SN/T 3446-2012
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标准简介
SN/T 3446-2012.Detection and identification of Candidatus phytoplasma Australiense.
1范围
SN/T 3446规定了澳大利亚植原体候选种的检疫鉴定方法。
SN/T 3446适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。
2原理
2.1分类地位
澳大利亚植原体候选种( candidatus phytoplasma' australiense),软壁菌门( Tendericutes),柔膜菌纲( Mollicuteria),菌原体目(Mycoplasmatales),非醇原体科(Acholeplasmataceae),植原体候选属(candidatus phytoplasma),16SrX II组植原体。
2.2 检测依据
本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定。
对植物材料进行症状观察,发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测;DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法;PCR技术结合RFDR技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法,在本标准中PCR技术片RFLP技术结合作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法;电子显微镜观察可以清晰、直观地观察到植原体粒体形态。
1范围
SN/T 3446规定了澳大利亚植原体候选种的检疫鉴定方法。
SN/T 3446适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。
2原理
2.1分类地位
澳大利亚植原体候选种( candidatus phytoplasma' australiense),软壁菌门( Tendericutes),柔膜菌纲( Mollicuteria),菌原体目(Mycoplasmatales),非醇原体科(Acholeplasmataceae),植原体候选属(candidatus phytoplasma),16SrX II组植原体。
2.2 检测依据
本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定。
对植物材料进行症状观察,发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测;DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法;PCR技术结合RFDR技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法,在本标准中PCR技术片RFLP技术结合作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法;电子显微镜观察可以清晰、直观地观察到植原体粒体形态。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3446--2012
澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus phytoplasma Australiense2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
的百摄
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3446—2012
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：牟海青、赵文军、张京宣、王仁睿、朱水芳、段胜男、王有福。1范围
澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法本标准规定了澳大利亚植原体候选种的检疫鉴定方法。SN/T3446-2012
本标准适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。2原理
2.1分类地位
澳大利亚植原体候选种（candidatusphytoplasnraustraliense），软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales）非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属(candidatusphytoplasma），16SrXⅡ组植原体2.2检测依据
本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定。
对植物材料进行症状观察，发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测；DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法；PCR技术结合,RFIP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中PCR技术片RFLP技术结合作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法：电子显微镜观察可以清晰、直观地观察到植原体粒体形态。3器材与试剂
3.1仪器
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。3.2试剂
DAPI(4\,6-二基-2-苯基吲哚）、PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。4检测与鉴定方法
4.1症状观察
仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状，症状描述参见附录A，1。4.2DAPI染色
选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4\，6-二胖基-2-苯基吲哚)染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号1
