SN/T 4877.10-2017.DNA barcoding screening method- -Part 10:Quarantine Phytophthora.
1范围
SN/T 4877.10规定了栗疫霉黑水病菌.马铃薯疫霉绯腐病菌、草莓疫霉红心病菌.树莓疫霉根腐病菌、柑橘冬生疫霉雪松疫霉根腐病菌.苜蓿疫霉根腐病菌.菜豆疫霉病菌、栎树猝死病菌、大豆疫霉病菌和丁香疫霉病菌的DNA条形码筛查。
SN/T 4877.10适用于栗疫霉黑水病菌.马铃薯疫霉绯腐病菌、草莓疫霉红心病菌、树莓疫霉根腐病菌、柑橘冬生疫霉、雪松疫霉根腐病菌、苜蓿疫霉根腐病菌、菜豆疫霉病菌、栎树猝死病菌、大豆疫霉病菌和丁香疫霉病菌的DNA条形码筛查种序列的扩增、分析及结果判定等。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1131大 豆疫霉病菌检疫鉴定方法
SN/T1135.6马铃薯绯腐病菌检疫鉴定方法
SN/T 2080栎树 猝死病菌检疫鉴定方法
SN/T 2474大 豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法
SN/T 2617冬生疫霉病 菌检疫鉴定方法
SN/T 2756 丁香疫霉检疫鉴定方法
SN/T 2759栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法
SN/T 3403菜豆疫霉 检疫鉴定方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.10—2017
基因条形码筛查方法
第10部分：检疫性疫霉
DNA barcoding screening method-Part 10:Quarantine Phytophthora2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌：
一第3部分：检疫性植原体；
一第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌：
—第7部分：检疫性轮枝菌；
一第8部分：检疫性炭疽菌；
一第9部分：检疫性腥黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第10部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.10—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院。本部分起草人：章桂明、高瑞芳、汪莹、程颖慧、王颖、黄河清。1范围
基因条形码筛查方法
第10部分：检疫性疫霉
SN/T4877.10—2017
SN/T4877的本部分规定了栗疫霉黑水病菌、马铃薯疫霉排腐病菌、草莓疫霉红心病菌、树莓疫霉根腐病菌、柑橘冬生疫霉、雪松疫霉根腐病菌、首疫霉根腐病菌、菜豆疫霉病菌、栎树猝死病菌、大豆疫霉病菌和丁香疫霉病菌的DNA条形码筛查。本部分适用于栗疫霉黑水病菌、马铃薯疫霉腐病菌、草莓疫霉红心病菌、树莓疫霉根腐病菌、柑橘冬生疫霉、雪松疫霉根腐病菌、首藉疫霉根腐病菌、菜豆疫霉病菌、栎树猝死病菌、大豆疫霉病菌和丁香疫霉病菌的DNA条形码筛查种序列的扩增、分析及结果判定等。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1131大豆疫霉病菌检疫鉴定方法SN/T1135.6马铃薯排腐病菌检疫鉴定方法SN/T2080
SN/T2474
SN/T2617
SN/T2756
SN/T2759
SN/T3403
3术语和定义
栎树猝死病菌检疫鉴定方法
大豆疫霉病菌实时荧光PCR检测方法冬生疫霉病菌检疫鉴定方法
丁香疫霉检疫鉴定方法
栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法
菜豆疫霉检疫鉴定方法
下列术语和定义适用于本文件。3.1
马DNAbarcode
DNA条形码
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段3.2
mitochondrial cytochrome c oxidase subunitI,coI线粒体细胞色素C氧化酶亚基I基因线粒体基因变化速率快，在其13个蛋白编码基因中，COI基因很少存在插缺失，序列长度500bp～700bp，宜作为真菌DNA条形码，也是最早提出的DNA条形码片段。3.3
Jinternal transcribed spacer;ITs内部转录间隔区序列
在真核生物中，核糖体DNA是由核糖体基因及与之相邻的间隔区组成，其基因组序列从5'到3”依次为：外部转录间隔区，18S基因、内部转录间隔区1（ITS1）、5.8S基因、内部转录间隔区2（ITS2）、28S基因和基因间隔序列。内部转录间隔区是存在于18SrDNA，5.8SrDNA和28SrDNA之间的区1
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域，ITS1和ITS2作为非编码区，受外界环境因素的影响较小，与编码区域相比具有进化速度快的特点，在种内的不同菌株之间高度保守，而在真菌种间存在极大的变化，表现出极大的序列多态性，能够提供详尽的系统学分析所需的可遗传性状。4检疫性疫霉基本信息
学名：Phytophthoracambivora（Petri)Buisman中文名：栗疫霉黑水病菌
学名：PhytophthoraerythrosepticaPethybridge中文名：马铃薯疫霉腐病菌
学名：Phytophthora fragariaeHickman中文名：草莓疫霉红心病菌
学名：PhytophthorafragariaeHickmanvarubiW.F.WilcoxetJ.M.Duncan中文名：树莓疫霉根腐病菌
学名：PhytophthorahibernalisCarn中文名：柑橘冬生疫莓
