SN/T 3984-2014
基本信息
标准号： SN/T 3984-2014
中文名称：犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：2435984
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3984-2014.Quarantine protocol for canine parvovirus by real-time PCR.
1范围
SN/T 3984规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求。
SN/T 3984适用于易感动物犬细小病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2123出入境动物 检疫实验样品采集、运输和保存规范
3仪器和试剂
3.1 主要仪器
3.1.1荧光定量 PCR仪。
3.1.2 高速冷冻离心机。
3.1.3 旋涡混匀器。
3.1.4恒温循环水浴槽。
3.1.5低 温冰箱。
3.1.6可调单头微量移液器。
3.2主要试剂
试剂为分析纯或生化试剂,用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验用水均为灭菌超纯水,应符合GB/T 6682中的三级水要求。
3.2.1动物粪便DNA提取试剂盒。
3.2.2动物血液与组织DNA提取试剂盒。
3.2.3荧 光定量PCR反应预混液。
1范围
SN/T 3984规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求。
SN/T 3984适用于易感动物犬细小病毒的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
SN/T 2123出入境动物 检疫实验样品采集、运输和保存规范
3仪器和试剂
3.1 主要仪器
3.1.1荧光定量 PCR仪。
3.1.2 高速冷冻离心机。
3.1.3 旋涡混匀器。
3.1.4恒温循环水浴槽。
3.1.5低 温冰箱。
3.1.6可调单头微量移液器。
3.2主要试剂
试剂为分析纯或生化试剂,用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验用水均为灭菌超纯水,应符合GB/T 6682中的三级水要求。
3.2.1动物粪便DNA提取试剂盒。
3.2.2动物血液与组织DNA提取试剂盒。
3.2.3荧 光定量PCR反应预混液。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3984—2014
犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范Quarantine protocol for canine parvovirus by real-time PCR2014-11-19发布
全会商行
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、西南民族大学。SN/T3984—2014
本标准主要起草人：陈世界、杨苗、林华、胡娟、杨晓农、张焕容、杨发龙、薛昌华、于学辉、牟静、王斌、黄河、余华。
1范围
犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范本标准规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于易感动物犬细小病毒的检测。2规范性引用文件
SN/T3984—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范仪器和试剂
主要仪器
荧光定量PCR仪。
高速冷冻离心机。
旋涡混勾器。
恒温循环水浴槽。
低温冰箱。
可调单头微量移液器。
主要试剂
试剂为分析纯或生化试剂，用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T6682中的三级水要求。3.2.1
动物粪便DNA提取试剂盒。
动物血液与组织DNA提取试剂盒。荧光定量PCR反应预混液。
3.2.4犬细小病毒阳性质粒，DNA序列为GGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGC。3.2.5
实时荧光PCR扩增所用的引物和探针的序列见表1。表1引物和TaqMan探针
引物和探针
上游引物
下游引物
Taqman探针
5'-GGCCTGGGAACAGTCTTGAC-3”
