SN/T 4880-2017
基本信息
标准号： SN/T 4880-2017
中文名称：亨德拉病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4880-2017.Quarantine protocol for Hendra disease.
1范围
SN/T 4880规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)操作的技术规范。
SN/T 4880适用于亨德拉病毒感染的检测和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生 物安全通用要求
3生物安全措施
亨德拉病毒对人极具危险(参见附录A)。因此，用于享德拉病毒检测的相关病料、组织样品,须经过灭活处理,其分子生物学和血清学检测须在级生物安全实验室中进行。 为了防止疫病传播,同时保护实验人员的安全,试验应由具有一定资格的专业技术人员操作，所有经前处理的检测病料及样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理。试验环境和防护要求严格遵守GB 19489。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
cDNA:互补DNA(Complementary DNA)
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarhonate)
dNTP:脱氧核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate)
HeV:享德拉病毒( Hendra virus)
1范围
SN/T 4880规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应(Real-timePCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)操作的技术规范。
SN/T 4880适用于亨德拉病毒感染的检测和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生 物安全通用要求
3生物安全措施
亨德拉病毒对人极具危险(参见附录A)。因此，用于享德拉病毒检测的相关病料、组织样品,须经过灭活处理,其分子生物学和血清学检测须在级生物安全实验室中进行。 为了防止疫病传播,同时保护实验人员的安全,试验应由具有一定资格的专业技术人员操作，所有经前处理的检测病料及样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理。试验环境和防护要求严格遵守GB 19489。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
cDNA:互补DNA(Complementary DNA)
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethylpyrocarhonate)
dNTP:脱氧核苷三磷酸(Deoxy-ribonucleoside triphosphate)
HeV:享德拉病毒( Hendra virus)
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4880—2017
亨德拉病检疫技术规范
Quarantineprotocolfor Hendra disease2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4880—2017
本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断有关章节。本标准与世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断等有关章节的主要区别在于对其中酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和实时RT-PCR检测方法进行了细化，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国荣成出人境检验检疫局本标准主要起草人：尹伟力、孙涛、刘瑶、鲁闽、梁成珠、岳志芹、王群、刘宁。1
1范围
亨德拉病检疫技术规范
SN/T4880—2017
本标准规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应（Real-timePCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作的技术规范。
本标准适用于亨德拉病毒感染的检测和监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要
3生物安全措施
亨德拉病毒对人极具危险（参见附录A）。因此，用于亨德拉病毒检测的相关病料、组织样品，须经过灭活处理，其分子生物学和血清学检测须在级生物安全实验室中进行。为了防止疫病传播，同时保护实验人员的安全，试验应由具有一定资格的专业技术人员操作，所有经前处理的检测病料及样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理缩略语
下列缩略语适用于本文件。
