGGCACOCCACGAGGAGGGCTTCCGCGCG
GCGCTCACCACGCTGGTGAACCGCTACGCCCGCGAGAACAAGCTGCTCCGCGAGAAGGACGAGAACCTCACGGGCGACGACGTGCGCGAGGGCCTCAACCGCCGTCATCTCCGTGAAGCTCGGC
GAGCCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTCGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
subsp.michiganensis(QB0725)
>Clavibacter michiganensis
TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCOTCCGCGCGCGCTTCCAGCAGAT
GGCGTTCCTCAACAAGGGGC
CGAGCGCGAGGTGGACGGCGCC
GAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTCTACGAGCGGGGCCTCGTCGACTACGTGGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGA
CGTCAACGCCGACGT
TCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACAC
GGTCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTCCACACCTACGCGAACACCATCAACACGCACGCGGCGCTCACCACGCTCGTCA
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AAATTGTTATCC
>Clavibacter michiganensis sulCCGCT
GGGCGGCA
CGCACGAGGAGGGGTTCCGCG
GCGCGAGAACAAGCTGCTCCGCGAGAAGGAGGGCCTCACGGCCGTCATCTCGGTGAAGCTCCGTCCGCGA
CCAAGACCAAGTTCGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGBensisCATO
TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCCTGCGCGCGCGGTTCCAGCAGATGGCGTTCCTCAACAAGGGCCTGGCCCTCACGCTGCACGACGAGCGCGAGGTCGACGGCGCGGAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTCTACGAGCGCGGCCTCGTCGACTACGTGGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGAGGTCGTCAACGCCGACGTCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACACGGTCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTGCACACCTACGCGAACACCATCAACACGCACGAGGGCGGCACCCACGAGGAGGGCTTCCGCGCGGCGCTCACCACGCTGGTGAACCGCTACGCGCGGGAGAACAAGCTCCTCCGCGAGAAGGACGAGAACCTGACGGGCGACGACGTCCGCGAGGGCCTCACCGCCGTCATCTCCGTGAAGCTCGGCGAGCCGCAGTTCGAGGGCCAGACCAAGACCAAGTTCGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
>Clavibactermichiganensis subsp.sepedonicus (ICMP9733)TTTCCCAGTCACGACACCGTCGAGTTCGACTACGACACCCTGCGCGCGCGCTTCCAGCAGAT6
SN/T4877.1—2017
GGCGTTCCTTAACAAGGGCCTCGCCCTCACGCTGCACGATGAGCGCGAGGAGGACGGCGCCGAGCACCGCACCGAGAAGTTCCTGTACGAGCGGGGCCTCGTCGACTACGTCGAGCACCTCGTGAAGGCGAAGAAGACCGAGGTCGTCAACGCCGACGTCATCGCCTTCGAGTCCGAGGACACGGTCAAGAAGATCAGCCTCGAGGTCGCGATGCAGTGGACCACCTCCTACACGGAGAGCGTCCACACGTACGCGAACACCATCAACACGCACGAGGGCGGCACGCACGAGGAGGGGTTCCGCGCGGCGCTCACCACGCTCGTCAACCGCTATGCGCGCGAGAACAAGCTGCTGCGTGAGAAGGACGAGAACCTCACCGGCGACGATGTCCGCGAGGGCCTCACCGCCGTGATCTCCGTGAAGCTCGGCGAGCCGCAGTTCGAGGGCCAGACGAAGACGAAGCTGGGCAACACCGAGGTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
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