5'-GCGAAGATAAGCAGCGTAAGC-3
5'-FAM-CCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTG-TAMRA-3'长度/bp
Tm值/℃
SN/T3984—2014
4样品的采集和保存
4.1粪便样品的采集和保存
从直肠内采集的样品以新鲜粪便为宜。少量采集时，先在每个灭菌离心管中加入1mL样品保存液（pH=7.4的磷酸缓冲液），用灭菌的棉拭子插人肛门，转动至少3圈，从直肠深处蘸取类便。之后立即将拭子浸人样品保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管，贴上标签，密封低温保存。采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用带上胶手套的手伸人直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装入灭菌的容器内，密封并贴上标签。样品采集后于4℃冷藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过24h，冬季不超过2d）。短时间不能送达的样品应于一20℃冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，并防止倾倒。送达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（以一70℃或以下为宜）保存，不应反复冻融。4.2病变肠组织样品的采集和保存样品应采集增生、出血的病变小肠肠管约6cm长。已死亡的动物应尽快无菌采集（夏天不应超过2h，冬天不超过6h）。样品组织应置于样品袋中，贴上标签，4℃冷藏保存和运输。如病料不能立即进行检验，或须寄送到外地检验时，应加人适量的样品保存剂（饱和盐水或30%甘油缓冲液），容器加塞封固。
4.3其他样品的采集和保存
参考采集附录A描述的典型病变样品，采样、运输及保存技术参照SN/T2123。实时荧光PCR检测方法
5.1DNA提取
按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的DNA。5.2对照样品
阳性对照
犬细小病毒阳性质粒DNA模板。
阴性对照
用已知犬细小病毒阴性组织制备的DNA模板。5.2.3
空白对照
用等体积的水代替DNA模板
5.3扩增反应体系
实时荧光PCR扩增反应体系见表2。2
试剂名称
2X荧光定量PCR反应预混液
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
10μmol/LTaqman探针
待测样品DNA模板
灭菌超纯水wwW.bzxz.Net
反应总体积
反应程序
实时荧光PCR反应程序见表3。
实时荧光PCR反应体系
终浓度
0.48μmol/L
0.32μmol/L
0.8μmol/L
实时荧光PCR反应程序
反应步骤
第一步
第二步（40个循环）
结果判定
结果分析条件设定
时间/s
SN/T3984—2014
每管加入量/μL
温度/℃
60（收集荧光信号）
直接读取检测结果。阅值设定的原则是根据检测时的噪音情况进行调整。通常以3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值线原则上以大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值为准。不同仪器应根据厂商提供的设定程序进行调整6.2
质控标准
阳性对照
Ct值应≤35.0，并出现特定的扩增曲线。6.2.2
阴性对照
无Ct值并且无扩增曲线。
空白对照
无Ct值并且无扩增曲线。
有效原则
如阳性对照、阴性对照和空白对照不满足以上条件，此次试验视为无效。3
SN/T3984—2014
结果描述及判定
6.3.1阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无犬细小病毒病原。6.3.2阳性
Ct值<35.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在犬细小病毒病原。6.3.3可疑
重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。Ct值>35.0的样本建议重做。
A.1疾病概述
附录A
（资料性附录）
犬细小病毒感染相关资料
A.1.1犬细小病毒感染（Canineparvovirusinfection）SN/T3984—2014