学名：Phytophthora lateralis Tucker et Milbrat中文名：雪松疫霉根腐病菌
学名：PhytophthoramedicaginisE.M.Hans.etD.P.Maxwell中文名：首疫霉根腐病菌
学名：PhytophthoraphaseoliThaxter中文名：菜豆疫霉病菌
学名：Phytophthoraramo
中文名：栎树猝死病菌
Fum Werres,De Cock et Man in't.学名：Phytophthora sojaeKaufmann et Gerdenann中文名：大豆疫霉病菌
学名：Phytophthora syringae(Klebahn)Klebahn中文名：丁香疫霉病菌
分类地位：藻菌界（Chromista)，卵菌门（Oomycota），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae）。各检疫性疫霉寄主范围参见附录A5方法原理
使用COI基因和ITS片段作为11种疫霉的DNA条形码基因，通过对检测对象的DNA进行PCR扩增及产物测序后，利用DNA条形码数据库生物条形码数据（BOLD）、中国检疫性有害生物DNA条形码数据库或NCBI数据库比对，根据序列相似度筛查物种。6主要仪器设备与试剂
6.1仪器设备
超净工作台、高压灭菌锅、4℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪，凝胶成像系统。
6.2试剂
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乙醇、CTAB提取液、三氯甲烷、PCRTaqDNA聚合酶、PCRTag缓冲液、dNTP、DNA标记物、无菌超纯水。
7检测与鉴定
7.1DNA提取与纯化
对真菌进行液体培养或平板培养，CTAB法对基因组DNA的提取方法详见附录B，测定DNA浓度及纯度后，保存于一20℃冰箱备用。7.2DNA条形码片段PCR扩增
利用通用引物进行COI基因和ITS片段序列护增（具体步骤见附录C)，测序7.3序列分析
测序结果利用BioEdit等生物信息学软件进行剪接编辑，比对峰图和正反向测序结果是否有误，去掉两端引物部分序列。利用BOLD在线数据库、中国检疫性有害生物DNA条形码数据库或NCBI在线数据库比对COI基因和ITS片段序列。8结果判定
ITS和COI序列长度大于500bp。
若两个基因与DNA条码数据库、NCBI数据库和中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中检疫性疫霉序列相似度均大于99%，即可以筛查判定是该物种。11种考序列见附录！
检疫性疫毒ITS和COI基因参
若判定为目标检疫性疫霉，应结合SN/T3403.SN/T1135.6.SN/T20809样品保存
9.1样品保存bzxZ.net
SN/T2759,SN
/T2474.SN/T
2617.SN/T2756,SN/T1131、
无相应标准的按照常规真菌鉴定方法进行最终鉴定。可将菌丝移到V8培养基上，放入15℃冰箱中保存；也可将分离到的菌丝移人V8液体培养基中，在25℃下生长一周左右，然后倾去培养液，把菌丝放人冻存管在一80℃保存。9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。3
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A.1冬生疫霉病菌
附录A
（资料性附录）
检疫性疫霉寄主范围
柑橘属（Citrusspp.）植物，如甜橙（Citrussinensis（L.）Osbeck）、脐橙（Citrussinensis（L.）Osbeck）、橘子（Citrusreticulata）、柠檬（Citruslimon（L.）Burm.f.）等，还可侵染甜椒（CapsicumannuumL.）、番茄（LycopersiconesculentumL.）、茄子（SolanummelongenaL.），苹果（MaluspumilaMill.）、玫瑰（Rosa）、杜鹃（Rhododendron）、芝麻（SesamumindicumL.）、红花（CarthamustinctoriusL.）、贝壳杉（AgathisaustralisSalisb.）白雪松（Chamaecyparislawsoniana）等。A.2大豆疫霉病菌
大豆（Glycinemar（L.）Merr）。A.3栗黑水疫霉病菌
挪威械（Acerplatanoides）、花束月季（Andromedafioribunda）、欧洲栗（Castaneasativa）、木麻黄（Casuarinaequisetifolia）、菊花（Chrysanthemumcinerarifolium）、欧石楠属（Ericaspp.）、山毛榉（Fagussylvatica）、覆盆子（Rubusidaeus）、瓜叶菊（Seneciocruentus）等。A.4马铃薯疫霉排腐病菌
马铃薯（Solanumtuberosum）。A.5丁香疫霉病菌
柑橘属的柠檬（Citruslimon（L.）Burm.f.）、脐橙（Citrussinensis（L.）Osbeck）等，还可为害苹果（Maluspumila）、梨属（Pyrus）、李属（PrunusL.）、杜鹃（RhododendronsimsiiPlanch.）、紫丁香（SyringaoblataLindl.），甜楼桃（Cerasusavium（L.）Moench.）、扁桃仁（AmygdalusCommunisVas）覆盆子（Rubusidaeus），西洋梨（PyruscommunisL.）以及一些木犀科（Oleaceae）的植物等，人工接种还能侵染英国山楂（CrataegusL.）、普通赤杨（Alnusjaponica）、欧洲女贞（Ligustrumlucidum）和橡木(Quercus albaL.）等。
A.6草莓疫霉红心病菌
