SN/T 3567.8-2017.Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part 8 :Plasmodium.
1范围
SN/T 3567.8规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测疟原虫的检测对象、检测程序及检测结果报告。
SN/T 3567.8适用于在国境口岸对疟原虫的快速筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489 实验室生物安全通用要求
SN/T 3562国境口 岸疟原虫PCR检测方法
人间传染的病原微生物名录(卫生部2006)
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1交叉引物恒温扩增技术crossing priming isothermal amplification;CPA
一种核酸恒温扩增技术,CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶(DNAPoly-merase)外,还主要包括交叉引物、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的高活性的链置换特性,使脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid,DNA)的循环扩增能不断的实现。
3.2交叉引物crossing primer
用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5’末端序列与反向引物的杂交序列相同,而反向引物的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同,因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点,促进扩增反应。
3.3剥离引物bumper primer
位于交叉扩增引物后方的短链引物,其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下,将扩增引物的延伸链从模板上剥离。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3567.8—2017
交叉引物恒温扩增检测方法
第8部分：原虫
Detection method of crossing priming isothermal amplification-Part8：Plasmodium
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T3567《交叉引物恒温扩增检测方法》分为11个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：霍乱弧菌；
第3部分：大肠杆菌0157：H7；
第4部分：黄热病毒；
第5部分：沙门菌属；
第6部分：结核分枝杆菌；
第7部分：肠道病毒71型；
第8部分：症原虫；
第9部分：鼠疫耶尔森菌；
第10部分：炭疽芽孢杆菌；
第11部分：志贺菌。
本部分为SN/T3567的第8部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草SN/T3567.8—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：天津国际旅行卫生保健中心、杭州优思达生物技术有限公司。本部分主要起草人：左锋、关淳、赵欣、祁军、胡林、尤其敏。1范围
交叉引物恒温扩增检测方法
第8部分：原虫
SN/T3567.8—2017
SN/T3567的本部分规定了在国境口岸利用交叉引物恒温扩增法检测疟原虫的检测对象、检测程序及检测结果报告。
本部分适用于在国境口岸对原虫的快速筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求SN/T3562国境口岸症原虫PCR检测方法人间传染的病原微生物名录（卫生部2006）3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
交叉引物恒温扩增技术
crossing primingisothermal amplification:CPA一种核酸恒温扩增技术，CPA恒温扩增体系中除包含具有链置换功能的DNA聚合酶（DNAPoly、剥离引物和检测引物。这些寡聚核苷酸链能依靠该DNA聚合酶的merase)外，还主要包括交叉引物高活性的链置换特性，使脱氧核糖核酸（DeoxyribonucleicAcid,DNA）的循环扩增能不断的实现。3.2
交叉引物
crossingprimer
用于交叉扩增的主要引物，其中正向引物的5末端序列与反向引物的杂交序列相同，而反向引物的5'末端序列与正向引物的杂交序列相同，因此在扩增过程中这两条引物互相引入对方的杂交序列，增加引物的杂交位点，促进扩增反应。3.3
剥离引物bumperprimer
位于交叉扩增引物后方的短链引物，其作用是在链置换DNA聚合酶的作用下，将扩增引物的延伸链从模板上剥离。
检测引物
detection primer
一对位于交叉引物内侧的短链引物，需要用半抗原或荧光素标记，其作用是使扩增产物带有该标记，以用于检测。
SN/T3567.8—2017
BstDNA聚合酶BstDNApolymerase嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）DNA聚合酶的部分片段，保留了其5'→3'DNA聚合酶活性，但是去除了5'-→3'核酸外切酶活性。BstDNA聚合酶最主要的特性是具有超强的链置换功能（StrandDisplacement)。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
dNTPs：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate）dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）5生物安全措施
