SN/T 4877.3-2017
基本信息
标准号： SN/T 4877.3-2017
中文名称：基因条形码筛查方法第3部分:检疫性植原体
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4877.3-2017.DNA barcoding screening method-Part 3:Quarantine phytoplasma.
1范围
SN/T 4877.3规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
SN/T 4877.3适用于检疫性植原体的筛查鉴定。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1 DNA条形码
生物体内能够代表该物种的,标准的有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
2.216S rRNA基因
原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中,16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺,16SnRNA基因序列具有高度的保守性和特异性,在植原体的分类鉴定中广泛应用。
2.3tuf基因
延伸因子基因,是植原体转录过程中的关键因子为单拷页,序列相对保守,常用于植原体的分类鉴定。
3植原体基本信息
为软壁菌门(Tendericutes),柔膜菌纲(Mollicuteria),菌原体目(Mycoplasmatales),非醇原体科(Acholeplasmataceae) .植原体候选属(Candidatus phytoplasma)。检疫性植原体的具体信息参见附录A.
4方法原理
16S rRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及tuf基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。
1范围
SN/T 4877.3规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
SN/T 4877.3适用于检疫性植原体的筛查鉴定。
2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
2.1 DNA条形码
生物体内能够代表该物种的,标准的有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。
2.216S rRNA基因
原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中,16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺,16SnRNA基因序列具有高度的保守性和特异性,在植原体的分类鉴定中广泛应用。
2.3tuf基因
延伸因子基因,是植原体转录过程中的关键因子为单拷页,序列相对保守,常用于植原体的分类鉴定。
3植原体基本信息
为软壁菌门(Tendericutes),柔膜菌纲(Mollicuteria),菌原体目(Mycoplasmatales),非醇原体科(Acholeplasmataceae) .植原体候选属(Candidatus phytoplasma)。检疫性植原体的具体信息参见附录A.
4方法原理
16S rRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及tuf基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4877.3—2017
基因条形码筛查方法
第3部分：检疫性植原体
DNAbarcoding screeningmethodPart3:Quarantinephytoplasma
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体，
本部分为SN/T4877的第3部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.3—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国广西出人境检验检疫局、福建省农业科学院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、李为民、杜智新、谢丽雪、田茜、廖芳I
1范围
基因条形码筛查方法
第3部分：检疫性植原体
SN/T4877.3—2017
SN/T4877的本部分规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
本部分适用于检疫性植原体的筛查鉴定。2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1DNA条形码
生物体内能够代表该物种的，标准的，有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。2.216SrRNA基因
原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，16SRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，在植原体的分类鉴定中广泛应用。
2.3tuf基因
延伸因子基因，是植原体转录过程中的关键因子，为单拷贝，序列相对保守，常用于植原体的分类鉴定。
3植原体基本信息
为软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲(Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属（Candidatusphytoplasma）。检疫性植原体的具体信息参见附录A。