试验环境和防护要求严格遵守GB19489。cDNA：互补DNA（ComplementaryDNA）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarhonate）dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）HeV：亨德拉病毒（Hendravirus）M-MLV：莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphatebufferedsaline）RT-PCR：反转录-聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）5样品采集与运输
活动物需要采集鼻腔或口腔鼻咽部拭子，尿液，血清。病死动物需无菌采集脑，肺，肾和脾脏等组织。样品需要放于二级生物样品安全转移箱进行运输。如在48h内能到达实验室：则只需保存在4℃C保存运送到实验室进行检测：若运输时间超过48h，则样品需在干冰或液氮状态下冰冻运输，但病料不能长期存放在一20℃。
SN/T4880-2017
6荧光PCR检测
主要试剂，材料与设备
6.1.1病毒RNA提取试剂Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇。6.1.2M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5×反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂（40U/μL)、Taq酶及相应10×缓冲液、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTP6.1.3采用以下引物及探针检测：上游引物序列(F1)：5\-GAT-ATI-TTT-GAM-GAG-GCG-GCT-AGT-T-3”。下游引物序列（R2)：5\-CCC-ATC-TCA-GTT-CTG-GGC-TAT-TAG-3。TagMan探针序列：5'-FAM-CTA-CTT-TGA-CTA-CTA-AGA-TAA-GA-TAMRA-3”6.1.4高速冷冻离心机、台式小型离心机、超净工作台、混匀器、荧光PCR仪。6.2实验步骤
6.2.1样品处理
用于亨德拉病毒检测的相关病料、组织样品，应经过丫射线辐照灭活（辐照剂量为6000Gy）处理后送至二级生物安全实验室。灭活后的组织样品经研磨匀浆处理，加无菌PBS缓冲液（配置见附录B)，制成组织悬液。
6.2.2RNA提取
用Trizol法提取RNA，也可采用市售的RNA提取试剂盒直接提取病毒RNA。具体步骤如下：取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每a
个管进行编号标记。
b）每管加入600μLTrizol，然后分别加人待测样本、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头；再加人200uL氯仿，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/rmin离心15min。
c）取与样本相同数量的1.5mL灭菌离心管，加500μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。
吸取离心后各管中的上清液，每个至少吸取500μL，不要吸出中间层，将上清液转移至已加人d
异内醇的相应的管中，颠倒混匀。于4℃条件下，12000r/min离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样e
品应在吸水纸不同地方吸干
加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心10min，轻轻倒去上清f）
液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。4000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样g
本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。
h）加人11μL经无RNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱。6.2.3荧光RT-PCR反应体系
该荧光RT-PCR以25μL体系为例，其中每个测试反应体系需要14μLRT-PCR反应液和0.5μL2
SN/T4880—2017
M-MLV反转录酶，0.25μLRNA酶抑制剂以及0.25μLTaq酶。在各设定的PCR管中分别加人6.2.2中制备的RNA溶液10μL，使总体积达25uL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。在每次PCR扩增反应板中同时设立阳性对照、阴性对照及空白对照。RT-PCR反应液配置详见附录B。6.2.4PCR反应参数
将如上准备好的PCR反应体系置荧光PCR仪器，热循环条件按以下参数设置：45℃，30min；95℃，10min；40个循环的95℃，15s，60℃，1min，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。
6.2.5结果判定
如果阳性对照出现典型的扩增曲线，且C，值小于或等于35，阴性对照无扩增曲线或C，值大于或等于40，空白对照无扩增，则该试验成立。当被检测样品有扩增曲线，且C，值小于或等于35，那么被检测样品判定为HeV核酸阳性。如果被检测样品无扩增曲线；C，值大于或等于40，那么被检样品可判定为HeV核酸阴性。如果被检测样品有扩增曲线，但C，值在35～40区间内，则判为可疑，应重复试验。如果对照结果成立，重复结果仍可疑，则判定为HeV核酸阳性。7酶联免疫吸附试验检测（ELISA）7.1试剂、材料与仪器
