中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3446-2012 澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法 Detection and identification of Candidatus Phytoplasma australiense 2012-12-12发布 | 2013-07-01实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T3446—2012。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：牟海青、赵文军、张京宣、王仁睿、朱水芳、段胜男、王有福。 1 范围 澳大利亚植原体候选种检疫鉴定方法本标准规定了澳大利亚植原体候选种的检疫鉴定方法。本标准适用于澳大利亚植原体候选种寄主种苗中的澳大利亚植原体候选种的检疫和鉴定。 2 原理 2.1 分类地位 澳大利亚植原体候选种（Candidatus Phytoplasma australiense），软壁菌门（Tenericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属（Candidatus Phytoplasma），16Sr Ⅱ组植原体。 2.2 检测依据 本标准主要采用形态生物学特性与分子生物学技术相结合的方法对澳大利亚植原体候选种进行检测鉴定。 对植物材料进行症状观察，发现有丛枝、黄化、红叶、卷曲等症状则进行进一步的检测；DAPI荧光染色方法可以作为一种初步检测植原体的方法；PCR技术结合RFLP技术目前是国际上植原体鉴定分类的主要方法，在本标准中，PCR技术结合RFLP技术作为鉴定澳大利亚植原体候选种的准确方法；电子显微镜观察可以清晰、直观地观察到植原体颗粒形态。 3 器材与试剂 3.1 仪器 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、超低温冰箱、常规冰箱、旋涡振荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、荧光显微镜、电子显微镜。 3.2 试剂 DAPI（4,6-二苯基-2-苯基吲哚）、PCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Taq DNA聚合酶、引物等。 4 检测与鉴定方法 4.1 症状观察 仔细观察种苗是否表现植原体侵染症状，症状描述参见附录A。 4.2 DAPI染色 选取幼嫩组织（新叶叶梗，枝梢，茎杆及根部韧皮部组织），切片，用1μg/mL DAPI溶液（4,6-二苯基-2-苯基吲哚）染色，在460nm激发条件下，用荧光显微镜观察，在韧皮部筛管部位有明显的蓝色荧光信号表明有植原体存在。每个样品需选取不同部位的幼嫩材料进行检测。 4.3 电子显微镜观察 将采集的样品制备超薄切片，通过电子显微镜观察植物韧皮部是否存在植原体颗粒。方法参见附录B。 4.4 通用引物进行PCR扩增并测序 利用通用引物进行PCR凝胶电泳并测序（见附录C）。 4.5 虚拟RFLP指纹图谱检测 见附录D。 5 结果判定 5.1 表现症状与附录A.1.1描述一致，且在4.2检测实验中DAPI染色观察结果显示蓝色荧光，可初步判定为澳大利亚植原体候选种，但需通过4.4、4.5任一方案进一步检测。 5.2 在4.3检测中，若通过电子显微镜观察，发现葡萄韧皮部筛管中含有直径为500nm～1000nm的圆形、椭圆形、不规则形状等的菌原体，则可初步判定为澳大利亚植原体候选种，但需要4.4、4.5任一方案的进一步检测。 5.3 在4.4检测中，若PCR产物凝胶电泳检测结果为阳性，可初步判定为澳大利亚植原体候选种，经序列测定并比对后，若与附录C.4中序列同源性大于97.5%，则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。 5.4 在4.5检测中，将4.4检测中测得的植原体16Sr DNA序列经17种限制性内切酶进行虚拟酶切后，若酶切图谱与图D.1一致，则可判定该样品携带澳大利亚植原体候选种。 6 样品保存与复核 6.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出澳大利亚植原体候选种的样品应保存于-20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌后方可处理。 6.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间、实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片。 6.3 复核 由国家质量监督检验检疫总局指定的单位或人员负责。主要考察实验记录、照片等资料的完整性和真实性，必要时进行复核实验。 附录A A.1 澳大利亚植原体候选种 A.1.1 表现症状