SN/T 4877.8-2017
基本信息
标准号： SN/T 4877.8-2017
中文名称：基因条形码筛查方法第8部分:检疫性炭疽菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4877.8-2017.DNA barcoding screening method- Part 8 :Quarantine colletotrichum kahawae.
1范围
SN/T 4877.8规定了咖啡浆果炭疽病菌Colletotrichum kahawvae DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。
SN/T 4877.8适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 3679咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码
DNA barcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的，易扩增且相对较短的DNA片段。
3.2甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase;GAPDH
糖酵解反应中的一个酶,分子量46 kDa,为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。
4咖啡浆果炭疽病菌的基本信息
英文名:pathogen of coffee berry disease
学名:Colletotrichum kahawae J.M. Waller et Bridge
异名:Colletotrichum coffeanum var.virulans (Rayner,1952)
分类学地位:真菌界(Fungi) ,无性型真菌(Anamorphie fungi) ,炭疽菌属(Colletotrichum).
1范围
SN/T 4877.8规定了咖啡浆果炭疽病菌Colletotrichum kahawvae DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。
SN/T 4877.8适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 3679咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码
DNA barcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的，易扩增且相对较短的DNA片段。
3.2甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase;GAPDH
糖酵解反应中的一个酶,分子量46 kDa,为管家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定。
4咖啡浆果炭疽病菌的基本信息
英文名:pathogen of coffee berry disease
学名:Colletotrichum kahawae J.M. Waller et Bridge
异名:Colletotrichum coffeanum var.virulans (Rayner,1952)
分类学地位:真菌界(Fungi) ,无性型真菌(Anamorphie fungi) ,炭疽菌属(Colletotrichum).
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.8—2017
基因条形码筛查方法
第8部分：检疫性炭疽菌
DNA barcoding screening methodPart 8:Quarantine colletotrichum kahawae2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体；
第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌；
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌：
第9部分：检疫性腥黑粉菌；wwW.bzxz.Net
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第8部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.8—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、谢晓露。
1范围
基因条形码筛查方法
第8部分：检疫性炭疽菌
SN/T4877.8—2017
SN/T4877的本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌ColletotrichumkahawaeDNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T3679咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2
甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldeehyde-3-phospha
Tatedehydrogenase
:GAPDH
糖酵解反应中的一个酶，分子量细胞或者组织中的蛋白质表达
响而保持恒定。
4咖啡浆果炭疽病菌的基本信息
46kDa，为管
家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影般是恒定的，且
英文名：pathogenof coffeeberrydisease学名：ColletotrichumkahawaeJ.M.WalleretBridge异名：Colletotrichumcoffeanumvar.virulans（Rayner，1952)）分类学地位：真菌界（Fungi)，无性型真菌（Anamorphicfungi)，炭疽菌属（Colletotrichum）。5方法原理
使用GAPDH基因作为咖啡浆果炭疽病菌的DNA条码基因，通过对检测对象的DNA进行PCR扩增及产物测序后，利用NCBI核酸数据库比对，根据序列相似度筛查物种。1
SN/T4877.8—2017
6仪器设备和试剂
仪器设备
超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、一20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。6.2试剂
氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、TagDNA聚合酶、明胶、溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP,dTTP)。
7筛查鉴定方法
7.1DNA制备
DNA制备方法见附录A。
7.2DNA条形码片段PCR扩增
利用GAPDH基因的通用引物进行GAPDH基因序列扩增，具体步骤见附录B，测序。7.3序列分析
测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Q值小于20的序列。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线数据库中比对GAPDH基因序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。8结果判定
序列长度约为280bp，序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库中（FJ972584.1）比对相似度大于99%时，即可筛查初步判定为咖啡浆果炭疽病菌，咖啡浆果炭疽病菌的GAPDH基因参考序列参见附录C。进一步鉴定按SN/T3679进行。9菌种保存
9.1样品保存
