SN/T 3457-2012
基本信息
标准号： SN/T 3457-2012
中文名称：植物病毒分子生物学检测规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3457-2012.Criterion on detection of plant virus by molecular biology.
1范围
SN/T 3457规定了进出境植物检疫工作中植物病毒.类病毒的分子生物学检测方法与要求。
SN/T 3457适用于进出境植物及植物产品中植物病毒、类病毒的分子生物学检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1聚合酶链式反应polymerase chain-reaction;PCR
简称PCR技术。模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
3.2反转录-聚合酶链式反应reverse transcription /polymerase chaip reaction; RT-PCR
简称RT-PCR,以提取组织或其他材料中的RNA为模板,采用Oligo(dT)、随机引物或特异性引物,在反转录酶和适宜的反应条件下,RNA被反转录成QDNA,然后再以cDNA作为模板,进行PCR扩增。
1范围
SN/T 3457规定了进出境植物检疫工作中植物病毒.类病毒的分子生物学检测方法与要求。
SN/T 3457适用于进出境植物及植物产品中植物病毒、类病毒的分子生物学检测。
2规范性引用文件
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SN/T 1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1聚合酶链式反应polymerase chain-reaction;PCR
简称PCR技术。模板DNA先经高温变性为单链,两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火,在DNA聚合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸(dNTP)为底物,使退火引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位于两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
3.2反转录-聚合酶链式反应reverse transcription /polymerase chaip reaction; RT-PCR
简称RT-PCR,以提取组织或其他材料中的RNA为模板,采用Oligo(dT)、随机引物或特异性引物,在反转录酶和适宜的反应条件下,RNA被反转录成QDNA,然后再以cDNA作为模板,进行PCR扩增。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3457-—2012
植物病毒分子生物学检测规范
Criterion on detection of plant virus by molecular biology2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3457-—2012
本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北仑出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：梁新苗、邓丛良、郭立新、陈红运、周琦、边勇、汪万春、李桂芬、郑耘、朱水芳、李建光。
1范围
植物病毒分子生物学检测规范
SN/T3457-2012Www.bzxZ.net
本标准规定了进出境植物检疫工作中植物病毒、类病毒的分子生物学检测方法与要求。本标准适用于进出境植物及植物产品中植物病毒、类病毒的分子生物学检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
聚合酶链式反应 polymerase chain-reaction;PCR简称PCR技术。模板DNA先经高变性为单链，两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物，使退火引物得以段互补序列发生退火，在DNA聚
延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
反转录-聚合酶链式反应
reverse transcription/polymerase chaif reaction;RT-PCR简称RT-PCR，以提取组织或其他材料中的RNA为模板，采用Oligo(dT)、随机引物或特异性引物，在反转录酶和适宜的反应条件下，RNA被反转录成DNA，然后再以cDNA作为模板，进行PCR扩增。
实时荧光PCRreal-timefluoescencePCR在常规PCR的基础上，在引物对所扩增序列段中，加人一条特异性的寡核苷酸荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Tag酶的5\-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增条DNA链，就有一个荧光分子游离产生荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。1