SN/T3446—2012
表明有植原体存在。每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。3电子显微镜观察
将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。方法参见附录B。
4.4通用引物进行PCR扩增并测序通用引物PCR凝胶电泳并测序（见附录C）。4.5虚拟RFLP指纹图谱检测
见附录D。
5结果判定
5.1表现症状与A.1.1描述一致且4.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为澳大利亚植原体候选种，但需通过4.4、4.5任一方案进一步检测。5.2在4.3检测中，若通过电子显微镜观察，发现葡萄韧皮部筛管中含有直径为500nm～1000nm的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体，则可初步判定为澳大利亚植原体候选种，但需要4.4、4.5任一方案的进一步检测。
5.3在4.4检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，可初步判定为澳大利亚植原体候选种，经序列测定并比对后，若与C.4中序列同源性大于97.5%，则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。5.4在4.5检测中，将4.4检测中测得的植原体16SrDNA序列经17种限制性内切酶进行虚拟酶切后，若酶切图谱与图D.1一致，则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。6样品保存与复核
6.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出澳大利亚植原体候选种的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类，时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。6.3复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。2
A.1澳大利亚植原体候选种
A.1.1表现症状
附录A
（资料性附录）
澳大利亚植原体候选种生物学特性SN/T3446—2012
由CaPa引起的葡萄黄化病在澳大利亚新南威尔士和维多利亚温暖地区的葡萄园中频繁发生。此外，CaPa还可以引起多种经济作物的严重病害：侵染葡萄时，引起葡萄黄化病，其症状和危害与葡萄金黄化病相似；侵染草莓时，引起草莓致死性黄化病，可导致草莓苗死亡；侵染番木瓜时，引起番木瓜顶枯病，是毁灭性病害；侵染澳洲朱蕉时，引起澳洲朱蕉猝衰病；侵染新西兰亚麻时，引起新西兰亚麻黄叶病，是致死性病害。因此，经济影响十分重要。A.1.2寄主
已知寄主包括葡萄（Vitisinifera）草莓（Fragariaananassa），番木瓜（Caricapapaya），澳洲朱蕉（Cordylineaustralis）、新西兰亚麻（Phormiumtenar）、山亚麻（P.cookianum、Coprosmarobusta）、红三叶草（Trifoliumpratense）、稻瓜（Cucumismyriocarpus）、笋瓜（Cucurbitamarima）南瓜（C.moschata）、北美枫香（Liquidambarstyraciflua）、桃（Prunuspersicae）和紫花首（Medicagosatiua）、马铃薯（SolanumtuberosumL)等。
A.1.3传播介体
叶蝉（Oliarusatkinsoni）、丝子（Cuscuta）等。A.1.4地理分布
以色列、澳大利亚，新西兰，玻利维亚：中国无报道。A.1.5形态学特性
植原体寄生于植物韧皮部的筛管内，形态（见图A.1)大小约在500nm～1000nm，并能够通过细菌滤器，不具有细胞壁，呈现多型性，一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等多型性。由于生长周期不同，植原体呈现初生体、小球体、大球状体和丝状体等形态。图A.1形态特征
SN/T3446—2012
A.1.6分子生物学信息
环状基因组大小为879324bp，GC含量为27%，且含有一个3.7kb的质粒。基因组含有约839个阅读框（ORF），其中约500个编码蛋白的基因，337个基因编码假定的蛋白，以UGA为终止密码子。澳大利亚植原体候选种仅编码一个基因用于氧化磷酸化作用，仅编码一个基因用于甘油脂类代谢，缺失ATP合成途径、脂肪酸代谢途径以及二氧化碳固定功能。A.2植原体细胞的富集
A.2.1溶液配制
植原体细胞富集缓冲液（100nL）：无水KzHPO，.67g，KH.PO0.41g，蔗糖10g，牛血清白蛋白0.15g，PVP-102g，维生素Co53g，用5mol/L的KH调节pH值至7.6。A.2.2植原体细胞的富集方法
称取新鲜样品叶中脉1.5g，加入7mL28ml新制备的提取缓冲液，50mg的石英砂，于研钵中研磨。冰上放置10min～15min，加人5mL相同的缓冲液并摇晃均勾；将悬浊液转移至15ml.离心管。5000r/min使用预冷的离心转头BeckmanJA20>4rC离心5-mim将上清液移至另一个离心管中，19000r/min离心20min，干燥沉旋并用60℃预热的2mL2%cTAB溶液，重悬沉淀；60℃水浴中温浴，并不定期的摇动。
A.3DNA提取
A.3.1溶液配制
DNA提取缓冲液：2%CTAB@5o℃左右溶解），1.4/mol/ANac1.2ommol/LEDTA，100mmol/1.Tris-HCl H8。
DNA提取方法
DNA提取缓冲液；将离心管置于65℃水浴中将1mL富集样品转移至2币L离心管，加人1L温浴1h～1.5h，每隔20min左右将离心管颠倒混；200bg，4离心2min；将离心后的上清液转移至一个新的离心管中，加人三氯甲烷/异戊醇（24/1）1mL，混么形成乳浊液；将乳浊液在13000g条件下，离心5min；将上清液转人新管，加人800μL预冷的异丙醇，15000g条件下，离心10min：弃上清液，加人500ul的70%乙醇，在15000g的条件下，离心5min；弃掉上清液，干燥沉淀，加人100μl.的灭菌蒸馏水溶解。
其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80的条件下可以冻存1年。
B.1试剂试材
B.1.1酸固定液
巴比妥-乙酸缓冲液的1%钱酸固定液①溶液
巴比妥钠（C.HNzONa）
乙酸钠（CHCOONa）