7.1.1HeV抗原、未感染病毒的细胞对照抗原、阳性血清和阴性血清、酶标抗体，以上均由国家质量监督检验检疫总局指定的单位提供。7.1.2PBS-TT、PBS-T、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、H2O2（配制见附录C)。7.1.3酶标仪、96孔酶标板、振荡培养箱。7.2操作方法
7.2.1全血样品经射线辐照灭活（辐照剂量为6000Gy）处理后，送至二级生物安全实验室中分离血清，分离好的血清用以下步骤处理：a）血清样品用PBS-TT样品稀释液（配制见附录C)进行5倍稀释，56℃灭活30min。操作人员需做好自我防护。www.bzxz.net
取22.5μL热灭活血清与等体积细胞对照抗原混合，用PBS缓存液进行100倍稀释，18℃～22℃孵育30min。
c）加人405μLPBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），18℃～22℃孵育30min。7.2.2将HeV抗原和细胞对照抗原用PBS-T1：1000稀释，将稀释后的抗原加人96孔板中，1、3、5、7、9和11列孔滴加病毒抗原2、4、6、8、10和12列孔滴加细胞对照抗原。置于37℃振荡培养1h或4℃过夜，每孔50L
7.2.3倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（PBS-T），静置1min～2min后倒掉，吸干，重复洗3次。
7.2.4加人PBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），每孔100μL，置37℃振荡孵育30min。7.2.5按7.2.3用PBS洗板3次。
7.2.6每孔加人100μL按照7.2.1准备好的待检血清，各缓冲液对照孔加人100μLPBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），置37℃静止1h。3
SN/T4880—2017
7.2.7按7.2.3用PBS洗板3次。
7.2.8用含1%脱脂奶粉的PBS1：5000稀释酶标抗体，混匀后除底物对照孔外每孔加人100uL，底物对照孔加人100μL含1%脱脂奶粉的PBS。置37℃静止1h。7.2.9按7.2.3用PBS洗板3次。
每孔加人100μL底物溶液，置室温（18℃～22℃）静止10min。7.2.11
每孔加人100μL的1mol/L硫酸终止反应，将板置于酶标仪上，在450nm波长条件下读取光吸收值。每次试验设立阳性、阴性血清、各缓冲液对照孔和未感染病毒的细胞抗原对照孔。结果判定
判定条件
当阳性血清HeV抗原孔OD值大于0.2.阴性血清HeV抗原孔OD值小于0.2时，试验结果有效否则此试验视为无效。
判定标准
OD比值
待检血清HeV抗原孔OD值
细胞对照抗原孔OD值
小于0.2时，为HeV抗体阴性。
当待检血清HeV抗原孔OD值
当待检血清HeV抗原孔OD值
大于0.2时，且OD比值大于2.为HeV抗体阳性。当待检血清HeV抗原孔OD值大
·且OD比值在
2.02.2之间为可疑，对可疑样品需送至OIE指定参考实验室进行病毒中和试验确证S
A.1总则
附录A
（资料性附录）
亨德拉病简介
SN/T4880—2017
亨德拉病（Hendradisease）是由亨德拉病毒（Hendravirus）引起的一种烈性人畜共患传染病。感染该病后马以呼吸道症状为主，人以脑炎为主。该病最早于1994一1995年在澳大利亚昆士兰州布里斯班郊区的亨德拉被发现，该病导致13匹马和一名驯马师死亡。享德拉病的病原为亨德拉病毒，根据其形态和培养特性初步将该病毒列为副黏病毒科的麻疹病毒属。亨德拉病毒基因组为单股RNA每个长
度为15200bp~15900bp，病毒有囊膜呈球形或丝状直径为150200nm长度为1000nm~10040nm
呈螺旋状对称。该病毒能适应多种哺乳动物的原代和传代细胞系，其中以Veto细胞培养应用最广。它也能在禽类两栖类爬虫类和鱼类的细胞培养中适应生长。征为合胞体形成，该病毒也能适应鸡胚导致鸡胚死亡。A.2临床诊断
在细胞培养中它能产生明显的细胞病变特自然感染马的潜伏期通常为
8d～11d.最长为16d。发病过程很急，从出现症状到死亡通常为1d~3d。初期，患马表现为厌食和沉郁，体温济失调。晚期常见鼻内有大量黄色泡沫液体排出。A.3病理变化
快速，浅表，出汗。黏膜充血，站立不稳，共个别马表现头下垂，有少数马皮下发生水肿。皮下组织变黄，呼吸道
道上部病理变化不明显。胸膜下显著水肿，胸腔和病理变化主要集中在肺部
心包大量积液，肺充血、实变，实质中有大小不等的出血点，气管常被、一种白色和血色气泡阻塞，肾、胃和肠道散布着瘀血点和瘀斑。
组织学变化主要是伴有毛细血管内皮严重损害导致大范围水肿、纤维蛋白渗出和出血为特征的急性、间质性肺炎。在肺泡内有单核细胞、巨噬细胞和少量嗜中性细胞存在。肺毛细管和小动脉内有典型的合胞体细胞。
SN/T4880—2017
磷酸盐缓冲液（PBS）
NazHPO,·12H20
附录B
（规范性附录）
荧光PCR试剂配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL.pH为7.4B.2
DEPC处理的灭菌双蒸水配制
灭菌双蒸水100mL，加入DEPC50μL，室温过夜，121℃高压15min，分装到1.5mL的无RNA酶的1.5mL离心管中。
荧光RT-PCR反应液配方
5XRT缓冲液
10×PCR缓冲液