栽培的草莓（FragariaXananassaDuch.）、罗甘莓（Rubusloganobaccus.Bailey）。人工接种可以侵染蔷薇科委陵菜亚科potentilleae中几个属植物如树莓（Rubuscorchorifolius）等4
A.7树莓疫霉根腐病菌
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栽培的树莓（Rubuscorchorifolius）、杂交的浆果如罗甘莓（RubusLoganobaccusBailey）等。A.8雪松疫霉根腐病菌
中华猕猴桃（Actinidiachinensis）、智利猕猴桃（Actinidiadeliciosa）、长春花（Catharanthusroseus）、红桧（Chamaecyparisformosensis）、美国扁柏（Chamaecyparislawsoniana）、日本扁柏（Chamaecyparisobtusa），密生刺柏（Juniperushorizontalis）、山月桂（Kalmialatifolia）、红叶石楠（PhotiniaXfraseri）、杜鹃（Rhododendronsp.）、短叶红豆杉（Tarusbrevifolia）、侧柏（Platycladusorientalis）等。A.9首疫霉根腐病菌
智利猕猴桃（Actinidiadeliciosa）、鹰嘴豆（Cicerarietinum）、野胡萝卜（Daucuscarota）、首（Medicago）、紫首（Medicagosativa）、红豆草（Onobrychisviciifolia）等。A.10
菜豆疫霉病菌
利马豆（Phaseoluslunatus）、黑芥（Brassicajuncea）、橡胶（Heveabrasiliensis）、番茄（Lycopersiconesculentum），萝卜，（Raphanussativus）、山陀儿（Sandoricumindicum），茄子（Solanummelongena）、豇豆（Vigunaunguiculatasubsp.sesquipedalis）等。A.11栎树猝死病菌
壳斗科的加州栎（Quercusagrifolia）、黄鳞栎（Quercuschrysolepis）、密花石栎（Lithocarpusdensi-fiorus），杜鹃花科的优材草莓树（Arbutusmenziesi）、北加州熊果树（Arctostaphylosmanzanita）、马醉木（PierisfioribundaandPieris）、械树科的械树（Acermacrophyllum），忍冬科的加州忍冬（Lonicerahispidula）等，七叶树科的加州七叶树（Aesculuscalifornica），樟科的山月桂（Umbellulariacalifornica），松科的花旗松（Pseudotsugamenziesiivar.menziesii），杉科的北美红杉（Sequoiasempervirens），山茶科的山茶属（Camelliaspp.）等。SN/T4877.10—2017
B.1DNA制备
附录B
（规范性附录）
基因组DNA制备
实验器皿于121℃、30min湿热灭菌或180℃干热灭菌1h。从培养基上，刮取100mg左右的菌丝体至研内，加人液氮充分研磨，加人4mL预热的CTAB抽提液。
将离心管放入水浴锅前先振荡1min.然后放人65℃水浴锅水浴15min，每隔3min~5min振荡一次。
加三氯甲烷4mL，用移液器混匀1min，水浴10min：4℃积异丙醇，轻轻摇勾，然后一20℃静置15min2000g离心15min，取上清液加等体4℃，12000g离心15min，小心去除上清液，留沉淀；加70%预冷酒精，洗涤3次，放于通风处干燥；加人50μL～100μL灭菌的去高子水溶解DNAB.2DNA浓度及纯度测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260mm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/ODz80
DNA浓度=50XOD260（μg/mL）
PCR级DNA溶液的OD260/ODz比值为1.7~1.9C.1PCR
引物序列
附录C
（规范性附录）
ITS片段和COI基因扩增流程
ITS片段：ITS1:CTTGGTCATTTAGACGAAGTAAITS4:TCCTCCGCTT
ATTGATATGC
COI基因：OomCoxl-Levup：TCAWCWMGATGGCTTTTTTCAAOOomCoxl-Levlo:CYTCHGGRTGWCCRAAAAACCAAAC.1.2扩增体系及条件
扩增反应的组成成分为：
10XPCR缓冲液*.
2.5mmol/LdNTPS
前向引物（10μmol/L）
后向引物（10μmol/L）
5U/μLTaq酶
中服中国中中中心
模板DNA.
补d无菌水至
SN/T4877.10—2017
反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有疫霉病菌的DNA作为模板，每个样品重复2次。，进人循环反应95℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸ITS扩增反应程序为：95℃预热5min
90s，共循环35次，循环后72℃延伸10mine
COI扩增反应程序为：95℃预热5min进人循环反应：95℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共循环35次，循环后72℃延伸10min测序与序列处理
扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段经DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收纯化，采用核酸蛋白分析仪对DNA进行定量检测。测序引物与PCR扩增引物相同，进行测序。
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