SN/T3457-2012
核酸杂交技术nucleicacidhybridization两段来源不同的核酸分子（两种单链DNA分子之间、一种单链DNA分子与一种单链RNA分子或两种单链RNA分子之间)具有一定的同源性，在去掉变性条件后，互补的区段能够退火复性形成异质双链分子。这一过程称为核酸杂交。3.6
核酸序列测定nucleic acid sequencing通过化学方法测定基因片段中的核苷酸排列顺序，目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert发明的化学降解法。3.7
基因芯片技术gene-chipdetection又称DNA芯片技术，是指将探针DNA有序地固定于玻片或其他固相载体上，测试样品的核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的探针按碱基配对原理同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然后通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，用计算机软件进行数据的比较和分析，从而获取样品分子的数量和序列信息。4原理
植物病毒是一类由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生病原物，可分为DNA病毒和RNA病毒两大类。PCR方法、RT-PCR方法、实时荧光PCR方法、核酸杂交、核酸序列测定和基因芯片技术，都是利用核酸碱基配对的性质，对样品中的病毒核酸进行检测。大部分植物病毒的核酸是RNA，要应用上述方法检测RNA类型的病原体，需要先提取样品中的总RNA，将RNA反转录成cDNA之后，才能以此为模板进行后续的检测。如果待检测的病毒为DNA病毒，则无需进行反转录，直接以提取的DNA为模板即可进行后续检测。5实验总体要求及工作人员操作要求植物病毒分子生物学检测实验室的总体要求及工作人员操作要求按照SN/T1193。6安全防护
从事植物病毒分子生物学检测的工作人员在整个实验操作过程中要戴手套，在强光、有害射线环境工作时要佩戴防护眼镜，穿防护服或采用其他安全有效的措施。7样品制备
7.1样品分类
根植物及其产品的外观形态，可将其分为种子类、鳞球（块）茎类和种苗类样品，依据这三类样品的特性，制定相应的样品处理方法。所取的样品应及时进行检测或放在低温冰箱中保存。样品处理和检测操作需在符合SN/T1193要求的实验室内进行，7.2种子类
随机抽取种子样品，进行表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养血中，在适宜的发芽温度条2
SN/T3457-2012
件下催芽，直至长出第一对真叶（发芽时间大约一周）；或者在消毒的土壤中直接种植，直至长出第一对真叶作为检测样品。取适量叶片，放人洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状。也可视待检测病毒种类，直接用种子作为样品进行检测。7.3鳞球（块)茎类
将鳞球茎或块茎芽眼（处于休眠状态的还要打破休眠）在生物培养箱中催芽，直至长出叶片。也可剥去外部鳞片取内部萌发叶片。取适量叶片或植物组织，放人洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状。
7.4种苗类
对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片，对于无症状的种苗类样品选取适量。样品的叶片，放入洁净的研钵中，加液氮后迅速研磨成细粉状。8试验设计
在试验中设计阳性对照、阴性对照、空白对照作为质量控制，并根据送检样品的数量设置样品的重复次数，每份样品至少设置2个重复。9核酸制备
植物病毒可分为DNA病毒和RNA病毒两大类。如果待检测的病毒为RNA病毒，若要应用分子生物学方法进行检测，需要先提取样品中的总RNA，将RNA反转录成cDNA之后，方可以此CDNA为模板进行后续的检测。如果待检测的病毒为DNA病毒，则无需进行反转录，直接提取样品中的总DNA即可进行后续检测。
常规的核酸提取方法参照附录A，也可使用商品化提取试剂盒。每个样品都应取2～3个平行样，进行重复性实验。
10核酸提取质量检查
10.1总DNA样品质量的检查
10.1.1琼脂糖凝胶电泳
植物总DNA样品电泳后应呈现一条迁移率很小的整齐条带。如果在指示前沿溴酚蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存在RNA杂质，若所提总DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而是弥散一片，则表明总DNA样品已严重降解。10.1.2分光光度（紫外吸收）法将待测DNA样品按适当倍数进行稀释，在紫外分光光度计上分别读出260nm和280nm的光密度值及其比值。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=OD26oX50X核酸稀释倍数。在紫外分光光度计下检查，纯的总DNA样品溶液的OD250/OD280的比值约为1.8，OD260/ODz3的比值应大于2.0。若OD260/OD280的比值大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD2的比值小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸，氨基酸，酚等。3