分离到的咖啡浆果炭疽病菌菌种，转人麦芽提取物琼脂（MEA）试管斜面培养基上，置于4℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。2
A.1核酸制备
附录A
（规范性附录）
DNA制备
SN/T4877.8—2017
称取0.1g培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末；立即转移到2mL的离心管中，加人65℃预热的DNA裂解液（SDS）提取液700μL，置于水浴锅中65℃水浴30min，期间不断混勾；加人5μL10mg/mLRNA酶，充分混勾，在37℃放置30min；加人等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，在12000r/min下离心15min，取上清液，加人1：1氯仿-异戊醇（24：1），在12000r/min下离心15min；再取上清液，加人1：1氯仿-异戊醇（24：1），在12000r/min下离心15min；加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱静置30min，在12000r/min下离心15min；弃上清，加人70%乙醇500μL，12000r/min下离心3min，去上清，重复2次；得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加人30μL～50μLTE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一20℃冰箱中保存。注：该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法或CTAB法等A.2DNA浓度及纯度测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD25o（μg/mL）
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值为1.7~1.9。3
SN/T4877.8—2017
引物序列
附录B
（规范性附录）
扩增程序
GDF:5\-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3\GDR:5\-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3\B.2扩增体系及条件
扩增反应的组成成分为：10×PCR缓冲液5LdNTPSo.25μL，10μmol/L前后向引uLommo
物各2.5μL，5U/μLTaq酶0.25μL，模板DNA5μL，补充去离子水至50μL。将反应体系混匀后置于PCR仪中进行反应。
反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有咖啡浆果炭疽菌的DNA作为模板，阴性对照以不含有咖啡浆果炭疽菌的DNA作为模板，每个样品重复2次。扩增反应程序为：95℃预热5min，进人循环反应：95℃变性30s60℃退火30s72℃延伸45s，
共循环35次，循环后72℃延伸7min。B.3琼脂糖凝胶电泳
每个样品取3μL的PCR产物与1L的6×上样缓冲液混合均匀，并加到含有溴化乙锭（0.5ug/mL）的1.2%琼脂糖凝胶的点样孔中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。
序列号（FJ972584.1）
附录C
（资料性附录）
GAPDH片段参考序列
SN/T4877.8—2017
GCCGTCAACGCCCCTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACCTACCCCTCCAAACTCGTCATGACTCTCATCCACCACCAACACCACCGCTGTCATCCACACCTCGCCGCCTGCATCTGGTAGACAAGAAGGTTATCTTGACTTGATGTGAATTGAAATCATGGGCCGGGACGGCGGGACACATGCTATCACTCACAGCAGACCCATCTGTCACATTTACTGACTCGCTCTTCACAGGCCTACATGCTCAAGAG
SN/T4877.8—2017
参考文献
[1JG.Tao,K.D.Hydeand L.Cail,2o12,Species-specific real-timePCRdetection of Colletotrichumkahawae.JournalofApplied Microbiology,v.114,p.828-835.[2]Gunjan Sharma&.NavinderKumar &Bevan S.Weir&KevinD.Hyde&BelleDamodaraShenoy,20o9,The ApMat marker can resolve Colletotrichum species:a case study with Mangifera indica:FungalDiversity,DO110.1007/s13225-013-0247-4.[3]Cai,L.,Hyde,K.D.,Taylor,P.W.J.,Weir,B.S.,Waller,J.,Abang,M.M.,Zhang,J.Z.,Yang,Y.L.et al.20o9,A polyphasic approach for studying Colletotrichum.Fungal Divers 39,183-204.
[4]Crouch,J.,Clarke,B.and Hillman,B.(2oo9)What isthevalueof ITS sequencedata inColletotrichum systematic and species diagnosis? A case study using the falcatespored graminicolousColletotrichumgroup.Mycologia1ol,648-656.
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基因条形码筛查方法
第8部分：检疫性炭疽菌
DNA barcoding screening methodPart 8:Quarantine colletotrichum kahawae2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体；
第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌；
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌：
第9部分：检疫性腥黑粉菌；wwW.bzxz.Net
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第8部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.8—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出人境检验检疫局。本部分主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、谢晓露。
1范围
基因条形码筛查方法
第8部分：检疫性炭疽菌
SN/T4877.8—2017
SN/T4877的本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌ColletotrichumkahawaeDNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码的筛查。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T3679咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNA条形码DNAbarcode
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2
甘油醛-3-磷酸脱氢酶glyceraldeehyde-3-phospha
