SN/T 4877.6-2017.DNA barcoding screening method-Part 6 :Quarantine Acidovorax spp.
1范围
SN/T 4877.6规定了Acidovorax citrulli、Acidovorax cattleyae 和Acidovorax konjaci 三种检疫性嗜酸菌的DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。
SN/T 4877.6适用于Acidovorax citrulli 、Acidovorax cattleyae 和Acidovorax konjaci三种检疫性嗜酸菌的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1465西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法
SN/T3681魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的,标准的、有足够变异的.易扩增且相对较短的DNA片段。
3.2内部转录间隔区internal transcribed spacer;ITS
在rDNA基因中,位于保守16S和23S rDNA间隔区之间的序列,包括部分tRNA基因和一些非编码区,由于进化选择压力较小,ITS序列比16S和23S rDNA序列本身的变异性更大,因此,ITS适合用于细菌种下不同群体的特异性检测与鉴定。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.6—2017
基因条形码筛查方法
第6部分：检疫性嗜酸菌
DNA barcoding screening method-Part 6:Quarantine Acidovorax spp.2017-08-29发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-04-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》分为10部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体；
第4部分：检疫性茎点霉；
第5部分：检疫性拟茎点霉；
第6部分：检疫性嗜酸菌；
第7部分：检疫性轮枝菌；
第8部分：检疫性炭疽菌；
第9部分：检疫性黑粉菌；
第10部分：检疫性疫霉。
本部分为SN/T4877的第6部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4877.6—2017
本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院。
本部分主要起草人：冯建军、赵文军、田茜、汪莹、龙海、程颖慧、郑耘、章桂明、陈枝楠。I
1范围
基因条形码筛查方法
第6部分：检疫性嗜酸菌
SN/T4877.62017
SN/T4877的本部分规定了Acidovorarcitrulli、Acidovorarcattleyae和Acidovorarkonjaci三种检疫性嗜酸菌的DNA条形码筛查中序列的扩增、分析及结果判定等。本部分适用于Acidovorarcitrulli、Acidovorarcattleyae和Acidovorarkonjaci三种检疫性嗜酸菌的筛查。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1465西瓜细菌性果斑病菌检疫鉴定方法SN/T3681魔芋细菌性叶斑病菌检疫鉴定方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
DNAbarcode
DNA条形码
生物体内能够代表该物种的，标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。3.2
内部转录间隔区internal transcribed spacer；ITS在rDNA基因中，位于保守16S和23SrDNA间隔区之间的序列，包括部分tRNA基因和一些非编码区，由于进化选择压力较小，ITS序列比16S和23SrDNA序列本身的变异性更大，因此，ITS适合用于细菌种下不同群体的特异性检测与鉴定。4嗜酸菌的基本信息
学名：Acidovorar
分类地位：细菌界（bacteria），薄壁菌门（Gracilicutes）假单胞菌科（Pseudomonaceae）嗜酸菌属（Acidovora），属rRNA组I。目前植物性嗜酸菌有5个种，其中前3个为进境植物检疫性有害生物瓜类细菌性果斑病菌Acidovoracitrulli(Schaadetal.1978)Schaadetal.2008兰花褐斑病菌Acidovoracattleyae（Pavarino1911)Schaadetal.2008魔芋细菌性叶斑病菌Acidovorarkonjaci（Willemsetal.1992）燕麦嗜酸菌Acidovoraravenae(Manns1909)Willemsetal.1992,Schaadetal.2008水稻褐条病菌Acidovoraroryzae（Schaadetal.2008）1
SN/T4877.6—2017
5方法原理
根据嗜酸菌属16S-23SrDNA的ITS序列分析对检疫性嗜酸菌进行DNA条形码筛查。6仪器、用具及试剂
6.1仪器
PCR仪、超净工作台、高压灭菌锅、制冰机、微量分光光度仪、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、电泳仪、凝胶成像系统6.2用具
可调移液器（最大量程为20μL、200μL、1000μL）及相关吸头、离心管（2mL）、PCR管、量筒、烧杯、酒精灯、镊子等。
6.3培养基和试剂
营养肉陈液体培养基（NB）配方为3g牛肉浸膏（Beg蛋白陈（Peptone），1000mL蒸馏水，pH值为7.0～7.2.121℃灭菌15min。若是需要固体平板培养基，加人15g琼脂粉（Agar）灭菌后倒人培养皿中即可配制成NA培养基
所有试剂见附录A、附录B。
7筛查方法
7.1DNA制备