MgClz(25mmol/L)
dNTP(2.5mmol/L)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
补DEPC水至
注：1个检测反应的加人量。
4亨德拉病毒荧光PCR产物参考序列（143bp）B.4
GATATATTTGACGAGGCGGCTAGTTTCAGAAGCTATCAATCGAAACTCGGTCGAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAGCTACTTTGACTACTAAGATAAGAATTTTTGTACCAGCAACTAATAGCCCAGAACTGAGATGGGA注：字体标灰色的是引物序列，下划线的是探针序列。6
样品稀释液（PBS-TT）
Na2HPO,12H2O
吐温-20
Triton X-100
附录C
（规范性附录）
ELISA试验试剂的配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL，pH为7.4。C.2
包被缓冲液
NaHCO3
NazcO3
溶解后置于4℃冰箱。
磷酸盐缓冲液（PBS）
Naz2HPO,12H.O2
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL，pH为7.4。洗涤液（PBS-T）
PBS1000mL，吐温-200.5mL.混匀。封闭液
PBS1000mL，加5mL鸡血清和5g脱脂奶粉，溶解混勾。C.6
底物溶液
SN/T4880—2017
称取柠檬酸（CHO，·H2O)10.5g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加人双蒸水定容至1000mL，C.6.15
配成0.05mol/L柠檬酸溶液。
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亨德拉病检疫技术规范
Quarantineprotocolfor Hendra disease2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4880—2017
本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断有关章节。本标准与世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断等有关章节的主要区别在于对其中酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)和实时RT-PCR检测方法进行了细化，本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国荣成出人境检验检疫局本标准主要起草人：尹伟力、孙涛、刘瑶、鲁闽、梁成珠、岳志芹、王群、刘宁。1
1范围
亨德拉病检疫技术规范
SN/T4880—2017
本标准规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应（Real-timePCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）操作的技术规范。
本标准适用于亨德拉病毒感染的检测和监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要
3生物安全措施
亨德拉病毒对人极具危险（参见附录A）。因此，用于亨德拉病毒检测的相关病料、组织样品，须经过灭活处理，其分子生物学和血清学检测须在级生物安全实验室中进行。为了防止疫病传播，同时保护实验人员的安全，试验应由具有一定资格的专业技术人员操作，所有经前处理的检测病料及样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理缩略语
下列缩略语适用于本文件。
试验环境和防护要求严格遵守GB19489。cDNA：互补DNA（ComplementaryDNA）DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarhonate）dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleosidetriphosphate）HeV：亨德拉病毒（Hendravirus）M-MLV：莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphatebufferedsaline）RT-PCR：反转录-聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）5样品采集与运输
活动物需要采集鼻腔或口腔鼻咽部拭子，尿液，血清。病死动物需无菌采集脑，肺，肾和脾脏等组织。样品需要放于二级生物样品安全转移箱进行运输。如在48h内能到达实验室：则只需保存在4℃C保存运送到实验室进行检测：若运输时间超过48h，则样品需在干冰或液氮状态下冰冻运输，但病料不能长期存放在一20℃。
SN/T4880-2017
6荧光PCR检测
主要试剂，材料与设备