犬细小病毒感染是由犬细小病毒引起的犬的一种急性传染病，特征为出血性肠炎或非化脓性心肌炎，多发生于幼犬，病死率10%～50%。本病于1978年同时在澳大利亚和加拿大证实以来，美国、英国、德国、法国、意大利、俄罗斯和日本等国相继发现我国于1982年证实此病以后，在东北、华东和西南等地区陆续发生和蔓延
A.1.2病原
犬细小病毒（Canineparvovirus;CP)是细小病毒科、细小病毒属成员。具有细小病毒属病毒典型形态和结构。病毒粒子细小，直径20nm~22nm，呈20面体对称，无囊膜，在氯化艳中的浮密度1.43g/cm。基因组为单股DNA，大小5233bp。病毒粒子有VPI、VP2、VP3三种多肽，其中VP2为衣壳蛋白的主要成分，有血凝活性，病毒在4℃和25C都能凝集猪和恒河猴的红细胞。本病毒能在多种不同类型的细胞内增殖，如猫胎肾原代细胞、犬胎肾、脾、胸腺和肠管原代细胞、小貂肺细胞系（CCL-64）、浣熊唾液腺细胞及牛胎脾细胞等。本病毒对外界环境具有较强的抵抗力。在室温下能存活3个月；在60℃能活1h；PH3处理1h并不影响其活力；对甲醛、β丙内酯、羟胺和紫外线敏感，能使之灭活；但对三氯甲烷、乙醚等有机溶剂则不敏感
A.1.3流行病学
犬是本病主要的自然宿主。其他犬科动物，如丛林犬、郊狼和食蟹狐等也可感染。各种年龄和不同性别的犬都有易感性，但小犬的易感性更高。断乳前后的仔犬易感性最高，其发病率和死亡率都高于其他年龄组，往往以同窝爆发为特征。小于4周龄的仔犬和大于5岁龄的老犬发病率低，一般分别为2%和16%。
本病主要由直接或间接接触而传染。感染犬和康复带毒犬是传染源。病犬从粪便、尿液、睡液和呕吐物中排毒；而康复犬可能从粪尿中长期排毒，污染饲料、饮水、垫草、食具和周围环境。一般认为传染途径主要是消化道。
本病的发生无明显季节性。一般夏、秋季多发。天气寒冷，气温骤变，拥挤，卫生水平差和并发感染等，可加重病情和提高病死率。A.1.4症状
本病在临床诊断上分两个型，即肠炎型和心肌炎型，也有报道在一个犬身上兼有两型症状的，肠炎型潜伏期为1周～2周，多见于青年犬。往往先发生呕吐，后出现腹泻。粪便先黄色或灰黄色，覆以多量粘液和伪膜，接着排带有血液呈番茄汁样稀粪，具有难闻的恶臭味。病犬精神沉郁，食欲废绝，体温升至40℃以上，迅速脱水，急性衰竭而死。病程短的4d～5d，长的1周以上。也有些病犬只表现间歇性腹泻或仅排软便。成年犬发病一般不发热。心肌炎型多见于8周龄以下的幼犬，常突然发病，数小时内死亡。感染犬精神、食欲正常，偶见呕5
SN/T3984—2014
吐，或有轻度腹泻和体温升高。或有严重呼吸困难，持续20min～30min，脉快而弱，可视粘膜苍白。听诊心律不齐。心电图R波降低，S-T波升高。病死率60%～100%，只有极少数轻症病例可以治愈。A.1.5发病机理和病理变化
肠炎型剖检见病死犬脱水，可视黏膜苍白、腹腔积液。病变主要见于空肠、回肠即小肠中后段。浆膜暗红色，浆膜下充血出血，黏膜坏死、脱落、绒毛菱缩。肠腔扩张，内容物水样，混有血液和黏液。肠系膜淋巴结充血、出血、肿胀。组织学变化为后段空肠、回肠黏膜上皮变性、坏死、脱落，有些变性或完整的上皮细胞内含有核内包涵体。绒毛萎缩、隐窝肿大、充满炎性渗出物。肠腺消失，残存腺体扩张，内含坏死的细胞碎片。
心肌炎型剖检病变主要限于肺和心脏。肺水肿，局灶性充血、出血，致使肺表面色彩斑驳。心脏扩张，心房和心室内有淤血块。心肌和心内膜有非化脓性坏死灶。肌纤维变性、坏死，受损的心肌细胞中常有核内包涵体。
A.2诊断
根据特征性临诊症状（先呕吐后急性出血性肠炎、白细胞显著减少以及幼犬急性心肌炎等），再结合流行病学和病理变化的特点，可以作出初步诊断。确诊可采取小肠后段和心肌病料作组织切片，检查肠上皮和心肌细胞是否存在核内包涵体。也有应用荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验以及免疫扩散试验等法诊断本病。在诊断中注意与犬瘟热、犬传染性肝炎和出血性胃肠炎等疾病进行区别诊断。6
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犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范Quarantine protocol for canine parvovirus by real-time PCR2014-11-19发布
全会商行
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、西南民族大学。SN/T3984—2014
本标准主要起草人：陈世界、杨苗、林华、胡娟、杨晓农、张焕容、杨发龙、薛昌华、于学辉、牟静、王斌、黄河、余华。
1范围
