中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4877.6—2017 基因条形码筛查方法 第6部分：检疫性嗜酸菌 DNA barcoding screening method Part 6: Quarantine Acidovorax spp. 发布：2017-08-29 实施：2018-04-01 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10个部分： 第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体；第4部分：检疫性茎点霉；第5部分：检疫性拟茎点霉；第6部分：检疫性嗜酸菌；第7部分：检疫性轮枝菌；第8部分：检疫性炭疽菌；第9部分：检疫性黑粉菌；第10部分：检疫性疫霉。 本部分为SN/T4877的第6部分，按照GB/T1.1—2009规则起草，由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。 主要起草人：冯建军、赵文军、田茜、汪莹、龙海、程颖慧、郑耘、章桂明、陈枝楠。 1 范围 本部分规定了 Acidovorax citrulli、Acidovorax cattleyae 和 Acidovorax konjaci 三种检疫性嗜酸菌DNA条形码筛查中序列扩增、分析及结果判定等内容，适用于上述三种检疫性嗜酸菌的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。注日期的引用文件仅适用于该版本，未注日期的引用文件其最新版本（包括修改单）适用： - SN/T1465 西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法 - SN/T3681 魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法 3 术语和定义 3.1 DNA条形码（DNA barcode） 指生物体内能够代表该物种的标准DNA片段，具有足够变异性、易扩增且相对较短。 3.2 内部转录间隔区（ITS） 位于rDNA基因中16S与23S rDNA之间的序列，包括部分tRNA基因及非编码区。由于进化选择压力较小，ITS序列变异性较高，适用于细菌种下群体的特异性检测与鉴定。 4 嗜酸菌基本信息 学名：Acidovorax属 分类地位：细菌界（Bacteria）、薄壁菌门（Gracilicutes）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、嗜酸菌属（Acidovorax），属rRNA组I。 植物性嗜酸菌共5个种，其中3个为进境植物检疫性有害生物： - 瓜类细菌性果斑病菌 Acidovorax citrulli - 兰花褐斑病菌 Acidovorax cattleyae - 魔芋细菌性叶斑病菌 Acidovorax konjaci 另有：燕麦嗜酸菌 Acidovorax avenae、水稻褐条病菌 Acidovorax oryzae 5 方法原理 基于嗜酸菌属16S-23S rDNA的ITS序列分析，对检疫性嗜酸菌进行DNA条形码筛查。 6 仪器、用具及试剂 6.1 仪器 PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微量分光光度仪、台式离心机、超低温冰箱、冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统。 6.2 用具 可调移液器（20 μL、200 μL、1000 μL）及吸头、离心管（2 mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。 6.3 培养基和试剂 营养肉汤液体培养基（NB）：牛肉浸膏3 g、蛋白胨（Peptone），加蒸馏水至1000 mL，pH 7.0～7.2，121℃灭菌15 min。 若制备固体培养基则加入15 g琼脂粉（Agar）制成NA培养基。 所有试剂见附录A、附录B。 7 筛查方法 7.1 DNA制备 对待筛查分离物进行液体或平板培养，采用CTAB法或商品化细菌DNA提取试剂盒提取DNA，测定浓度及纯度后保存于-20℃冰箱备用。