SN/T3457-2012
10.2总RNA样品质量的检查
10.2.1变性琼脂糖凝胶电泳
经变性凝胶电泳，完整的总RNA样品应出现三条带，分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。其中，28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的两倍，表明总RNA样品比较完整，基本无降解。反之则说明28SrRNA已降解为18SrRNA。如无清晰条带，表明总RNA样品已严重降解。如果在点样孔内或孔附近有条带，则表明总RNA样品中有DNA污染。总RNA样品中，28SrRNA和18SrRNA在变性凝胶上的迁移率相当于分子量5.1kb和2.0kbRNA的迁移率。10.2.2分光光度（紫外吸收）法将待测RNA样品按适当倍数进行稀释，在紫外分光光度计上分别读出260nm和280nm的光密度值及其比值。RNA浓度计算公式：RNA浓度（ng/μL）=（Dz6oX40X核酸稀释倍数。纯的总RNA样品溶液其ODaGo/ODzRo的比值应介于17至20OD2/OD2.的比值应大于2.0。总RNA样品溶液其OD260/OD28的比值小于1.7，说明有蛋白或苯酚污染。比值失于2.0，则可能被异硫氰酸胍等污染。11分子生物学检测方法的确定
11.1分子生物学检测方法
植物病毒的分子生物学检测方法包括PCR、RT-PCR、实时荧光PCR、核酸杂交、核酸序列测定和基因芯片等多种检测方法。目前较常用的是PCR方法和实时荧光PCR方法。以PCR为基础的分子生物学检测，首先要针对病毒相对保守的序列（通常是外壳蛋自（CP)序列）合成特异性引物，般需20～30个核苷酸。引物设计可以根据某个属病毒共同的保守序列设计1对简并引物，用于检测该属病毒的所有成员；也可以根据某种病毒特有的序列设计1对引物检测特定病毒的所有成员；也可以根据病毒某个株系特有的序列设计1对引物检测特定的株系11.2分子生物学检测方法的确定原则应遵循快速、准确和简便的原则。植物病毒分子生物学检测所使用的方法应是公开发表的、并经过相关专家确认和一定数量的实验室验证。同时，这些方法的可操作性（包括操作的难易、花费时间和速度)以及对操作人员所必须具备的相关知识和经验都应具有普遍适用性；仪器的选用以及对照样品、试剂等的获取都应具有普遍适用性。如有行业标准或国家标准明确规定的分子生物学检测方法，推荐参照标准方法。针对待检测植物病毒，已公开报道或易于筛选出特异性引物的，可选用特异性引物进行PcR法、RT-PCR法完成分子生物学检测；症状区别不明显或隐症的植物病毒，可采用核酸杂交、实时荧光PCR法；需要进行株系区分的，可采用核酸序列测定方法；对于多个植物病毒的同时检测，可采用基因芯片方法。
12结果判定
12.1对有标准规定的植物病毒
直接采用标准进行结果判定
12.2对无标准规定的植物病毒
视所采用的以下具体方法进行结果判定。4
SN/T3457—2012
12.2.1普通PCR法：如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照致的所测病毒的扩增条带，判定结果为阳性；阴性对照、空白对照和阳性对照正确，样品无扩增条带，判定结果为阴性。12.2.2RT-PCR法：结果判定方法同普通PCR法。12.2.3实时荧光PCR法：在阳性对照阴性对照和空白对照正确的前提下：-Ct值大于或等于40时，则判定未检测到病毒：—Ct值小于或等于35时，则判定检测到病毒；一Ct值介于35与40之间时，为疑似阳性，需要重新进行测试，或采用其他方法进行验证。12.2.4核酸杂交：如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的杂交信号，判定结果为阳性。阴性对照、空白对照和阳性对照正确，并且样品无杂交信号，判定结果为阴性。12.2.5核酸序列测定：将待测样品的核苷酸序列进行-blast-比对根据国际病毒分类委员会确定的划分标准进行判定
12.2.6基因芯片技术：在阴性对照阳性对照、空白对照均正常的前提下：每个检测点信号值=该点荧光强度值一该点背景强度值；一空白对照平均信号值=2个空白对照点信号值的平均值阴性对照平均信号值一2个阴性对照点信号值的平均值一空白对照平均信号值每条探针的每个检测点信号值一空白对照平均信号值>2倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性；
一每条探针的两个重复检测点均为阳性即判读该条探针为阳性；每种病毒的一条以上探针为阳性即判读待测样品含有该种病毒13废弃物处理及防扩散措施