4方法原理
16SrRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及tuf基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。5仪器用具及试剂
5.1仪器用具
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、冰箱、SN/T4877.3—2017
旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。5.2试剂
植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker。核酸提取研磨液（100mL)：K,HPO，·3H,O,2.17g；KHzPO0.41g蔗糖，10g；BSA（FractionV）0.15g；PVP-10，2g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。DNA提取液：Tris-HCl,100mmol/L,EDTA，100mmol/L；NaCl250mmol/L；调pH至8.0。50XTAE.2.0mmol/LTris,l.0mmol/LNaAc,50mmol/LEDTA.pH8.0。6筛查鉴定方法
6.116SrRNA基因序列扩增测序
利用通用引物进行16SrRNA基因序列扩增测序（具体步骤见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中进行blast比对。6.2虚拟RFLP指纹图谱分析
见附录B。
6.3tuf基因序列扩增分析
见附录C。
7结果判定
根据16SrRNA基因序列blast比对结果进行初步判定。如果相似度高于97.5%，初步判定为一个候选种或组。
根据iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件分析结果进行判定。相似度达到O.85时，判定为同一个组，0.85～0.97之间为不同亚组，然后根据名录中检疫性植原体对应的组或亚组进行判定。也可以利用tu广基因序列在欧盟检疫性有害生物鉴定数据库（QBOL）或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中比对判定，NJ树聚在同一支上为同一组或亚组。筛查鉴定结果需结合寄主、症状及病原形态等生物学信息进行最终判定。8样品保存与复核
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后需经高压灭菌后方可处理。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，测定序列需要保存电子文件。2
植原体分类鉴定信息
附录A
（资料性附录）
检疫性植原体相关信息
SN/T4877.32017
目前植原体有两种分类鉴定系统，一种为基于16SrRNA基因序列相似度进行分种，相似度高于97.5%，并结合生物学信息，认为是同一个候选种（Candidatusphytoplasmasp.）。另一种为基于16SrRNA基因序列RFLP电子指纹图谱的相似性进行分组，相似性高于0.85为同一组，相似性在0.85～0.97之间为不同亚组，该套分类方法更具有实用性。候选种大部分与组或亚组相对应，A.2
检疫性植原体分类信息
检疫性植原体分类信息见表A.1。检疫性植原体分类信息
中文名称
档树黄化植原体
苹果丛生植原体
杏褪绿卷叶植原体
白蜡树黄化植原体www.bzxz.net
蓝莓矮化植原体
澳大利亚植原体候选种
椰子致死黄化植原体
榆韧皮部坏死植原体
葡萄金黄化植原体
来檬丛枝植原体
桃X病植原体
梨衰退植原体
马铃薯丛枝植原体
草莓簇生植原体
Alder yellows
通用名
Apple proliferation
Apricot chlorotic leafroll
Ashyellows
Blueberry stunt
CandidatusPhytoplasma australienseCoconut lethal yellowing
Elm phloem necrosis
Grapevine flavescence doree
Lime witches'broom
Peach X-disease
Pear decline
Potato witches'broom
Strawberry multiplier
I-E/X-E
候选种
Ca.Phytoplasma mali
Ca.Phytoplasma fraxini
Ca.Phytoplasma pruni
Ca.Phytoplasma aurantifolia
Ca.Phytoplasma pyri
SN/T4877.3—2017
B.1DNA制备
DNA制备方法如下：
附录B
（规范性附录）
16SrRNA基因扩增及虚拟RFLP指纹图谱分析a）取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，或于材料0.1g.取适量液氮研磨，再加入研磨液2mL充分研磨.4℃12000r/min离心20min.弃上清液。加入500μLDNA提取液，20
uL蛋白K（5mg/ml），轻轻混匀，加人80μL10%十二烷肌b)
氨酸钠，混匀，55℃温育1h～2
h.4℃6000r/min.10min.取上清液。c
加入2/3体积异丙醇，混勾，-20℃保持至少30min，4℃12000r/min离心15min，弃上清液。加人600μLTE缓冲液，30μLSDS，1260min。
蛋白酶K（5mg/mL），混勾，37℃温育30min~加100μL5mol/LNaCI混勾，再加人84μLTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10min。加人等体积氯仿：异戊醇（24：1）混勾，4℃12000r/min离心5min，重复直至无中间白色层。上清液加入2/3体积异丙醇，混勾，一20℃保持至少30min，4清液。
