SN/T3567.8—2017 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 交叉引物恒温扩增检测方法 第8部分：原虫 (Detection method of crossing priming isothermal amplification—Part 8: Plasmodium) 2017-07-21 发布 2018-03-01 实施 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分：第1部分：通用技术规程；第2部分：霍乱弧菌；第3部分：大肠杆菌0157：H7；第4部分：黄热病毒；第5部分：沙门菌属；第6部分：结核分枝杆菌；第7部分：肠道病毒71型；第8部分：原虫；第9部分：鼠疫耶尔森菌；第10部分：炭疽芽孢杆菌；第11部分：志贺菌。本部分为SN/T3567的第8部分。 本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：天津国际旅行卫生保健中心、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：左锋、关淳、赵欣、祁军、胡林、尤其敏。 1 范围 SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测原虫的检测对象、检测程序及检测结果报告。本部分适用于在国境口岸对原虫的快速筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T3562 国境口岸原虫PCR检测方法 人间传染的病原微生物名录（卫生部2006） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 交叉引物恒温扩增技术 (crossing priming isothermal amplification: CPA) 一种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶（DNA polymerase）外，还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性链置换特性，使脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic Acid, DNA）的循环扩增能不断地实现。 3.2 交叉引物 (crossing primer) 用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5'末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。 3.3 剥离引物 (bumper primer) 位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。 3.4 检测引物 (detection primer) 一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标记，以用于检测。 3.5 Bst DNA聚合酶 (Bst DNA polymerase) 嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'→3' DNA聚合酶活性，但是去除了5'→3'核酸外切酶活性。Bst DNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（Strand Displacement)。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosine triphosphate） dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidine triphosphate） dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidine triphosphate） dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosine triphosphate） 5 生物安全措施 实验操作及处理按照GB 19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资质的工作人员进行。 6 检测对象 6.1 疑似感染原虫的血液标本。 6.2 来自疾病流行区的蚊虫标本。 7 试剂和材料 除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水。 7.1 DNA提取试剂：5% Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。