植物病毒分子生物学检测完成后的废弃物应进行高温消毒后再做处理，有毒有害废物应经过除害再做处理，处理要符合环保要求。樟测后的余样，如涉及检疫性有害生物的应烧毁或高压灭菌处理，以防止植物病毒随余样进行扩散。14检测结果的复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。和真实性，必要时进行复核实验。15样品保存
主要考察实验记录、图片等资料的完整性分子生物学检测结果需保存相关电泳结果图片、扩增曲线图片或待测植物病毒的碱基序列片段。对于检测结果为阳性的样品，应保存在适合的条件下，以备复检、谈判和仲裁，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。种子类样品保存在干燥条件下或4℃冰箱内：生长苗木保存在隔离温室中：其他繁殖材料可取实验样品在一20℃或一80℃冰箱妥善保存。保存样品要做好登记和标记工作。保存期满后，需经灭活后方可处理。5
SN/T3457—2012
A.1试剂
附录A
（资料性附录）
植物病毒样品核酸的提取方法
除特别规定外，核酸的提取用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的-一级水。A.1.1总RNA提取试剂:Trizol Reagent。A.1.2三氯甲烷。
A.1.3异丙醇。
A.1.470%乙醇。
A.1.5无水乙醇。
A.1.6无RNase水：经0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯）处理的双蒸水或商品无RNase水。A.1.7
研磨冲液：NazHPO.·12H2O3.58g、KHzPO.0.27g、NaCI8g、KCI0.2g、BSA2.0g溶于1000mL去离子水，调节pH值为7.5。A.1.8清洗缓冲液；0.05%DEPC处理的PBS缓冲液。A.1.91mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0)：称取121.1gTris，溶于800mL水中，搅拌，加人浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至8.0，分装后高压灭菌备用。A.1.100.5mol/LEDTA(pH8.0)：在800mLHzO中加人186.1gNaz-EDTA·2H2O,在磁力搅拌器剧烈揽拌，用NaOH调节溶度pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
A.1.11植物总DNA提取缓冲液：量取100mL1mol/LTris-Cl,50ml0.5mol/LEDTA，称取5.0g十二烷基磁酸钠（SDS)，16.848g氟化钠，定容至1L，分装灭菌备用。A.1.12聚乙烯吡略咯烷酮（PVP）。3Tris饱和酚。
A.1.14RNA酶(10 μg/mL)。
A.1.15醋酸钾（5mol/L）。
A.1.16TE缓冲液：分别加人1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL和0.5mol/I.EDTA(pH8.0)溶液2mL，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。A.2核酸提取方法
A.2.1总RNA的提取
A.2.1.1Trizol法
A.2.1.1.1取0.1g研磨物并迅速移人1.5mL离心管中，加人1mLTrizolReagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000g，离心10min。A.2.1.1.2取上清液，15℃～30℃，放置5min；加人0.2mL三氯甲烷，用手剧烈振荡（勿旋涡振荡），约15s15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000g离心15min。A.2.1.1.3小心吸取约为600μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500μL异丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min。
SN/T3457—2012
A.2.1.1.42℃~8℃，12000g，离心10min；去除上清液，沉淀中加人1mL75%乙醇，洗涤；2℃~8℃.7500g离心5min
A.2.1.1.5去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30μL～50μL无RNase的水中。A.2.1.2纳米磁珠法
A.2.1.2.1取0.1g样品，用剪刀剪碎，放人研钵。加人1mL研磨缓冲液，充分研磨捣碎。A.2.1.2.2取研磨液1mL到1.5mL的离心管中，4℃，8000g离心5min。A.2.1.2.3取50μL纳米磁珠到1.5mL的离心管中，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃除上清液。
A.2.1.2.4向A.2.1.2.3中的离心管中加人150μL清洗缓冲液，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠弃除上清液。重复操作两次。
