SN/T4877.3—2017 基因条形码筛查方法 第3部分：检疫性植原体 2017-07-21发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2018-03-01实施 前言 SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；第2部分：检疫性黄单胞菌；第3部分：检疫性植原体。本部分为SN/T4877的第3部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国广西出入境检验检疫局、福建省农业科学院、中华人民共和国天津出入境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、李为民、杜智新、谢丽雪、田茜、廖芳。 1 范围 SN/T4877的本部分规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。本部分适用于检疫性植原体的筛查鉴定。 2 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 2.1 DNA条形码：生物体内能够代表该物种的，标准的，有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。 2.2 16S rRNA基因：原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16S rRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，16S rRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，在植原体的分类鉴定中广泛应用。 2.3 tuf基因：延伸因子基因，是植原体转录过程中的关键因子，为单拷贝，序列相对保守，常用于植原体的分类鉴定。 3 植原体基本信息 为软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲（Mollicutes），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属（Candidatus phytoplasma）。检疫性植原体的具体信息参见附录A。 4 方法原理 16S rRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及tuf基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。 5 仪器用具及试剂 5.1 仪器用具 PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机、台式小型离心机、冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。 5.2 试剂 植物DNA提取试剂盒、PCR Premix、超纯水、DNA marker。 核酸提取研磨液（100mL）：K2HPO4·3H2O 2.17g；K2HPO4 0.41g；蔗糖 10g；BSA (Fraction V) 0.15g；PVP-10 2g。pH 7.6，高温灭菌，4℃保存。 DNA提取液：Tris-HCl 100mmol/L，EDTA 100mmol/L；NaCl 250mmol/L；调pH至8.0。 50X TAE：2.0mmol/L Tris，1.0mmol/L NaAc，50mmol/L EDTA，pH 8.0。 6 筛查鉴定方法 6.1 16S rRNA基因序列扩增测序 利用通用引物进行16S rRNA基因序列扩增测序（具体步骤见附录B），将序列在GenBank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中进行blast比对。 6.2 虚拟RFLP指纹图谱分析 见附录B。 6.3 tuf基因序列扩增分析 见附录C。 7 结果判定 根据16S rRNA基因序列blast比对结果进行初步判定。如果相似度高于97.5%，初步判定为一个候选种或组。 根据iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件分析结果进行判定。相似度达到0.85时，判定为同一个组；0.85~0.97之间为不同亚组，然后根据名录中检疫性植原体对应的组或亚组进行判定。也可以利用tuf基因序列在欧盟检疫性有害生物鉴定数据库（QBOL）或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中比对判定，NJ树聚在同一支上为同一组或亚组。筛查鉴定结果需结合寄主、症状及病原形态等生物学信息进行最终判定。 8 样品保存与复核 8.1 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出植原体的样品应保存于-20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后需经高压灭菌后方可处理。 8.2 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、