SN/T4877.1—2017 基因条形码筛查方法 第1部分：检疫性棒形杆菌 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体。本部分为SN/T4877的第1部分。本部分按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利，发布机构不承担识别专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国黄岛出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、夏明星、张凤娟、田茜、高文娜、冯建军、廖芳。 1 范围 本部分规定了检疫性棒形杆菌DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于检疫性棒形杆菌的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期版本适用。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 SN/T1135.5 马铃薯环腐病菌检疫鉴定方法 SN/T2568 番茄细菌性溃疡病菌检疫鉴定方法 SN/T2666 细菌性萎蔫病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 3.1 DNA条形码：生物体内能够代表该物种的标准DNA片段，具有足够变异、易扩增且相对较短。 3.2 16S rRNA基因：原核生物核糖体30S小亚基组成部分，具有高度保守性与特异性，是细菌鉴定与分类的重要依据。 3.3 gyrB基因：编码DNA解旋酶B亚单位的单拷贝看家基因，在本部分中作为条形码基因用于种及种下阶元筛查鉴定。 4 棒形杆菌的基本信息 学名：Clavibacter。 分类地位：细菌界（Bacteria），放线菌门（Actinobacteria），放线菌纲（Actinobacteria），放线菌目（Actinomycetales），微杆菌科（Microbacteriaceae）。 目前棒形杆菌属植物病原细菌只有密执安棒形杆菌（Clavibacter michiganensis），包括5个亚种，其中前4个为进境植物检疫性有害生物： （1）细菌性萎蔫病菌（Clavibacter michiganensis subsp. insidiosus）； （2）番茄溃疡病菌（Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis）； （3）玉米相关病菌（Clavibacter michiganensis subsp. nebraskensis）； （4）马铃薯环腐病菌（Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus）； （5）小麦细菌性花叶病菌（Clavibacter michiganensis subsp. tessellarius）。 5 方法原理 根据16S rRNA基因序列分析确定目标细菌是否为棒形杆菌，再根据gyrB基因序列分析确定具体亚种。 6 仪器设备和主要试剂 6.1 仪器设备：生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、核酸蛋白分析仪、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统、冰箱等。 6.2 主要试剂：细菌DNA提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA marker等。 7 筛查鉴定方法 7.1 DNA制备 对细菌进行液体或平板培养，使用商业化DNA提取试剂盒制备总DNA，测定浓度与纯度后保存于-20℃备用。 7.2 16S rRNA基因序列扩增测序 使用通用引物进行16S rRNA基因扩增与测序（具体见附录A）。将序列在GenBank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中比对，若与棒形杆菌16S rRNA基因序列相似性大于97%，则进行7.3步骤。 7.3 gyrB基因序列扩增