A.2.1.2.5取A.2.1.2.2的上清液到A.2.1.2.4中的离心管中，涡旋混匀，室温下结合5min~10min，期间颠倒混勾几次。
A.2.1.2.6将离心管置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃除上清液。A.2.1.2.7向离心管中加入200μL清洗缓冲液，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃除上清液。A.2.1.2.8向离心管中加人50μL无RNase的水，重新悬浮纳米磁珠。A.2.1.2.9离心管置于95℃，加热5min，使病毒粒子裂解，释放病毒RNA；立即置于冰上。A.2.1.2.10将含有病毒RNA的上清液转移至新的无RNase的1.5mL离心管中，一80℃冰箱保存备用。
样品总RNA的提取也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取。A.2.2总DNA的提取
A.2.2.1取0.1g研磨物并迅速移人1.5mL的离心管中，加人600μL预热的提取缓冲液，再加人200μL20%的PVP，混匀，65℃保温20min，期间摇动数次。A.2.2.2加人等体积的酚-三氯甲烷，轻轻颠倒混勾。10000r/min离心10min。A.2.2.3取上清液，加入2/3倍体积的冰冷的异丙醇，混匀。10000r/min离心10min。去掉上清液中的异丙醇，此时管底有白色沉淀。A.2.2.4向白色沉淀中加人10±L的RNA酶（10mg/mL），37℃保温30min。A.2.2.5加人1mL醋酸钾（5mol/L）。于10000r/min离心10min。A.2.2.6去掉上清液，保留沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀3次，干燥。A.2.2.7用100μLTE溶解沉淀，作为PCR反应的模板，一20℃保存备用。样品总DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒提取。
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Criterion on detection of plant virus by molecular biology2012-12-12发布
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国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3457-—2012
本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北仑出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：梁新苗、邓丛良、郭立新、陈红运、周琦、边勇、汪万春、李桂芬、郑耘、朱水芳、李建光。
1范围
植物病毒分子生物学检测规范
SN/T3457-2012Www.bzxZ.net
本标准规定了进出境植物检疫工作中植物病毒、类病毒的分子生物学检测方法与要求。本标准适用于进出境植物及植物产品中植物病毒、类病毒的分子生物学检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
聚合酶链式反应 polymerase chain-reaction;PCR简称PCR技术。模板DNA先经高变性为单链，两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一合酶的作用下以四种脱氧核糖核酸（dNTP)为底物，使退火引物得以段互补序列发生退火，在DNA聚
延伸，然后不断重复变性、退火和延伸这一循环，使位两段已知序列之间的DNA片段呈几何倍数扩增。
反转录-聚合酶链式反应
reverse transcription/polymerase chaif reaction;RT-PCR简称RT-PCR，以提取组织或其他材料中的RNA为模板，采用Oligo(dT)、随机引物或特异性引物，在反转录酶和适宜的反应条件下，RNA被反转录成DNA，然后再以cDNA作为模板，进行PCR扩增。
实时荧光PCRreal-timefluoescencePCR在常规PCR的基础上，在引物对所扩增序列段中，加人一条特异性的寡核苷酸荧光探针，探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Tag酶的5\-3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增条DNA链，就有一个荧光分子游离产生荧光信号，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。3.4
Ct值cycle threshold
每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。1
SN/T3457-2012
核酸杂交技术nucleicacidhybridization两段来源不同的核酸分子（两种单链DNA分子之间、一种单链DNA分子与一种单链RNA分子或两种单链RNA分子之间)具有一定的同源性，在去掉变性条件后，互补的区段能够退火复性形成异质双链分子。这一过程称为核酸杂交。3.6