加双蒸馏水至100mL
②溶液
2%钱酸水溶液
①溶液
0.1mol/L盐酸（HCl)
加双蒸馏水至25.0mL。
附录B
（资料性附录）
电子显微镜观察
1-15-g
SN/T3446—2012
混合后用0.1mol/L盐酸调至pH为7.2.即为1%钱酸固定液，在冰箱保存备用。B.1.2戊二醛固定液
可配制在除巴比要以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。般为25%戊二醛水溶液。
B.1.3环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐（DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯(D.B.P)
二乙基苯胺（D.M.P-30)
按上述比例，顺序加人DDSA，充分搅拌，待熔化将Epon812倒人烧杯中，置80C温箱融化备用/呈透明，至室温，再加人邻苯二甲酸二下酯·仔细搅拌，然后慢慢逐滴加人二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸人蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养Ⅲ干燥备用。
B.2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现症状的葡萄叶片或者幼嫩茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm。取健5
SN/T3446—2012Www.bzxZ.net
康葡萄叶片作为阴性对照。
2固定
采用戊二醛-钱酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4）清洗三次。然后用1%钱酸后固定2h，PBS清洗三次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min50%乙醇/15min-→70%乙醇/15min-+80%丙酮15min-90%丙酮/15min→+100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在丙酮/树脂(1：1)中渗透3d，再在全树脂中渗透1d。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴人包埋剂。于37℃下24h，45℃下24h，60℃下24h。
B.2.6切片
在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内干燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴人蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min～30min，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余染液滤纸吸干。将铜网再放人另一蜡盘，滴人柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液滴上，染20min～30min，再用0.1mol/l.氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，如A.1.5。C.1引物序列
植原体通用引物：
附录C
（规范性附录）
通用引物PCR检测
R16F2n:5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3R16R2:5-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-32PCR反应体系及参数
C.2.1PCR反应体系
见表C.1。
表C.1PCR反应体系
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
正向引物
反向引物
TagDNA聚合酶
DNA模板
补H20至
注：DNA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节。C.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的葡萄叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有植原体16SrDNA序列的质粒为模板，PCR反应的空白对照：以水代替DNA模板C.2.3PCR的反应参数
终浓度
2.5mmol/l
0.1mmol/L
0.5μmol/L
0.5μmol/L
SN/T3446-2012
R16F2n/R16R2.94C/2min：94C/1min.60C/30S.72C/1min.35个循环：72C10min注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。3琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，以DNAMarker作为相对分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝7
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澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法Detection and identification of Candidatus phytoplasma Australiense2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
的百摄
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3446—2012
本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：牟海青、赵文军、张京宣、王仁睿、朱水芳、段胜男、王有福。1范围
澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法本标准规定了澳大利亚植原体候选种的检疫鉴定方法。SN/T3446-2012
本标准适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。2原理
2.1分类地位