实验操作及处理按照GB19489和原卫生部颁布的《人间传染的病原微生物名录》（2006）的规定，由具备相关资质的工作人员进行。检测对象
疑似感染症原虫的血液标本。
6.2来自症疾流行区的蚊虫标本。7
试剂和材料
除另有规定外，所使用的试剂为分析纯或生化试剂，水为按照GB/T6682规定的一级水7.1
DNA提取试剂：5%Chelex水溶液或细菌基因组DNA提取试剂盒。7.2
10XThermoPol缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L(NH,),SO、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO4、1%TritonX-1007.310mmol/LdNTPs溶液：dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L。BstDNA聚合酶：8U/μL。
甜菜碱溶液：5mol/L。
MgSO，溶液：100mmol/L。
阳性对照：含有目的片段的质粒DNA。7.8
阴性对照：DNA提取试剂。
引物：交叉扩增引物、剥离引物和检测引物。参见附录A。7.10
封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条），装置使用方法参见附录B。8
仪器设备
8.1任何恒温装置，如：水浴锅、金属浴或普通PCR仪。2
SN/T3567.8—2017
微量移液器：量程范围为0.1μL～2μL;0.5μL~10μL；10μL~100μL；100μL～1000μL。计时器。
超净工作台。
生物安全柜。
消毒灭菌锅。
高速台式离心机（最高离心力12000g以上）。台式离心机（最高离心力2000g以上）。涡旋振荡器。
低温冰箱、冷冻冷藏冰箱。
紫外凝胶电泳图像分析系统
检测程序
样本的采集
样本采集按照SN/T3562执行。
蚊虫样本前处理
将待检蚊虫标本每组分别用含青霉素（1000U/mL）、链霉素（1000U/mL）的无菌生理盐水清洗三次，每组蚊样加人2.0mLHank's液，在组织研磨器中研磨或电动匀浆机中匀浆20s～30s，使样本勾浆成糊状，12000r/min离心3min，取上清液作为样本。模板DNA提取
从血样本和蚊虫样本中提取DNA按照SN/T3562执行。9.4交叉引物恒温扩增
9.4.1扩增引物
用于检测症原虫的交叉引物恒温扩增引物序列参见附录A。9.4.2阳性对照、阴性对照和空白对照设置实验过程中需要分别设阳性对照、阴性对照和空白对照，阳性对照采用含检测序列的质粒DNA作为交叉引物恒温扩增模板；阴性对照以DNA提取液代替交叉引物恒温扩增模板；空白对照则采用无菌水作为交叉引物恒温扩增模板。9.4.3交叉引物恒温扩增反应体系交叉引物恒温扩增反应检测症原虫的参考反应体系见表1。表1症原虫交叉引物恒温扩增参考反应体系试剂名称
10×ThermoPol缓冲液
10mmol/LdNTPs
剥离引物F和B
储备液浓度
10mmol/L
20μmol/L
20μL体系加样量
各0.1μL
SN/T3567.8—2017
试剂名称
交叉扩增引物F和R
检测引物F和B
甜菜碱
BstDNA聚合酶
交叉引物恒温扩增反应程序
表1（续）
储备液浓度
20μmol/L
20μmol/L
100mmol/L
5mol/L
8U/μL
50ng/ml
将配制好的扩增反应液PCR管置于恒温仪器上，63℃温浴60min。9.4.5
交叉引物恒温扩增产物检测
20μL体系加样量
各0.2μL
1μL~4μL
补足反应体系至20μL
扩增产物经过2%琼脂糖凝胶电泳，在紫外凝胶电泳图像分析系统下观察分析扩增产物。9.4.5.1
可使用但不限于通过封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）检测交叉引物恒温扩增产物，该方法灵敏度较高，且可降低交叉污染的风险。具体操作步骤参见B.1。9.4.6
检测结果判定
电泳产生梯形条带判定为交叉引物恒温扩增检测阳性。9.4.6.1
可使用封闭式一次性核酸检测装置方法的结果描述及判定参见B.3。剥离引物
附录A
（资料性附录）
症原虫CPA检测的引物序列
1-PGF3TTATCAATCGAGTTTCTGACC
1-PGB3
CTTGTCACTACCTCTCTTCwwW.bzxz.Net
交叉引物
1-PGCPF
SN/T3567.8—2017
TCGAACTCTAATTCCCCGTTACCTATCAGCTTTTGATGTTAGGGTGTATTGACCTAACATGCCTATGCTATTTCTCAGGCTCCCTCTC2-PGCPR
检测引物
1-PGDR5F
1-PGDR5B
TCGAACTCTAATTCCCCGTTACC
CGTCATAGCCATGTTAGG
SN/T3567.8—2017
附录B
（资料性附录）
封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条）操作步骤及操作示意图
B.1.1将扩增后的反应管（不可开盖，以避免污染）放人封闭式一次性核酸检测装置（含核酸检测试纸条)的固定盒(内芯)中，合上固定盒后将其装入装置外盒。B.1.2按手柄至检测装置于关闭状态（听见清脆的“咔嗪”声）。B.1.3将检测装置放置在操作台上，请通过阅读窗判读结果。15min～30min为最佳判读时间，但不应超过2h。
记录检测结果，丢弃检测装置在安全处。操作示意图见图B.1
将扩增后未打开的PCR管
放入固定盒
合上手柄盖
质控方法
阴性对照仅出现一条红线（在质控区C）。图B.1
合上固定盒
将固定盒插入外盒
压紧手柄盖并扣死
阳性对照出现两条红线：一条位于检测区（T)，另一条位于质控区（C)。每个测试样本至少出现一条质控线，有或无检测线。判读结果
3结果描述及判定
SN/T3567.8—2017
仅在质控区C出现一条红线，表示样品中无待测病原体；或其拷贝数低于该检测试剂的最低检B.3.1
测限。
B.3.2出现两条红线，一条检测线，一条质控线，表示样品中存在待测病原体或基因。将检测线强度与色卡进行对照：≥L4，为阳性；无效。
4检测结果判读示意图
检测结果判读示意图见图B.2
质控线(C)
检测线(T)
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