对拟筛查的分离物进行液体培养或平板培养，利用CTAB法或商品化细菌DNA提取试剂盒提取制备DNA，测定DNA浓度及纯度测定后.保存于一20℃冰箱备用。具体步骤见附录A。7.2ITS扩增及测序
利用引物进行ITS序列扩增，然后将扩增PCR产物测序，具体步骤见附录B。7.3序列分析
将测序结果进行整理拼接，去除两端测序引物部分序列，然后将序列在美国国家生物技术信息中心（NCBI)数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，三种检疫性嗜酸菌的DNA条形码见附录C。
8结果判定
若PCR扩增产物电泳结果为阳性，且产物大小约550bp时，可以初步判定该分离物为嗜酸菌；若PCR扩增产物电泳结果为阴性，可以初步判定该分离物不属于嗜酸菌。若将该产物序列在NCBI数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码数据库中进行比对分析，与数据库中某种检疫性嗜酸菌ITS基因序列同源性≥99%，则初步判定该菌为对应检疫性嗜酸菌若进一步判定为目标检疫性嗜酸菌，需要根据标准方法（SN/T1465或SN/T3681）进行最终鉴2
定，无相应标准的按照常规细菌鉴定方法进行最终鉴定。9
样品保存与复核
样品保存与处理
SN/T4877.6—2017
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出检疫性嗜酸菌的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后须经高压灭菌后方可处理。9.2菌株保存与处理
从检测样品中分离并鉴定为检疫性嗜酸菌的菌株，将菌体挑到30%的甘油中混匀，一80℃下保存。9.3
结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳图。3
SN/T4877.6—2017
A.1试剂
附录A
（规范性附录）
DNA提取
十二烷基肌氨酸钠（N-Lauroylsarcosinesodiumsalt，NLS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（Sodiumdodecylsulfate，SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、聚乙烯基吡咯烷酮（PVP）、磷酸氢二钾（K，HPO）、磷酸二氢钾（KH,PO）、牛血清蛋白（BSA）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、盐酸（HCI）、氯化钠（NaCI)、苯酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙醇等。A.2溶液
A.2.1DNA抽提液
Tris-HCl
210%NLS液
100mmol/L(pH8.0)
20mmol/L(pH8.0)
十二烷基肌氨酸钠10g
无菌水
A.2.3TE缓冲液
10mmol/L
1mmol/L(pH8.0)
A.2.4CTAB/NaCI溶液
10%CTAB
0.7mol/LNaCl
蛋白酶K
蛋白酶K
无菌水
37℃水浴1h后分装成单次使用的小份，于一20℃备用。A.3DNA提取
挑取少量纯培养菌株的菌落到1.5mL离心管中，加人1mL无菌水混勾后，10000r/min离心10min；弃上清，加人500μLDNA抽提液、20μL蛋白酶K、80μL10%NLS混合后，55℃水浴1h~SN/T4877.6—2017
2h，然后4℃6000r/min离心10min；取上清，加入400μL异丙醇，一20℃保持30min后，4℃8000r/min离心15min；弃上清，加入600μLTE缓冲液、30μL10%SDS、12μL蛋白酶K，37℃温育30min~60min加100μL5mol/LNaCI混，84μLCTAB-NaCI溶液在65℃水浴10min；加等体积氯仿-异戊醇，8000r/min离心5min，取上清，再加等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提，8000r/min离心5min；取上清，加2倍体积无水乙醇于一20℃沉淀核酸，4℃6000r/min离心10min弃上清，加500μL70%乙醇洗涤，4℃6000r/min离心10min，弃上清，真空干燥DNA，加适量TE悬浮，一20℃短期贮存或一80℃长期贮存备用。基因组DNA提取也可采用等效商品DNA提取试剂盒。SN/T4877.6—2017
引物序列
附录B
（规范性附录）
ITS序列扩增及测序bzxZ.net
ITS3F:5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACTTGAACGCCCACACTTATCGG-3ITS3R：5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGGAGACTTGCGAGGTCTTTCACCT-3注：下划线部分为测序引物M13F-47和M13R-48.全部序列都要合成。B.2PCR扩增体系
PCR扩增体系见表B.1。
试剂名称
10XPCR缓冲液
2.5mmol/LdNTP
10 μmol/LITS3F
10μmol/LITS3R
5U/μLTaqDNA聚合酶
10ng/μL模板DNA
加双蒸水至
加样量/μL
DNA模板的取量应根据DNA的浓度和纯度而调节：反应体系也可以采用等效商品化试剂盒。B.3PCR扩增条件
ITSF3/ITSR3反应程序：94℃预扩增5.min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸10min。
B.4电泳
制备1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，电泳结束后在凝胶成像仪观察并记录结果，PCR产物大小：约550bp。
SN/T4877.6—2017
取20μL～30μLPCR产物送测序公司测序，利用测序引物M13F-47和M13R-48进行双向测序
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