SN/T 3984—2014 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范 Quarantine protocol for canine parvovirus by real-time PCR 2014-11-19 发布 2015-05-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、西南民族大学。 本标准主要起草人：陈世界、杨苗、林华、胡娟、杨晓农、张焕容、杨发龙、薛昌华、于学辉、牟静、王斌、黄河、余华。 1 范围 本标准规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于易感动物犬细小病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 2123 出入境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范 3 仪器和试剂 3.1 主要仪器 3.1.1 荧光定量PCR仪 3.1.2 高速冷冻离心机 3.1.3 旋涡混匀器 3.1.4 恒温循环水浴槽 3.1.5 低温冰箱 3.1.6 可调单头微量移液器 3.2 主要试剂 试剂为分析纯或生化试剂，用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T 6682中的三级水要求。 3.2.1 动物粪便DNA提取试剂盒 3.2.2 动物血液与组织DNA提取试剂盒 3.2.3 荧光定量PCR反应预混液 3.2.4 犬细小病毒阳性质粒，DNA序列为：GGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGC 3.2.5 实时荧光PCR扩增所用的引物和探针的序列见表1。 表1 引物和TaqMan探针 | 引物和探针 | 序列 | 长度/bp | Tm值/℃ | GC/% | | :--- | :--- | :--- | :--- | :--- | | 上游引物 | 5'-GGCCTGGGAACAGTCTTGAC-3' | 20 | 55.9 | 60.0 | | 下游引物 | 5'-GCGAAGATAAGCAGCGTAAGC-3' | 21 | 54.4 | 52.4 | | TaqMan探针 | 5'-FAM-CCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTG-TAMRA-3' | 25 | 62.6 | 60.0 | 4 样品的采集和保存 4.1 粪便样品的采集和保存 从直肠内采集的样品以新鲜粪便为宜。少量采集时，先在每个灭菌离心管中加入1mL样品保存液（pH=7.4的磷酸缓冲液），用灭菌的棉拭子插入肛门，转动至少3圈，从直肠深处蘸取类便。之后立即将拭子浸入样品保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管，贴上标签，密封低温保存。采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用带上胶手套的手伸入直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装入灭菌的容器内，密封并贴上标签。样品采集后于4℃冷藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过24h，冬季不超过2d）。短时间不能送达的样品应于-20℃冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，并防止倾倒。送达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（以-70℃或以下为宜）保存，不应反复冻融。 4.2 病变肠组织样品的采集和保存 样品应采集增生、出血的病变小肠肠管约6cm长。已死亡的动物应尽快无菌采集（夏天不应超过2h，冬天不超过6h）。样品组织应置于样品袋中，贴上标签，4℃冷藏保存和运输。如病料不能立即进行检验，或须寄送到外地检验时，应加入适量的样品保存剂（饱和盐水或30%甘油缓冲液），容器加塞封固。 4.3 其他样品的采集和保存 参考采集附录A描述的典型病变样品，采样、运输及保存技术参照SN/T 2123。 5 实时荧光PCR检测方法 5.1 DNA提取 按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的DNA。 5.2 对照样品 5.2.1 阳性对照：犬细小病毒阳性质粒DNA模板。 5.2.2 阴性对照：用已知犬细小病毒阴性组织制备的DNA模板。 5.2.3 空白对照：用等体积的水代替DNA模板。 5.3 扩增反应体系 实时荧光PCR扩增反应体系见表2。