加人1mL70%乙醇洗涤，12000r/min1min，洗涤两次。h）
加人30μLTE缓冲液混勾溶解，一20℃冰冻保仅的核酸质量更优
注：也可采用商品试剂盒提取，但通常上述方法提耳B.2引物序列
采用巢式PCR进行植原体16SRNA
基因序列的扩
第一对通用引物：
P1:5'-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3P7:5'-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3
扩增片段长度1800bp左右。
第二对通用引物：
R16F2n.5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3R16R2:5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3扩增片段长度1250bp左右。
B.3PCR反应体系及参数
12000r/min10min，弃上
利用商品化PCRPremix进行扩增，最终引物浓度均为200nmol/L，用引物P1/P7进行第1轮PCR，模板量为10ng~100ng。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，53℃/30s.72℃/1min，35个循环；72℃/10min。第1轮PCR产物用灭菌双蒸水1：50（体积比）稀释，取1μL为模板利用通用引物R16F2n/R16R2进行第2轮PCR反应，反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，60℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。
注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度、纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。4
B.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的植株叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有植原体16SrDNA序列的质粒为模板。空白对照：以无菌水代替DNA模板。B.5电泳及测序
SN/T4877.3—2017
取5LPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，测序结果利用生物信息学软件进行剪接编辑校对，然后在Genbank数据库或检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统进行初步分析。B.6虚拟RFLP指纹图谱分析
利用iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件将测得的植原体16SrDNA序列(R16F2n/R16R2)进行虚拟酶切，选用17种限制性内切酶（A/uI、BamHI、BfaI、BstUI、DraI、EcoRI、HaeII、HhaI、HinfI、HpaI、HpaI、KpnI、MboI、MseI、RsaI、SspI、TaqI）。酶切后RFLP图谱如图B.1(以苹果丛生植原体RFLP图谱为例）。此外，使用iPhyclassifier的组（亚组）划分功能（16Srgroup/subgroupclassificationbasedonsimilaritycoefficient），对目标植原体进行组与亚组的分类。
16Srx-A'Ca.Phytoplasmamali
(AJ542541)
图B.1苹果丛生植原体RFLP指纹图谱5
SN/T4877.3—2017
引物序列
附录C
（规范性附录）
tuf基因的扩增与分析
采用巢式PCR进行植原体tu基因扩增第一次扩增引物：
正向引物：
Tuf340a:5'-GCTCCTGAAGAAARAGAACGTGG-3Tuf340b:5'-ACTAAAGAAGAAAAAGAACGTGG-3反向引物：
Tuf890ra：5-ACTTGDCCTCTTTCKACTCTACCAGT-3Tuf890rb:5'-ATTTGTCCTCTTTCWACACGTCCTGT-3Tuf890rc：5'-ACCATTCCTCTTTCAACACGTCCAGT-3扩增片段长度550bp左右。
第二次扩增引物：
正向引物：
Tuf400a:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGAAAAACGTCAYTATGCTCA-3Tuf400b:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACTTCTAAAAGACATTACGCTCA-3Tuf400c:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACATCAAAAAGACAYTATGCTCA-3Tuf400d:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGAAAAAAGACAYTATGCTCA-3Tuf400e:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGCTAAAAGACATTATYCTCA-3反向引物：
Tuf835ra：5-TAATACGACTCACTATAGGGAACATCTTCWACHGGCATTAAGAAAGG-3Tuf835rb:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAACACCTTCAATAGGCATTAAAAAWGG-3Tuf835rc：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAACATCTTCTATAGGTAATAAAAAAGG-3扩增片段长度430bp左右。
C.2PCR反应体系及参数