Tatedehydrogenase
:GAPDH
糖酵解反应中的一个酶，分子量细胞或者组织中的蛋白质表达
响而保持恒定。
4咖啡浆果炭疽病菌的基本信息
46kDa，为管
家基因，几乎在所有组织中都高水平表达。在同种不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影般是恒定的，且
英文名：pathogenof coffeeberrydisease学名：ColletotrichumkahawaeJ.M.WalleretBridge异名：Colletotrichumcoffeanumvar.virulans（Rayner，1952)）分类学地位：真菌界（Fungi)，无性型真菌（Anamorphicfungi)，炭疽菌属（Colletotrichum）。5方法原理
使用GAPDH基因作为咖啡浆果炭疽病菌的DNA条码基因，通过对检测对象的DNA进行PCR扩增及产物测序后，利用NCBI核酸数据库比对，根据序列相似度筛查物种。1
SN/T4877.8—2017
6仪器设备和试剂
仪器设备
超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、一20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器。6.2试剂
氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、TagDNA聚合酶、明胶、溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP,dTTP)。
7筛查鉴定方法
7.1DNA制备
DNA制备方法见附录A。
7.2DNA条形码片段PCR扩增
利用GAPDH基因的通用引物进行GAPDH基因序列扩增，具体步骤见附录B，测序。7.3序列分析
测序结果利用序列拼接软件进行拼接编辑，比对峰图，判断序列方向，去除测序引物序列，去除两段测序质量Q值小于20的序列。利用美国国家生物技术信息中心（NCBI）在线数据库中比对GAPDH基因序列（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。8结果判定
序列长度约为280bp，序列与美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库中（FJ972584.1）比对相似度大于99%时，即可筛查初步判定为咖啡浆果炭疽病菌，咖啡浆果炭疽病菌的GAPDH基因参考序列参见附录C。进一步鉴定按SN/T3679进行。9菌种保存
9.1样品保存
分离到的咖啡浆果炭疽病菌菌种，转人麦芽提取物琼脂（MEA）试管斜面培养基上，置于4℃黑暗条件下保存至少12个月，以备复验、谈判和仲裁。9.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，序列需要保存电子文件。2
A.1核酸制备
附录A
（规范性附录）
DNA制备
SN/T4877.8—2017
称取0.1g培养物，放在无菌的多层滤纸上，吸去水分，置于无菌的研钵中，用液氮冷冻，用研磨棒将它们研成粉末；立即转移到2mL的离心管中，加人65℃预热的DNA裂解液（SDS）提取液700μL，置于水浴锅中65℃水浴30min，期间不断混勾；加人5μL10mg/mLRNA酶，充分混勾，在37℃放置30min；加人等体积的Tris饱和酚，充分摇匀，在12000r/min下离心15min，取上清液，加人1：1氯仿-异戊醇（24：1），在12000r/min下离心15min；再取上清液，加人1：1氯仿-异戊醇（24：1），在12000r/min下离心15min；加入等体积预冷的异丙醇，轻轻摇晃，置于一20℃冰箱静置30min，在12000r/min下离心15min；弃上清，加人70%乙醇500μL，12000r/min下离心3min，去上清，重复2次；得到DNA沉淀，用冷冻干燥仪进行干燥，加人30μL～50μLTE或无菌去离子水，充分溶解后，测量DNA的纯度和浓度后置于一20℃冰箱中保存。注：该核酸制备也可采用DNA提取试剂盒法或CTAB法等A.2DNA浓度及纯度测定
用核酸蛋白分析仪测定DNA的纯度与浓度，分别取得260nm和280nm处的吸收值，计算核酸的纯度和浓度，计算公式如下：
DNA纯度=OD260/OD280
DNA浓度=50XOD25o（μg/mL）
PCR级DNA溶液的OD260/OD280比值为1.7~1.9。3
SN/T4877.8—2017
引物序列
附录B
（规范性附录）
扩增程序
GDF:5\-GCCGTCAACGACCCCTTCATTGA-3\GDR:5\-GGGTGGAGTCGTACTTGAGCATGT-3\B.2扩增体系及条件
扩增反应的组成成分为：10×PCR缓冲液5LdNTPSo.25μL，10μmol/L前后向引uLommo
物各2.5μL，5U/μLTaq酶0.25μL，模板DNA5μL，补充去离子水至50μL。将反应体系混匀后置于PCR仪中进行反应。
反应用双蒸水作空白对照，阳性对照采用含有咖啡浆果炭疽菌的DNA作为模板，阴性对照以不含有咖啡浆果炭疽菌的DNA作为模板，每个样品重复2次。扩增反应程序为：95℃预热5min，进人循环反应：95℃变性30s60℃退火30s72℃延伸45s，
共循环35次，循环后72℃延伸7min。B.3琼脂糖凝胶电泳
每个样品取3μL的PCR产物与1L的6×上样缓冲液混合均匀，并加到含有溴化乙锭（0.5ug/mL）的1.2%琼脂糖凝胶的点样孔中，在120V下进行电泳。电泳结束后在凝胶成像系统中观察、拍照，并保存照片。
序列号（FJ972584.1）
附录C
（资料性附录）
GAPDH片段参考序列
SN/T4877.8—2017
GCCGTCAACGCCCCTTCATTGAGACCAAGTACGCTGTGAGTATCACCCCACCTACCCCTCCAAACTCGTCATGACTCTCATCCACCACCAACACCACCGCTGTCATCCACACCTCGCCGCCTGCATCTGGTAGACAAGAAGGTTATCTTGACTTGATGTGAATTGAAATCATGGGCCGGGACGGCGGGACACATGCTATCACTCACAGCAGACCCATCTGTCACATTTACTGACTCGCTCTTCACAGGCCTACATGCTCAAGAG
SN/T4877.8—2017
参考文献
[1JG.Tao,K.D.Hydeand L.Cail,2o12,Species-specific real-timePCRdetection of Colletotrichumkahawae.JournalofApplied Microbiology,v.114,p.828-835.[2]Gunjan Sharma&.NavinderKumar &Bevan S.Weir&KevinD.Hyde&BelleDamodaraShenoy,20o9,The ApMat marker can resolve Colletotrichum species:a case study with Mangifera indica:FungalDiversity,DO110.1007/s13225-013-0247-4.[3]Cai,L.,Hyde,K.D.,Taylor,P.W.J.,Weir,B.S.,Waller,J.,Abang,M.M.,Zhang,J.Z.,Yang,Y.L.et al.20o9,A polyphasic approach for studying Colletotrichum.Fungal Divers 39,183-204.
[4]Crouch,J.,Clarke,B.and Hillman,B.(2oo9)What isthevalueof ITS sequencedata inColletotrichum systematic and species diagnosis? A case study using the falcatespored graminicolousColletotrichumgroup.Mycologia1ol,648-656.
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