6.1.1病毒RNA提取试剂Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇。6.1.2M-MLV反转录酶（200U/μL)及相应5×反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂（40U/μL)、Taq酶及相应10×缓冲液、25mmol/LMgCl2、2.5mmol/LdNTP6.1.3采用以下引物及探针检测：上游引物序列(F1)：5\-GAT-ATI-TTT-GAM-GAG-GCG-GCT-AGT-T-3”。下游引物序列（R2)：5\-CCC-ATC-TCA-GTT-CTG-GGC-TAT-TAG-3。TagMan探针序列：5'-FAM-CTA-CTT-TGA-CTA-CTA-AGA-TAA-GA-TAMRA-3”6.1.4高速冷冻离心机、台式小型离心机、超净工作台、混匀器、荧光PCR仪。6.2实验步骤
6.2.1样品处理
用于亨德拉病毒检测的相关病料、组织样品，应经过丫射线辐照灭活（辐照剂量为6000Gy）处理后送至二级生物安全实验室。灭活后的组织样品经研磨匀浆处理，加无菌PBS缓冲液（配置见附录B)，制成组织悬液。
6.2.2RNA提取
用Trizol法提取RNA，也可采用市售的RNA提取试剂盒直接提取病毒RNA。具体步骤如下：取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数、一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每a
个管进行编号标记。
b）每管加入600μLTrizol，然后分别加人待测样本、阴性对照和阳性对照各200μL，一份样本换用一个吸头；再加人200uL氯仿，混匀器上震荡混匀5s。于4℃条件下，12000r/rmin离心15min。
c）取与样本相同数量的1.5mL灭菌离心管，加500μL异丙醇（一20℃预冷），对每个管进行编号。
吸取离心后各管中的上清液，每个至少吸取500μL，不要吸出中间层，将上清液转移至已加人d
异内醇的相应的管中，颠倒混匀。于4℃条件下，12000r/min离心15min。轻轻倒去上清，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样e
品应在吸水纸不同地方吸干
加入600μL75%乙醇，颠倒洗涤。于4℃条件下，12000r/min离心10min，轻轻倒去上清f）
液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干。4000r/min离心10s，将管壁上的残余液体甩到管底部，用微量加样器尽量将其吸干，一份样g
本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min。不宜过于干燥，以免RNA不溶。
h）加人11μL经无RNA酶的灭菌纯化水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA应在2h内进行荧光RT-PCR扩增或放置于一70℃冰箱。6.2.3荧光RT-PCR反应体系
该荧光RT-PCR以25μL体系为例，其中每个测试反应体系需要14μLRT-PCR反应液和0.5μL2
SN/T4880—2017
M-MLV反转录酶，0.25μLRNA酶抑制剂以及0.25μLTaq酶。在各设定的PCR管中分别加人6.2.2中制备的RNA溶液10μL，使总体积达25uL。盖紧管盖后，500r/min离心30s。在每次PCR扩增反应板中同时设立阳性对照、阴性对照及空白对照。RT-PCR反应液配置详见附录B。6.2.4PCR反应参数
将如上准备好的PCR反应体系置荧光PCR仪器，热循环条件按以下参数设置：45℃，30min；95℃，10min；40个循环的95℃，15s，60℃，1min，荧光收集设置在第三阶段每次循环的退火延伸时进行。
6.2.5结果判定
如果阳性对照出现典型的扩增曲线，且C，值小于或等于35，阴性对照无扩增曲线或C，值大于或等于40，空白对照无扩增，则该试验成立。当被检测样品有扩增曲线，且C，值小于或等于35，那么被检测样品判定为HeV核酸阳性。如果被检测样品无扩增曲线；C，值大于或等于40，那么被检样品可判定为HeV核酸阴性。如果被检测样品有扩增曲线，但C，值在35～40区间内，则判为可疑，应重复试验。如果对照结果成立，重复结果仍可疑，则判定为HeV核酸阳性。7酶联免疫吸附试验检测（ELISA）7.1试剂、材料与仪器
7.1.1HeV抗原、未感染病毒的细胞对照抗原、阳性血清和阴性血清、酶标抗体，以上均由国家质量监督检验检疫总局指定的单位提供。7.1.2PBS-TT、PBS-T、封闭液、洗涤液、底物溶液、终止液、脱脂奶粉、H2O2（配制见附录C)。7.1.3酶标仪、96孔酶标板、振荡培养箱。7.2操作方法
7.2.1全血样品经射线辐照灭活（辐照剂量为6000Gy）处理后，送至二级生物安全实验室中分离血清，分离好的血清用以下步骤处理：a）血清样品用PBS-TT样品稀释液（配制见附录C)进行5倍稀释，56℃灭活30min。操作人员需做好自我防护。www.bzxz.net
取22.5μL热灭活血清与等体积细胞对照抗原混合，用PBS缓存液进行100倍稀释，18℃～22℃孵育30min。
c）加人405μLPBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），18℃～22℃孵育30min。7.2.2将HeV抗原和细胞对照抗原用PBS-T1：1000稀释，将稀释后的抗原加人96孔板中，1、3、5、7、9和11列孔滴加病毒抗原2、4、6、8、10和12列孔滴加细胞对照抗原。置于37℃振荡培养1h或4℃过夜，每孔50L
7.2.3倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液（PBS-T），静置1min～2min后倒掉，吸干，重复洗3次。