核酸序列测定nucleic acid sequencing通过化学方法测定基因片段中的核苷酸排列顺序，目前用于测序的技术主要有Sanger等发明的双脱氧链末端终止法和Maxam和Gilbert发明的化学降解法。3.7
基因芯片技术gene-chipdetection又称DNA芯片技术，是指将探针DNA有序地固定于玻片或其他固相载体上，测试样品的核酸分子经过标记，与固定在载体上的DNA阵列中的探针按碱基配对原理同时进行杂交，洗去未互补结合的片段。然后通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，检测杂交信号强度，用计算机软件进行数据的比较和分析，从而获取样品分子的数量和序列信息。4原理
植物病毒是一类由核酸和蛋白质外壳组成的具有侵染活性的细胞内寄生病原物，可分为DNA病毒和RNA病毒两大类。PCR方法、RT-PCR方法、实时荧光PCR方法、核酸杂交、核酸序列测定和基因芯片技术，都是利用核酸碱基配对的性质，对样品中的病毒核酸进行检测。大部分植物病毒的核酸是RNA，要应用上述方法检测RNA类型的病原体，需要先提取样品中的总RNA，将RNA反转录成cDNA之后，才能以此为模板进行后续的检测。如果待检测的病毒为DNA病毒，则无需进行反转录，直接以提取的DNA为模板即可进行后续检测。5实验总体要求及工作人员操作要求植物病毒分子生物学检测实验室的总体要求及工作人员操作要求按照SN/T1193。6安全防护
从事植物病毒分子生物学检测的工作人员在整个实验操作过程中要戴手套，在强光、有害射线环境工作时要佩戴防护眼镜，穿防护服或采用其他安全有效的措施。7样品制备
7.1样品分类
根植物及其产品的外观形态，可将其分为种子类、鳞球（块）茎类和种苗类样品，依据这三类样品的特性，制定相应的样品处理方法。所取的样品应及时进行检测或放在低温冰箱中保存。样品处理和检测操作需在符合SN/T1193要求的实验室内进行，7.2种子类
随机抽取种子样品，进行表面消毒后，置于铺有吸水纸的白瓷盘或培养血中，在适宜的发芽温度条2
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件下催芽，直至长出第一对真叶（发芽时间大约一周）；或者在消毒的土壤中直接种植，直至长出第一对真叶作为检测样品。取适量叶片，放人洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状。也可视待检测病毒种类，直接用种子作为样品进行检测。7.3鳞球（块)茎类
将鳞球茎或块茎芽眼（处于休眠状态的还要打破休眠）在生物培养箱中催芽，直至长出叶片。也可剥去外部鳞片取内部萌发叶片。取适量叶片或植物组织，放人洁净的研钵中，加人液氮后迅速研磨成细粉状。
7.4种苗类
对于有症状的种苗类样品选取全部表现症状种苗类样品的叶片，对于无症状的种苗类样品选取适量。样品的叶片，放入洁净的研钵中，加液氮后迅速研磨成细粉状。8试验设计
在试验中设计阳性对照、阴性对照、空白对照作为质量控制，并根据送检样品的数量设置样品的重复次数，每份样品至少设置2个重复。9核酸制备
植物病毒可分为DNA病毒和RNA病毒两大类。如果待检测的病毒为RNA病毒，若要应用分子生物学方法进行检测，需要先提取样品中的总RNA，将RNA反转录成cDNA之后，方可以此CDNA为模板进行后续的检测。如果待检测的病毒为DNA病毒，则无需进行反转录，直接提取样品中的总DNA即可进行后续检测。
常规的核酸提取方法参照附录A，也可使用商品化提取试剂盒。每个样品都应取2～3个平行样，进行重复性实验。
10核酸提取质量检查
10.1总DNA样品质量的检查
10.1.1琼脂糖凝胶电泳
植物总DNA样品电泳后应呈现一条迁移率很小的整齐条带。如果在指示前沿溴酚蓝前有弥散的荧光区出现，则表明样品中存在RNA杂质，若所提总DNA样品在0.8%琼脂糖凝胶上不能形成清晰的条带，而是弥散一片，则表明总DNA样品已严重降解。10.1.2分光光度（紫外吸收）法将待测DNA样品按适当倍数进行稀释，在紫外分光光度计上分别读出260nm和280nm的光密度值及其比值。DNA浓度计算公式：DNA浓度（ng/μL）=OD26oX50X核酸稀释倍数。在紫外分光光度计下检查，纯的总DNA样品溶液的OD250/OD280的比值约为1.8，OD260/ODz3的比值应大于2.0。若OD260/OD280的比值大于1.9时，表明有RNA污染，小于1.6时表明有蛋白质或酚污染。OD260/OD2的比值小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸，氨基酸，酚等。3
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10.2总RNA样品质量的检查
10.2.1变性琼脂糖凝胶电泳
