中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.8—2017 基因条形码筛查方法 第8部分：检疫性炭疽菌 DNA barcoding screening method Part 8: Quarantine Colletotrichum kahawae 发布：2017-08-29 实施：2018-04-01 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分10个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌；第9部分：检疫性腥黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉。本部分为第8部分，按照GB/T1.1—2009规则起草。起草单位包括中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局。主要起草人：程颖慧、章桂明、高瑞芳、王颖、史亚千、汪莹、段维军、向才玉、潘广、王红英、谢晓露。 1 范围 本部分规定了咖啡浆果炭疽病菌（Colletotrichum kahawae）DNA条形码筛查中序列扩增、分析及结果判定等内容，适用于进境植物及植物产品中咖啡浆果炭疽病菌的DNA条形码筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。注日期的引用文件仅适用于该版本，未注日期的引用文件其最新版本（包括修改单）适用：SN/T3679 咖啡浆果炭疽病菌检疫鉴定方法。 3 术语和定义 3.1 DNA条形码（DNA barcode） 指生物体内能够代表该物种的标准DNA片段，具有足够变异性、易扩增且相对较短。 3.2 甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH） GAPDH为糖酵解途径中的关键酶，分子量约46 kDa，属于管家基因，在多种组织中稳定表达，不易受诱导物质影响。 4 咖啡浆果炭疽病菌基本信息 英文名：pathogen of coffee berry disease 学名：Colletotrichum kahawae J.M. Waller et Bridge 异名：Colletotrichum coffeanum var. virulans（Rayner, 1952） 分类地位：真菌界（Fungi）、无性型真菌（Anamorphic fungi）、炭疽菌属（Colletotrichum）。 5 方法原理 以GAPDH基因为DNA条形码，通过PCR扩增目标DNA并进行测序，利用NCBI核酸数据库进行比对，根据序列相似度实现物种筛查与鉴定。 6 仪器设备和试剂 6.1 仪器设备 超净工作台、摇床、烘箱、高压灭菌锅、-20℃低温冰箱、PCR扩增仪、冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、琼脂糖电泳仪、凝胶成像系统、纯水器等。 6.2 试剂 氯仿、异戊醇、异丙醇、醋酸钠、甲酰胺、70%乙醇、无水乙醇、Tris饱和酚、Taq DNA聚合酶、明胶、溴化乙锭、DNA片段标记物、DNA裂解液、PCR缓冲液、电泳缓冲液、上样缓冲液、dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）等。 7 筛查鉴定方法 7.1 DNA制备 DNA制备方法见附录A。 7.2 DNA条形码片段PCR扩增 利用GAPDH基因通用引物进行PCR扩增并测序，具体步骤见附录B。 7.3 序列分析 对测序结果进行拼接编辑，检查峰图并判断序列方向，去除引物序列及两端质量Q值小于20的序列。利用NCBI在线数据库（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行GAPDH基因序列比对。 8 结果判定 序列长度约280 bp，当与NCBI数据库参考序列（FJ972584.1）比对相似度大于99%时，可初步判定为咖啡浆果炭疽病菌。进一步鉴定按SN/T3679执行。