澳大利亚植原体候选种（candidatusphytoplasnraustraliense），软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales）非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属(candidatusphytoplasma），16SrXⅡ组植原体2.2检测依据
本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定。
对植物材料进行症状观察，发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测；DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法；PCR技术结合,RFIP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中PCR技术片RFLP技术结合作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法：电子显微镜观察可以清晰、直观地观察到植原体粒体形态。3器材与试剂
3.1仪器
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。3.2试剂
DAPI(4\,6-二基-2-苯基吲哚）、PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、引物等。4检测与鉴定方法
4.1症状观察
仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状，症状描述参见附录A，1。4.2DAPI染色
选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mLDAPI溶液（4\，6-二胖基-2-苯基吲哚)染色，在460nm激发条件，荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号1
SN/T3446—2012
表明有植原体存在。每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。3电子显微镜观察
将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体粒体。方法参见附录B。
4.4通用引物进行PCR扩增并测序通用引物PCR凝胶电泳并测序（见附录C）。4.5虚拟RFLP指纹图谱检测
见附录D。
5结果判定
5.1表现症状与A.1.1描述一致且4.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为澳大利亚植原体候选种，但需通过4.4、4.5任一方案进一步检测。5.2在4.3检测中，若通过电子显微镜观察，发现葡萄韧皮部筛管中含有直径为500nm～1000nm的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体，则可初步判定为澳大利亚植原体候选种，但需要4.4、4.5任一方案的进一步检测。
5.3在4.4检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，可初步判定为澳大利亚植原体候选种，经序列测定并比对后，若与C.4中序列同源性大于97.5%，则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。5.4在4.5检测中，将4.4检测中测得的植原体16SrDNA序列经17种限制性内切酶进行虚拟酶切后，若酶切图谱与图D.1一致，则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。6样品保存与复核
6.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出澳大利亚植原体候选种的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。6.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类，时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。6.3复核
由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。2
A.1澳大利亚植原体候选种
A.1.1表现症状
附录A
（资料性附录）
澳大利亚植原体候选种生物学特性SN/T3446—2012
由CaPa引起的葡萄黄化病在澳大利亚新南威尔士和维多利亚温暖地区的葡萄园中频繁发生。此外，CaPa还可以引起多种经济作物的严重病害：侵染葡萄时，引起葡萄黄化病，其症状和危害与葡萄金黄化病相似；侵染草莓时，引起草莓致死性黄化病，可导致草莓苗死亡；侵染番木瓜时，引起番木瓜顶枯病，是毁灭性病害；侵染澳洲朱蕉时，引起澳洲朱蕉猝衰病；侵染新西兰亚麻时，引起新西兰亚麻黄叶病，是致死性病害。因此，经济影响十分重要。A.1.2寄主
已知寄主包括葡萄（Vitisinifera）草莓（Fragariaananassa），番木瓜（Caricapapaya），澳洲朱蕉（Cordylineaustralis）、新西兰亚麻（Phormiumtenar）、山亚麻（P.cookianum、Coprosmarobusta）、红三叶草（Trifoliumpratense）、稻瓜（Cucumismyriocarpus）、笋瓜（Cucurbitamarima）南瓜（C.moschata）、北美枫香（Liquidambarstyraciflua）、桃（Prunuspersicae）和紫花首（Medicagosatiua）、马铃薯（SolanumtuberosumL)等。
A.1.3传播介体
叶蝉（Oliarusatkinsoni）、丝子（Cuscuta）等。A.1.4地理分布
以色列、澳大利亚，新西兰，玻利维亚：中国无报道。A.1.5形态学特性
植原体寄生于植物韧皮部的筛管内，形态（见图A.1)大小约在500nm～1000nm，并能够通过细菌滤器，不具有细胞壁，呈现多型性，一般有球形、椭圆形、长杆形、梭形、带状和多态不规则形等多型性。由于生长周期不同，植原体呈现初生体、小球体、大球状体和丝状体等形态。图A.1形态特征
SN/T3446—2012
A.1.6分子生物学信息