经变性凝胶电泳，完整的总RNA样品应出现三条带，分别为28SrRNA、18SrRNA、5SrRNA。其中，28SrRNA条带的亮度应约为18SrRNA条带亮度的两倍，表明总RNA样品比较完整，基本无降解。反之则说明28SrRNA已降解为18SrRNA。如无清晰条带，表明总RNA样品已严重降解。如果在点样孔内或孔附近有条带，则表明总RNA样品中有DNA污染。总RNA样品中，28SrRNA和18SrRNA在变性凝胶上的迁移率相当于分子量5.1kb和2.0kbRNA的迁移率。10.2.2分光光度（紫外吸收）法将待测RNA样品按适当倍数进行稀释，在紫外分光光度计上分别读出260nm和280nm的光密度值及其比值。RNA浓度计算公式：RNA浓度（ng/μL）=（Dz6oX40X核酸稀释倍数。纯的总RNA样品溶液其ODaGo/ODzRo的比值应介于17至20OD2/OD2.的比值应大于2.0。总RNA样品溶液其OD260/OD28的比值小于1.7，说明有蛋白或苯酚污染。比值失于2.0，则可能被异硫氰酸胍等污染。11分子生物学检测方法的确定
11.1分子生物学检测方法
植物病毒的分子生物学检测方法包括PCR、RT-PCR、实时荧光PCR、核酸杂交、核酸序列测定和基因芯片等多种检测方法。目前较常用的是PCR方法和实时荧光PCR方法。以PCR为基础的分子生物学检测，首先要针对病毒相对保守的序列（通常是外壳蛋自（CP)序列）合成特异性引物，般需20～30个核苷酸。引物设计可以根据某个属病毒共同的保守序列设计1对简并引物，用于检测该属病毒的所有成员；也可以根据某种病毒特有的序列设计1对引物检测特定病毒的所有成员；也可以根据病毒某个株系特有的序列设计1对引物检测特定的株系11.2分子生物学检测方法的确定原则应遵循快速、准确和简便的原则。植物病毒分子生物学检测所使用的方法应是公开发表的、并经过相关专家确认和一定数量的实验室验证。同时，这些方法的可操作性（包括操作的难易、花费时间和速度)以及对操作人员所必须具备的相关知识和经验都应具有普遍适用性；仪器的选用以及对照样品、试剂等的获取都应具有普遍适用性。如有行业标准或国家标准明确规定的分子生物学检测方法，推荐参照标准方法。针对待检测植物病毒，已公开报道或易于筛选出特异性引物的，可选用特异性引物进行PcR法、RT-PCR法完成分子生物学检测；症状区别不明显或隐症的植物病毒，可采用核酸杂交、实时荧光PCR法；需要进行株系区分的，可采用核酸序列测定方法；对于多个植物病毒的同时检测，可采用基因芯片方法。
12结果判定
12.1对有标准规定的植物病毒
直接采用标准进行结果判定
12.2对无标准规定的植物病毒
视所采用的以下具体方法进行结果判定。4
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12.2.1普通PCR法：如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照致的所测病毒的扩增条带，判定结果为阳性；阴性对照、空白对照和阳性对照正确，样品无扩增条带，判定结果为阴性。12.2.2RT-PCR法：结果判定方法同普通PCR法。12.2.3实时荧光PCR法：在阳性对照阴性对照和空白对照正确的前提下：-Ct值大于或等于40时，则判定未检测到病毒：—Ct值小于或等于35时，则判定检测到病毒；一Ct值介于35与40之间时，为疑似阳性，需要重新进行测试，或采用其他方法进行验证。12.2.4核酸杂交：如果阴性对照和空白对照正确，待测样品出现与阳性对照一致的杂交信号，判定结果为阳性。阴性对照、空白对照和阳性对照正确，并且样品无杂交信号，判定结果为阴性。12.2.5核酸序列测定：将待测样品的核苷酸序列进行-blast-比对根据国际病毒分类委员会确定的划分标准进行判定
12.2.6基因芯片技术：在阴性对照阳性对照、空白对照均正常的前提下：每个检测点信号值=该点荧光强度值一该点背景强度值；一空白对照平均信号值=2个空白对照点信号值的平均值阴性对照平均信号值一2个阴性对照点信号值的平均值一空白对照平均信号值每条探针的每个检测点信号值一空白对照平均信号值>2倍阴性对照平均信号值即判读该检测点为阳性；
一每条探针的两个重复检测点均为阳性即判读该条探针为阳性；每种病毒的一条以上探针为阳性即判读待测样品含有该种病毒13废弃物处理及防扩散措施
植物病毒分子生物学检测完成后的废弃物应进行高温消毒后再做处理，有毒有害废物应经过除害再做处理，处理要符合环保要求。樟测后的余样，如涉及检疫性有害生物的应烧毁或高压灭菌处理，以防止植物病毒随余样进行扩散。14检测结果的复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。和真实性，必要时进行复核实验。15样品保存
主要考察实验记录、图片等资料的完整性分子生物学检测结果需保存相关电泳结果图片、扩增曲线图片或待测植物病毒的碱基序列片段。对于检测结果为阳性的样品，应保存在适合的条件下，以备复检、谈判和仲裁，如涉及贸易纠纷则应保存到纠纷解决完毕。种子类样品保存在干燥条件下或4℃冰箱内：生长苗木保存在隔离温室中：其他繁殖材料可取实验样品在一20℃或一80℃冰箱妥善保存。保存样品要做好登记和标记工作。保存期满后，需经灭活后方可处理。5
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A.1试剂
附录A
（资料性附录）
植物病毒样品核酸的提取方法
除特别规定外，核酸的提取用试剂均为分析纯，实验用水为GB/T6682规定的-一级水。A.1.1总RNA提取试剂:Trizol Reagent。A.1.2三氯甲烷。
A.1.3异丙醇。
A.1.470%乙醇。
A.1.5无水乙醇。
