中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4880—2017 亨德拉病检疫技术规范 Quarantine protocol for Hendra disease 2017-08-29发布 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 2018-04-01实施 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准修改采用了世界动物卫生组织（OIE）《陆生动物诊断试验与疫苗手册》（2015版）第2.9.6章中亨德拉和尼帕病毒诊断有关章节。本标准与OIE相关内容的主要区别在于对酶联免疫吸附试验（ELISA）和实时RT-PCR检测方法进行了细化。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位包括中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国荣成出入境检验检疫局。本标准主要起草人包括尹伟力、孙涛、刘瑶、鲁闽、梁成珠、岳志芹、王群、刘宁。 1 范围 本标准规定了亨德拉病的实时荧光聚合酶链式反应（Real-time PCR）和酶联免疫吸附试验（ELISA）操作的技术规范。本标准适用于亨德拉病毒感染的检测和监测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。本文件引用GB19489《实验室生物安全通用要求》。 3 生物安全措施 亨德拉病毒对人极具危险（参见附录A）。用于亨德拉病毒检测的病料和组织样品须经过灭活处理，其分子生物学和血清学检测须在相应生物安全实验室中进行。为防止疫病传播并保护实验人员安全，试验应由具备资格的专业技术人员操作。所有检测病料、样品、培养物及废弃物等须经高压灭菌处理。 4 缩略语 试验环境和防护要求严格遵守GB19489。cDNA：互补DNA（Complementary DNA）；DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethyl pyrocarbonate）；dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）；HeV：亨德拉病毒（Hendra virus）；M-MLV：莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloney murine leukemia virus）；PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphate buffered saline）；RT-PCR：反转录-聚合酶链反应（Reverse transcription polymerase chain reaction）。 5 样品采集与运输 活动物需采集鼻腔或口腔鼻咽部拭子、尿液、血清。病死动物需无菌采集脑、肺、肾和脾脏等组织。样品需置于二级生物样品安全转移箱运输。如48h内到达实验室，则4℃保存运输；若超过48h，则需干冰或液氮冷冻运输，但病料不能长期存放于-20℃。 6 荧光PCR检测 6.1 主要试剂、材料与设备 6.1.1 病毒RNA提取试剂：Trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇。6.1.2 M-MLV反转录酶（200U/μL）及5×反转录反应缓冲液、RNA酶抑制剂（40U/μL）、Taq酶及10×缓冲液、25mmol/L MgCl2、2.5mmol/L dNTP。6.1.3 引物及探针：上游引物F1：5'-GAT-ATI-TTT-GAM-GAG-GCG-GCT-AGT-T-3'；下游引物R2：5'-CCC-ATC-TCA-GTT-CTG-GGC-TAT-TAG-3'；TaqMan探针：5'-FAM-CTA-CTT-TGA-CTA-CTA-AGA-TAA-GA-TAMRA-3'。6.1.4 设备：高速冷冻离心机、台式离心机、超净工作台、混匀器、荧光PCR仪。 6.2 实验步骤 6.2.1 样品处理 用于检测的病料和组织样品应经γ射线辐照灭活（剂量6000Gy）后送至二级生物安全实验室。灭活组织样品经研磨匀浆处理，加无菌PBS缓冲液制成组织悬液。 6.2.2 RNA提取 用Trizol法提取RNA，也可使用市售RNA提取试剂盒。具体步骤如下：取n个1.5mL灭菌离心管，其中n为待检样品数加一管阳性对照及一管阴性对照之和，对每个管进行编号标记。b）每管加入600μL Trizol，然后