利用商品化PCRPremix进行PCR扩增，采用25μL反应体系。利用引物Tuf340/Tuf890r进行第1轮PCR，取1μLDNA（浓度为10nmol/L～100nmol/L）为模板。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，54℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/7min。第1轮PCR产物用灭菌双蒸水1：30（体积比）稀释，取1μL为模板利用通用引物Tuf400/Tuf835r进行第2轮PCR反应，PCR反应条件同上。上述两次PCR反应所用不同引物按等比例混合，配制引物浓度均为10μmol/L，取1μL用于PCR反应。
注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度、纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。C.3阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的植株叶片DNA为模板6
阳性对照：以携带有植原体tu于序列的质粒为模板空白对照：以无菌水代替DNA模板C.4电泳及测序
SN/T4877.3—2017
用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，凝胶成像仪观察并记录结果。扩增片段为420bp~440bp之间。采用M13和T7为测序引物进行测序，利用生物信息学软件对序列进行剪接编辑校对。C.5结果分析
在欧盟检疫性有害生物数据库（http：//q-bank.eu/Phytoplasmas/）或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统进行分析并做NJ树。
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基因条形码筛查方法
第3部分：检疫性植原体
DNAbarcoding screeningmethodPart3:Quarantinephytoplasma
2017-07-21发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2018-03-01实施
SN/T4877《基因条形码筛查方法》共分为3个部分：第1部分：检疫性棒形杆菌；
第2部分：检疫性黄单胞菌；
第3部分：检疫性植原体，
本部分为SN/T4877的第3部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4877.3—2017
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任，本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国农业科学院生物技术研究所、中华人民共和国广西出人境检验检疫局、福建省农业科学院、中华人民共和国天津出人境检验检疫局。本部分主要起草人：赵文军、李为民、杜智新、谢丽雪、田茜、廖芳I
1范围
基因条形码筛查方法
第3部分：检疫性植原体
SN/T4877.3—2017
SN/T4877的本部分规定了检疫性植原体DNA条形码筛查方法中DNA提取、基因扩增、序列的比对分析及结果判定等。
本部分适用于检疫性植原体的筛查鉴定。2术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。2.1DNA条形码
生物体内能够代表该物种的，标准的，有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。2.216SrRNA基因
原核生物核糖体30S小亚基的组成部分。在细菌的进化过程中，16SrRNA基因的进化相对保守，被认为是衡量生命进化历史最理想的标尺，16SRNA基因序列具有高度的保守性和特异性，在植原体的分类鉴定中广泛应用。
2.3tuf基因
延伸因子基因，是植原体转录过程中的关键因子，为单拷贝，序列相对保守，常用于植原体的分类鉴定。
3植原体基本信息
为软壁菌门（Tendericutes），柔膜菌纲(Mollicuteria），菌原体目（Mycoplasmatales），非醇原体科（Acholeplasmataceae），植原体候选属（Candidatusphytoplasma）。检疫性植原体的具体信息参见附录A。
4方法原理
16SrRNA基因序列、虚拟的RFLP图谱及tuf基因序列是本部分中检疫性植原体筛查鉴定的主要依据。依据DNA序列分析结果与生物学信息进行最终结果判定。5仪器用具及试剂
5.1仪器用具
PCR仪、超净工作台、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、冰箱、SN/T4877.3—2017
旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统。5.2试剂
植物DNA提取试剂盒、PCRPremix、超纯水、DNAmarker。核酸提取研磨液（100mL)：K,HPO，·3H,O,2.17g；KHzPO0.41g蔗糖，10g；BSA（FractionV）0.15g；PVP-10，2g。pH7.6高温灭菌，4℃保存。DNA提取液：Tris-HCl,100mmol/L,EDTA，100mmol/L；NaCl250mmol/L；调pH至8.0。50XTAE.2.0mmol/LTris,l.0mmol/LNaAc,50mmol/LEDTA.pH8.0。6筛查鉴定方法
6.116SrRNA基因序列扩增测序
利用通用引物进行16SrRNA基因序列扩增测序（具体步骤见附录B），将序列在Genbank数据库或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中进行blast比对。6.2虚拟RFLP指纹图谱分析
见附录B。
6.3tuf基因序列扩增分析