A.1.6无RNase水：经0.1%DEPC(焦碳酸二乙酯）处理的双蒸水或商品无RNase水。A.1.7
研磨冲液：NazHPO.·12H2O3.58g、KHzPO.0.27g、NaCI8g、KCI0.2g、BSA2.0g溶于1000mL去离子水，调节pH值为7.5。A.1.8清洗缓冲液；0.05%DEPC处理的PBS缓冲液。A.1.91mol/LTris-HCl缓冲液（pH8.0)：称取121.1gTris，溶于800mL水中，搅拌，加人浓盐酸42mL，冷却至室温，用稀盐酸准确调整pH至8.0，分装后高压灭菌备用。A.1.100.5mol/LEDTA(pH8.0)：在800mLHzO中加人186.1gNaz-EDTA·2H2O,在磁力搅拌器剧烈揽拌，用NaOH调节溶度pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒），然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。
A.1.11植物总DNA提取缓冲液：量取100mL1mol/LTris-Cl,50ml0.5mol/LEDTA，称取5.0g十二烷基磁酸钠（SDS)，16.848g氟化钠，定容至1L，分装灭菌备用。A.1.12聚乙烯吡略咯烷酮（PVP）。3Tris饱和酚。
A.1.14RNA酶(10 μg/mL)。
A.1.15醋酸钾（5mol/L）。
A.1.16TE缓冲液：分别加人1mol/LTris-HCl(pH8.0)10mL和0.5mol/I.EDTA(pH8.0)溶液2mL，加水定容至1000mL。在103.4kPa(121℃）条件下灭菌20min。A.2核酸提取方法
A.2.1总RNA的提取
A.2.1.1Trizol法
A.2.1.1.1取0.1g研磨物并迅速移人1.5mL离心管中，加人1mLTrizolReagent，颠倒混匀，2℃~8℃，12000g，离心10min。A.2.1.1.2取上清液，15℃～30℃，放置5min；加人0.2mL三氯甲烷，用手剧烈振荡（勿旋涡振荡），约15s15℃~30℃，放置2min~3min；2℃~8℃，12000g离心15min。A.2.1.1.3小心吸取约为600μL的上层水相，勿扰动中间相和下层相。加500μL异丙醇混合上清液，15℃～30℃，放置10min。
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A.2.1.1.42℃~8℃，12000g，离心10min；去除上清液，沉淀中加人1mL75%乙醇，洗涤；2℃~8℃.7500g离心5min
A.2.1.1.5去除上清液，沉淀自然干燥后，将其溶于30μL～50μL无RNase的水中。A.2.1.2纳米磁珠法
A.2.1.2.1取0.1g样品，用剪刀剪碎，放人研钵。加人1mL研磨缓冲液，充分研磨捣碎。A.2.1.2.2取研磨液1mL到1.5mL的离心管中，4℃，8000g离心5min。A.2.1.2.3取50μL纳米磁珠到1.5mL的离心管中，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃除上清液。
A.2.1.2.4向A.2.1.2.3中的离心管中加人150μL清洗缓冲液，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠弃除上清液。重复操作两次。
A.2.1.2.5取A.2.1.2.2的上清液到A.2.1.2.4中的离心管中，涡旋混匀，室温下结合5min~10min，期间颠倒混勾几次。
A.2.1.2.6将离心管置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃除上清液。A.2.1.2.7向离心管中加入200μL清洗缓冲液，置于磁性分离架上，吸附纳米磁珠，弃除上清液。A.2.1.2.8向离心管中加人50μL无RNase的水，重新悬浮纳米磁珠。A.2.1.2.9离心管置于95℃，加热5min，使病毒粒子裂解，释放病毒RNA；立即置于冰上。A.2.1.2.10将含有病毒RNA的上清液转移至新的无RNase的1.5mL离心管中，一80℃冰箱保存备用。
样品总RNA的提取也可使用相应市售RNA提取试剂盒提取。A.2.2总DNA的提取
A.2.2.1取0.1g研磨物并迅速移人1.5mL的离心管中，加人600μL预热的提取缓冲液，再加人200μL20%的PVP，混匀，65℃保温20min，期间摇动数次。A.2.2.2加人等体积的酚-三氯甲烷，轻轻颠倒混勾。10000r/min离心10min。A.2.2.3取上清液，加入2/3倍体积的冰冷的异丙醇，混匀。10000r/min离心10min。去掉上清液中的异丙醇，此时管底有白色沉淀。A.2.2.4向白色沉淀中加人10±L的RNA酶（10mg/mL），37℃保温30min。A.2.2.5加人1mL醋酸钾（5mol/L）。于10000r/min离心10min。A.2.2.6去掉上清液，保留沉淀。用70%乙醇洗涤沉淀3次，干燥。A.2.2.7用100μLTE溶解沉淀，作为PCR反应的模板，一20℃保存备用。样品总DNA的提取也可使用相应市售DNA提取试剂盒提取。
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