犬细小病毒实时荧光PCR检疫技术规范本标准规定了犬细小病毒实时荧光PCR检测方法的技术要求。本标准适用于易感动物犬细小病毒的检测。2规范性引用文件
SN/T3984—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法SN/T2123出人境动物检疫实验样品采集、运输和保存规范仪器和试剂
主要仪器
荧光定量PCR仪。
高速冷冻离心机。
旋涡混勾器。
恒温循环水浴槽。
低温冰箱。
可调单头微量移液器。
主要试剂
试剂为分析纯或生化试剂，用于实时荧光PCR的试剂均用无DNA酶污染的容器分装。所有试验用水均为灭菌超纯水，应符合GB/T6682中的三级水要求。3.2.1
动物粪便DNA提取试剂盒。
动物血液与组织DNA提取试剂盒。荧光定量PCR反应预混液。
3.2.4犬细小病毒阳性质粒，DNA序列为GGCCTGGGAACAGTCTTGACCAAGGAGAACCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTGCAAAAGAACACGACGAAGCTTACGCTGCTTATCTTCGC。3.2.5
实时荧光PCR扩增所用的引物和探针的序列见表1。表1引物和TaqMan探针
引物和探针
上游引物
下游引物
Taqman探针
5'-GGCCTGGGAACAGTCTTGAC-3”
5'-GCGAAGATAAGCAGCGTAAGC-3
5'-FAM-CCAACTAACCCTTCTGACGCCGCTG-TAMRA-3'长度/bp
Tm值/℃
SN/T3984—2014
4样品的采集和保存
4.1粪便样品的采集和保存
从直肠内采集的样品以新鲜粪便为宜。少量采集时，先在每个灭菌离心管中加入1mL样品保存液（pH=7.4的磷酸缓冲液），用灭菌的棉拭子插人肛门，转动至少3圈，从直肠深处蘸取类便。之后立即将拭子浸人样品保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管，贴上标签，密封低温保存。采集较多量的粪便时，可将动物肛门周围消毒后，用带上胶手套的手伸人直肠内取粪便，也可用压舌板插入直肠，轻轻用力下压，刺激排粪，收集粪便。所收集的粪便装入灭菌的容器内，密封并贴上标签。样品采集后于4℃冷藏保存，然后立即运送实验室（夏季不超过24h，冬季不超过2d）。短时间不能送达的样品应于一20℃冷冻保存。样品运送时应保持冷冻状态，并防止倾倒。送达实验室后，若暂时不进行处理，则应冷冻（以一70℃或以下为宜）保存，不应反复冻融。4.2病变肠组织样品的采集和保存样品应采集增生、出血的病变小肠肠管约6cm长。已死亡的动物应尽快无菌采集（夏天不应超过2h，冬天不超过6h）。样品组织应置于样品袋中，贴上标签，4℃冷藏保存和运输。如病料不能立即进行检验，或须寄送到外地检验时，应加人适量的样品保存剂（饱和盐水或30%甘油缓冲液），容器加塞封固。
4.3其他样品的采集和保存
参考采集附录A描述的典型病变样品，采样、运输及保存技术参照SN/T2123。实时荧光PCR检测方法
5.1DNA提取
按照商品化试剂盒说明书要求提取相应样品的DNA。5.2对照样品
阳性对照
犬细小病毒阳性质粒DNA模板。
阴性对照
用已知犬细小病毒阴性组织制备的DNA模板。5.2.3
空白对照
用等体积的水代替DNA模板
5.3扩增反应体系
实时荧光PCR扩增反应体系见表2。2
试剂名称
2X荧光定量PCR反应预混液
10μmol/L上游引物
10μmol/L下游引物
10μmol/LTaqman探针
待测样品DNA模板
灭菌超纯水wwW.bzxz.Net
反应总体积
反应程序
实时荧光PCR反应程序见表3。
实时荧光PCR反应体系
终浓度
0.48μmol/L
0.32μmol/L
0.8μmol/L
实时荧光PCR反应程序
反应步骤
第一步
第二步（40个循环）
结果判定
结果分析条件设定
时间/s
SN/T3984—2014
每管加入量/μL
温度/℃
60（收集荧光信号）
直接读取检测结果。阅值设定的原则是根据检测时的噪音情况进行调整。通常以3～15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，阈值线原则上以大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值为准。不同仪器应根据厂商提供的设定程序进行调整6.2
质控标准
阳性对照
Ct值应≤35.0，并出现特定的扩增曲线。6.2.2
阴性对照
无Ct值并且无扩增曲线。
空白对照
无Ct值并且无扩增曲线。
有效原则
如阳性对照、阴性对照和空白对照不满足以上条件，此次试验视为无效。3
SN/T3984—2014