环状基因组大小为879324bp，GC含量为27%，且含有一个3.7kb的质粒。基因组含有约839个阅读框（ORF），其中约500个编码蛋白的基因，337个基因编码假定的蛋白，以UGA为终止密码子。澳大利亚植原体候选种仅编码一个基因用于氧化磷酸化作用，仅编码一个基因用于甘油脂类代谢，缺失ATP合成途径、脂肪酸代谢途径以及二氧化碳固定功能。A.2植原体细胞的富集
A.2.1溶液配制
植原体细胞富集缓冲液（100nL）：无水KzHPO，.67g，KH.PO0.41g，蔗糖10g，牛血清白蛋白0.15g，PVP-102g，维生素Co53g，用5mol/L的KH调节pH值至7.6。A.2.2植原体细胞的富集方法
称取新鲜样品叶中脉1.5g，加入7mL28ml新制备的提取缓冲液，50mg的石英砂，于研钵中研磨。冰上放置10min～15min，加人5mL相同的缓冲液并摇晃均勾；将悬浊液转移至15ml.离心管。5000r/min使用预冷的离心转头BeckmanJA20>4rC离心5-mim将上清液移至另一个离心管中，19000r/min离心20min，干燥沉旋并用60℃预热的2mL2%cTAB溶液，重悬沉淀；60℃水浴中温浴，并不定期的摇动。
A.3DNA提取
A.3.1溶液配制
DNA提取缓冲液：2%CTAB@5o℃左右溶解），1.4/mol/ANac1.2ommol/LEDTA，100mmol/1.Tris-HCl H8。
DNA提取方法
DNA提取缓冲液；将离心管置于65℃水浴中将1mL富集样品转移至2币L离心管，加人1L温浴1h～1.5h，每隔20min左右将离心管颠倒混；200bg，4离心2min；将离心后的上清液转移至一个新的离心管中，加人三氯甲烷/异戊醇（24/1）1mL，混么形成乳浊液；将乳浊液在13000g条件下，离心5min；将上清液转人新管，加人800μL预冷的异丙醇，15000g条件下，离心10min：弃上清液，加人500ul的70%乙醇，在15000g的条件下，离心5min；弃掉上清液，干燥沉淀，加人100μl.的灭菌蒸馏水溶解。
其他的DNA提取方法也可以借鉴，也可以选择使用商业DNA提取试剂盒，提取的DNA在一80的条件下可以冻存1年。
B.1试剂试材
B.1.1酸固定液
巴比妥-乙酸缓冲液的1%钱酸固定液①溶液
巴比妥钠（C.HNzONa）
乙酸钠（CHCOONa）
加双蒸馏水至100mL
②溶液
2%钱酸水溶液
①溶液
0.1mol/L盐酸（HCl)
加双蒸馏水至25.0mL。
附录B
（资料性附录）
电子显微镜观察
1-15-g
SN/T3446—2012
混合后用0.1mol/L盐酸调至pH为7.2.即为1%钱酸固定液，在冰箱保存备用。B.1.2戊二醛固定液
可配制在除巴比要以外的任何缓冲液中使用，终浓度为25%。般为25%戊二醛水溶液。
B.1.3环氧树脂
Epon812
顺丁烯二酸酐（DDSA）
邻苯二甲酸二丁酯(D.B.P)
二乙基苯胺（D.M.P-30)
按上述比例，顺序加人DDSA，充分搅拌，待熔化将Epon812倒人烧杯中，置80C温箱融化备用/呈透明，至室温，再加人邻苯二甲酸二下酯·仔细搅拌，然后慢慢逐滴加人二乙基苯胺，边加边搅拌，至包埋剂呈红棕色。
B.1.4Formvar膜
将聚乙烯醇缩甲醛溶于三氯甲烷，配成0.2%～3%溶液，存于冰箱备用。制膜时取一块干净玻璃片插人溶液中，取出倾斜待三氯甲烷挥发，用镊子沿玻璃边划痕，再将玻璃倾斜浸人蒸馏水中，薄膜即从玻璃上脱落下来漂浮于水面，取干净的铜网摆上，压紧，在用一块滤纸覆盖其上，捞起后置于培养Ⅲ干燥备用。
B.2实验步骤
B.2.1取材
选取呈现症状的葡萄叶片或者幼嫩茎，用刀片切取叶脉、叶柄或者幼嫩枝条，大小为3mm。取健5
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康葡萄叶片作为阴性对照。
2固定
采用戊二醛-钱酸双固定法。样品在25%戊二醛进行前固定2h后，PBS(0.2mol/LpH7.4）清洗三次。然后用1%钱酸后固定2h，PBS清洗三次。B.2.3脱水
采用乙醇和系列梯度脱水。30%乙醇/15min50%乙醇/15min-→70%乙醇/15min-+80%丙酮15min-90%丙酮/15min→+100%丙酮/15min。样品可在70%乙醇中停留过夜。B.2.4渗透
脱水后的组织块在丙酮/树脂(1：1)中渗透3d，再在全树脂中渗透1d。B.2.5包埋
用环氧树脂做包埋剂。将组织块放在胶囊中央，滴人包埋剂。于37℃下24h，45℃下24h，60℃下24h。
B.2.6切片
在超薄切片机上将固化的组织块作切片。选择好的切片，将切片用二甲苯蒸发展开，用载有Formvar膜的铜网捞起，置培养血内干燥、保存。B.2.7切片染色
采用乙酸双氧铀和柠檬酸铅双染色。取染色蜡盘数个，将乙酸双氧铀染色滴人蜡盘上。取带切片的铜网，插人染色滴中，染20min～30min，然后取出铜网，蒸馏水洗去多余染液滤纸吸干。将铜网再放人另一蜡盘，滴人柠檬酸铅染液，使铜网翻扣在染色液滴上，染20min～30min，再用0.1mol/l.氢氧化钠漂洗干净，滤纸吸干。
B.2.8显微镜观察
透射电子显微镜观察植原体形态，如A.1.5。C.1引物序列
植原体通用引物：
附录C
（规范性附录）
通用引物PCR检测
R16F2n:5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3R16R2:5-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-32PCR反应体系及参数
C.2.1PCR反应体系
见表C.1。
表C.1PCR反应体系
试剂名称
10XPCR反应缓冲液
正向引物
反向引物
TagDNA聚合酶
DNA模板
补H20至
注：DNA模板的取量应根据DNA的提取浓度、纯度而调节。C.2.2阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的葡萄叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有植原体16SrDNA序列的质粒为模板，PCR反应的空白对照：以水代替DNA模板C.2.3PCR的反应参数
终浓度
2.5mmol/l
0.1mmol/L
0.5μmol/L
0.5μmol/L
SN/T3446-2012
R16F2n/R16R2.94C/2min：94C/1min.60C/30S.72C/1min.35个循环：72C10min注：不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。3琼脂糖凝胶电泳
制备1%的琼脂糖凝胶，以DNAMarker作为相对分子质量标记，进行电泳分析，电泳结束后在凝7
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