7.2.4加人PBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），每孔100μL，置37℃振荡孵育30min。7.2.5按7.2.3用PBS洗板3次。
7.2.6每孔加人100μL按照7.2.1准备好的待检血清，各缓冲液对照孔加人100μLPBS（含5%鸡血清和5%脱脂奶粉），置37℃静止1h。3
SN/T4880—2017
7.2.7按7.2.3用PBS洗板3次。
7.2.8用含1%脱脂奶粉的PBS1：5000稀释酶标抗体，混匀后除底物对照孔外每孔加人100uL，底物对照孔加人100μL含1%脱脂奶粉的PBS。置37℃静止1h。7.2.9按7.2.3用PBS洗板3次。
每孔加人100μL底物溶液，置室温（18℃～22℃）静止10min。7.2.11
每孔加人100μL的1mol/L硫酸终止反应，将板置于酶标仪上，在450nm波长条件下读取光吸收值。每次试验设立阳性、阴性血清、各缓冲液对照孔和未感染病毒的细胞抗原对照孔。结果判定
判定条件
当阳性血清HeV抗原孔OD值大于0.2.阴性血清HeV抗原孔OD值小于0.2时，试验结果有效否则此试验视为无效。
判定标准
OD比值
待检血清HeV抗原孔OD值
细胞对照抗原孔OD值
小于0.2时，为HeV抗体阴性。
当待检血清HeV抗原孔OD值
当待检血清HeV抗原孔OD值
大于0.2时，且OD比值大于2.为HeV抗体阳性。当待检血清HeV抗原孔OD值大
·且OD比值在
2.02.2之间为可疑，对可疑样品需送至OIE指定参考实验室进行病毒中和试验确证S
A.1总则
附录A
（资料性附录）
亨德拉病简介
SN/T4880—2017
亨德拉病（Hendradisease）是由亨德拉病毒（Hendravirus）引起的一种烈性人畜共患传染病。感染该病后马以呼吸道症状为主，人以脑炎为主。该病最早于1994一1995年在澳大利亚昆士兰州布里斯班郊区的亨德拉被发现，该病导致13匹马和一名驯马师死亡。享德拉病的病原为亨德拉病毒，根据其形态和培养特性初步将该病毒列为副黏病毒科的麻疹病毒属。亨德拉病毒基因组为单股RNA每个长
度为15200bp~15900bp，病毒有囊膜呈球形或丝状直径为150200nm长度为1000nm~10040nm
呈螺旋状对称。该病毒能适应多种哺乳动物的原代和传代细胞系，其中以Veto细胞培养应用最广。它也能在禽类两栖类爬虫类和鱼类的细胞培养中适应生长。征为合胞体形成，该病毒也能适应鸡胚导致鸡胚死亡。A.2临床诊断
在细胞培养中它能产生明显的细胞病变特自然感染马的潜伏期通常为
8d～11d.最长为16d。发病过程很急，从出现症状到死亡通常为1d~3d。初期，患马表现为厌食和沉郁，体温济失调。晚期常见鼻内有大量黄色泡沫液体排出。A.3病理变化
快速，浅表，出汗。黏膜充血，站立不稳，共个别马表现头下垂，有少数马皮下发生水肿。皮下组织变黄，呼吸道
道上部病理变化不明显。胸膜下显著水肿，胸腔和病理变化主要集中在肺部
心包大量积液，肺充血、实变，实质中有大小不等的出血点，气管常被、一种白色和血色气泡阻塞，肾、胃和肠道散布着瘀血点和瘀斑。
组织学变化主要是伴有毛细血管内皮严重损害导致大范围水肿、纤维蛋白渗出和出血为特征的急性、间质性肺炎。在肺泡内有单核细胞、巨噬细胞和少量嗜中性细胞存在。肺毛细管和小动脉内有典型的合胞体细胞。
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磷酸盐缓冲液（PBS）
NazHPO,·12H20
附录B
（规范性附录）
荧光PCR试剂配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL.pH为7.4B.2
DEPC处理的灭菌双蒸水配制
灭菌双蒸水100mL，加入DEPC50μL，室温过夜，121℃高压15min，分装到1.5mL的无RNA酶的1.5mL离心管中。
荧光RT-PCR反应液配方
5XRT缓冲液
10×PCR缓冲液
MgClz(25mmol/L)
dNTP(2.5mmol/L)
上游引物（10μmol/L）
下游引物（10μmol/L）
探针（10μmol/L）
补DEPC水至
注：1个检测反应的加人量。
4亨德拉病毒荧光PCR产物参考序列（143bp）B.4
GATATATTTGACGAGGCGGCTAGTTTCAGAAGCTATCAATCGAAACTCGGTCGAGATGGGCGGGCAAGTGCGGCAACAGCTACTTTGACTACTAAGATAAGAATTTTTGTACCAGCAACTAATAGCCCAGAACTGAGATGGGA注：字体标灰色的是引物序列，下划线的是探针序列。6
样品稀释液（PBS-TT）
Na2HPO,12H2O
吐温-20
Triton X-100
附录C
（规范性附录）
ELISA试验试剂的配制
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL，pH为7.4。C.2
包被缓冲液
NaHCO3
NazcO3
溶解后置于4℃冰箱。
磷酸盐缓冲液（PBS）
Naz2HPO,12H.O2
先加适量的双蒸水，完全溶解后加双蒸水定容至1000mL，pH为7.4。洗涤液（PBS-T）
PBS1000mL，吐温-200.5mL.混匀。封闭液
PBS1000mL，加5mL鸡血清和5g脱脂奶粉，溶解混勾。C.6
底物溶液
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称取柠檬酸（CHO，·H2O)10.5g，先加适量的双蒸水，完全溶解后加人双蒸水定容至1000mL，C.6.15
配成0.05mol/L柠檬酸溶液。
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