见附录C。
7结果判定
根据16SrRNA基因序列blast比对结果进行初步判定。如果相似度高于97.5%，初步判定为一个候选种或组。
根据iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件分析结果进行判定。相似度达到O.85时，判定为同一个组，0.85～0.97之间为不同亚组，然后根据名录中检疫性植原体对应的组或亚组进行判定。也可以利用tu广基因序列在欧盟检疫性有害生物鉴定数据库（QBOL）或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定数据库中比对判定，NJ树聚在同一支上为同一组或亚组。筛查鉴定结果需结合寄主、症状及病原形态等生物学信息进行最终判定。8样品保存与复核
8.1样品保存与处理
样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出植原体的样品应保存于一20℃冰箱中，以备复核。该类样品保存期满后需经高压灭菌后方可处理。8.2结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有实验人员和审核人员签字。PCR凝胶电泳检测需有电泳结果照片，测定序列需要保存电子文件。2
植原体分类鉴定信息
附录A
（资料性附录）
检疫性植原体相关信息
SN/T4877.32017
目前植原体有两种分类鉴定系统，一种为基于16SrRNA基因序列相似度进行分种，相似度高于97.5%，并结合生物学信息，认为是同一个候选种（Candidatusphytoplasmasp.）。另一种为基于16SrRNA基因序列RFLP电子指纹图谱的相似性进行分组，相似性高于0.85为同一组，相似性在0.85～0.97之间为不同亚组，该套分类方法更具有实用性。候选种大部分与组或亚组相对应，A.2
检疫性植原体分类信息
检疫性植原体分类信息见表A.1。检疫性植原体分类信息
中文名称
档树黄化植原体
苹果丛生植原体
杏褪绿卷叶植原体
白蜡树黄化植原体www.bzxz.net
蓝莓矮化植原体
澳大利亚植原体候选种
椰子致死黄化植原体
榆韧皮部坏死植原体
葡萄金黄化植原体
来檬丛枝植原体
桃X病植原体
梨衰退植原体
马铃薯丛枝植原体
草莓簇生植原体
Alder yellows
通用名
Apple proliferation
Apricot chlorotic leafroll
Ashyellows
Blueberry stunt
CandidatusPhytoplasma australienseCoconut lethal yellowing
Elm phloem necrosis
Grapevine flavescence doree
Lime witches'broom
Peach X-disease
Pear decline
Potato witches'broom
Strawberry multiplier
I-E/X-E
候选种
Ca.Phytoplasma mali
Ca.Phytoplasma fraxini
Ca.Phytoplasma pruni
Ca.Phytoplasma aurantifolia
Ca.Phytoplasma pyri
SN/T4877.3—2017
B.1DNA制备
DNA制备方法如下：
附录B
（规范性附录）
16SrRNA基因扩增及虚拟RFLP指纹图谱分析a）取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，或于材料0.1g.取适量液氮研磨，再加入研磨液2mL充分研磨.4℃12000r/min离心20min.弃上清液。加入500μLDNA提取液，20
uL蛋白K（5mg/ml），轻轻混匀，加人80μL10%十二烷肌b)
氨酸钠，混匀，55℃温育1h～2
h.4℃6000r/min.10min.取上清液。c
加入2/3体积异丙醇，混勾，-20℃保持至少30min，4℃12000r/min离心15min，弃上清液。加人600μLTE缓冲液，30μLSDS，1260min。
蛋白酶K（5mg/mL），混勾，37℃温育30min~加100μL5mol/LNaCI混勾，再加人84μLTAB/NaCl溶液混匀，65℃温育10min。加人等体积氯仿：异戊醇（24：1）混勾，4℃12000r/min离心5min，重复直至无中间白色层。上清液加入2/3体积异丙醇，混勾，一20℃保持至少30min，4清液。
加人1mL70%乙醇洗涤，12000r/min1min，洗涤两次。h）
加人30μLTE缓冲液混勾溶解，一20℃冰冻保仅的核酸质量更优
注：也可采用商品试剂盒提取，但通常上述方法提耳B.2引物序列
采用巢式PCR进行植原体16SRNA
基因序列的扩
第一对通用引物：
P1:5'-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3P7:5'-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3
扩增片段长度1800bp左右。
第二对通用引物：
R16F2n.5-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3R16R2:5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3扩增片段长度1250bp左右。
B.3PCR反应体系及参数
12000r/min10min，弃上
利用商品化PCRPremix进行扩增，最终引物浓度均为200nmol/L，用引物P1/P7进行第1轮PCR，模板量为10ng~100ng。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，53℃/30s.72℃/1min，35个循环；72℃/10min。第1轮PCR产物用灭菌双蒸水1：50（体积比）稀释，取1μL为模板利用通用引物R16F2n/R16R2进行第2轮PCR反应，反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，60℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/10min。