结果描述及判定
6.3.1阴性
无Ct值并且无扩增曲线，表明样品中无犬细小病毒病原。6.3.2阳性
Ct值<35.0，且出现特定的扩增曲线，表示样本中存在犬细小病毒病原。6.3.3可疑
重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。Ct值>35.0的样本建议重做。
A.1疾病概述
附录A
（资料性附录）
犬细小病毒感染相关资料
A.1.1犬细小病毒感染（Canineparvovirusinfection）SN/T3984—2014
犬细小病毒感染是由犬细小病毒引起的犬的一种急性传染病，特征为出血性肠炎或非化脓性心肌炎，多发生于幼犬，病死率10%～50%。本病于1978年同时在澳大利亚和加拿大证实以来，美国、英国、德国、法国、意大利、俄罗斯和日本等国相继发现我国于1982年证实此病以后，在东北、华东和西南等地区陆续发生和蔓延
A.1.2病原
犬细小病毒（Canineparvovirus;CP)是细小病毒科、细小病毒属成员。具有细小病毒属病毒典型形态和结构。病毒粒子细小，直径20nm~22nm，呈20面体对称，无囊膜，在氯化艳中的浮密度1.43g/cm。基因组为单股DNA，大小5233bp。病毒粒子有VPI、VP2、VP3三种多肽，其中VP2为衣壳蛋白的主要成分，有血凝活性，病毒在4℃和25C都能凝集猪和恒河猴的红细胞。本病毒能在多种不同类型的细胞内增殖，如猫胎肾原代细胞、犬胎肾、脾、胸腺和肠管原代细胞、小貂肺细胞系（CCL-64）、浣熊唾液腺细胞及牛胎脾细胞等。本病毒对外界环境具有较强的抵抗力。在室温下能存活3个月；在60℃能活1h；PH3处理1h并不影响其活力；对甲醛、β丙内酯、羟胺和紫外线敏感，能使之灭活；但对三氯甲烷、乙醚等有机溶剂则不敏感
A.1.3流行病学
犬是本病主要的自然宿主。其他犬科动物，如丛林犬、郊狼和食蟹狐等也可感染。各种年龄和不同性别的犬都有易感性，但小犬的易感性更高。断乳前后的仔犬易感性最高，其发病率和死亡率都高于其他年龄组，往往以同窝爆发为特征。小于4周龄的仔犬和大于5岁龄的老犬发病率低，一般分别为2%和16%。
本病主要由直接或间接接触而传染。感染犬和康复带毒犬是传染源。病犬从粪便、尿液、睡液和呕吐物中排毒；而康复犬可能从粪尿中长期排毒，污染饲料、饮水、垫草、食具和周围环境。一般认为传染途径主要是消化道。
本病的发生无明显季节性。一般夏、秋季多发。天气寒冷，气温骤变，拥挤，卫生水平差和并发感染等，可加重病情和提高病死率。A.1.4症状
本病在临床诊断上分两个型，即肠炎型和心肌炎型，也有报道在一个犬身上兼有两型症状的，肠炎型潜伏期为1周～2周，多见于青年犬。往往先发生呕吐，后出现腹泻。粪便先黄色或灰黄色，覆以多量粘液和伪膜，接着排带有血液呈番茄汁样稀粪，具有难闻的恶臭味。病犬精神沉郁，食欲废绝，体温升至40℃以上，迅速脱水，急性衰竭而死。病程短的4d～5d，长的1周以上。也有些病犬只表现间歇性腹泻或仅排软便。成年犬发病一般不发热。心肌炎型多见于8周龄以下的幼犬，常突然发病，数小时内死亡。感染犬精神、食欲正常，偶见呕5
SN/T3984—2014
吐，或有轻度腹泻和体温升高。或有严重呼吸困难，持续20min～30min，脉快而弱，可视粘膜苍白。听诊心律不齐。心电图R波降低，S-T波升高。病死率60%～100%，只有极少数轻症病例可以治愈。A.1.5发病机理和病理变化
肠炎型剖检见病死犬脱水，可视黏膜苍白、腹腔积液。病变主要见于空肠、回肠即小肠中后段。浆膜暗红色，浆膜下充血出血，黏膜坏死、脱落、绒毛菱缩。肠腔扩张，内容物水样，混有血液和黏液。肠系膜淋巴结充血、出血、肿胀。组织学变化为后段空肠、回肠黏膜上皮变性、坏死、脱落，有些变性或完整的上皮细胞内含有核内包涵体。绒毛萎缩、隐窝肿大、充满炎性渗出物。肠腺消失，残存腺体扩张，内含坏死的细胞碎片。
心肌炎型剖检病变主要限于肺和心脏。肺水肿，局灶性充血、出血，致使肺表面色彩斑驳。心脏扩张，心房和心室内有淤血块。心肌和心内膜有非化脓性坏死灶。肌纤维变性、坏死，受损的心肌细胞中常有核内包涵体。
A.2诊断
根据特征性临诊症状（先呕吐后急性出血性肠炎、白细胞显著减少以及幼犬急性心肌炎等），再结合流行病学和病理变化的特点，可以作出初步诊断。确诊可采取小肠后段和心肌病料作组织切片，检查肠上皮和心肌细胞是否存在核内包涵体。也有应用荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验以及免疫扩散试验等法诊断本病。在诊断中注意与犬瘟热、犬传染性肝炎和出血性胃肠炎等疾病进行区别诊断。6
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