注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度、纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。4
B.4阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的植株叶片DNA为模板。阳性对照：以携带有植原体16SrDNA序列的质粒为模板。空白对照：以无菌水代替DNA模板。B.5电泳及测序
SN/T4877.3—2017
取5LPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，测序结果利用生物信息学软件进行剪接编辑校对，然后在Genbank数据库或检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统进行初步分析。B.6虚拟RFLP指纹图谱分析
利用iPhyclassifier在线分析软件或DNA-FPCluster软件将测得的植原体16SrDNA序列(R16F2n/R16R2)进行虚拟酶切，选用17种限制性内切酶（A/uI、BamHI、BfaI、BstUI、DraI、EcoRI、HaeII、HhaI、HinfI、HpaI、HpaI、KpnI、MboI、MseI、RsaI、SspI、TaqI）。酶切后RFLP图谱如图B.1(以苹果丛生植原体RFLP图谱为例）。此外，使用iPhyclassifier的组（亚组）划分功能（16Srgroup/subgroupclassificationbasedonsimilaritycoefficient），对目标植原体进行组与亚组的分类。
16Srx-A'Ca.Phytoplasmamali
(AJ542541)
图B.1苹果丛生植原体RFLP指纹图谱5
SN/T4877.3—2017
引物序列
附录C
（规范性附录）
tuf基因的扩增与分析
采用巢式PCR进行植原体tu基因扩增第一次扩增引物：
正向引物：
Tuf340a:5'-GCTCCTGAAGAAARAGAACGTGG-3Tuf340b:5'-ACTAAAGAAGAAAAAGAACGTGG-3反向引物：
Tuf890ra：5-ACTTGDCCTCTTTCKACTCTACCAGT-3Tuf890rb:5'-ATTTGTCCTCTTTCWACACGTCCTGT-3Tuf890rc：5'-ACCATTCCTCTTTCAACACGTCCAGT-3扩增片段长度550bp左右。
第二次扩增引物：
正向引物：
Tuf400a:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGAAAAACGTCAYTATGCTCA-3Tuf400b:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACTTCTAAAAGACATTACGCTCA-3Tuf400c:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACATCAAAAAGACAYTATGCTCA-3Tuf400d:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGAAAAAAGACAYTATGCTCA-3Tuf400e:5'-GTAAAACGACGGCCAGTGAAACAGCTAAAAGACATTATYCTCA-3反向引物：
Tuf835ra：5-TAATACGACTCACTATAGGGAACATCTTCWACHGGCATTAAGAAAGG-3Tuf835rb:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAACACCTTCAATAGGCATTAAAAAWGG-3Tuf835rc：5'-TAATACGACTCACTATAGGGAACATCTTCTATAGGTAATAAAAAAGG-3扩增片段长度430bp左右。
C.2PCR反应体系及参数
利用商品化PCRPremix进行PCR扩增，采用25μL反应体系。利用引物Tuf340/Tuf890r进行第1轮PCR，取1μLDNA（浓度为10nmol/L～100nmol/L）为模板。反应条件为：94℃/5min；94℃/30s，54℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃/7min。第1轮PCR产物用灭菌双蒸水1：30（体积比）稀释，取1μL为模板利用通用引物Tuf400/Tuf835r进行第2轮PCR反应，PCR反应条件同上。上述两次PCR反应所用不同引物按等比例混合，配制引物浓度均为10μmol/L，取1μL用于PCR反应。
注：DNA模板的取量根据DNA的提取浓度、纯度而调节。不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整。C.3阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：以健康的植株叶片DNA为模板6
阳性对照：以携带有植原体tu于序列的质粒为模板空白对照：以无菌水代替DNA模板C.4电泳及测序
SN/T4877.3—2017
用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析，凝胶成像仪观察并记录结果。扩增片段为420bp~440bp之间。采用M13和T7为测序引物进行测序，利用生物信息学软件对序列进行剪接编辑校对。C.5结果分析
在欧盟检疫性有害生物数据库（http：//q-bank.eu/Phytoplasmas/）或中国检疫性有害生物DNA条形码鉴定系统进行分析并做NJ树。
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