SN/T 4074-2014.Detection and indentification of Gaeumannomyces graminis var.avenae.
1范围
SN/T 4074规定了燕麦全蚀病菌(Gaeumannomyces graminis var.avenae )的检疫鉴定方法。
SN/T 4074适用于禾本科植物、草本植物的种苗、种子及混杂的植物残体中的燕麦全蚀病菌的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T1809进出境植物种子检疫规程
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
SN/T2589植物病原真菌检测规范
3燕麦全蚀病菌基本信息
学名:Gaemannomydes gram inis var awenae ( E.M.Turner)Dennis
分类地位:子囊菌亚门(Ascomyotina).核菌纲( Pyrenomycetes)、球壳菌目( Sphaeriales)、间座壳科(Diaporthaceae)、顶囊壳属(Gaeumannom yces)禾顶囊壳菌(Gaeumannomyces gramims)。
传播途径:病菌以菌丝体在病株组织或病残体在土壤中越冬(越夏)。禾草的整个生育期及其各个部位均可受到侵染。
燕麦全蚀病菌的其他信息见咐录A。
4方法原理
根据植株的植株病状进行现场检验，并采用形态学特征、分子生物学和致病性测定对植物种苗、植物种子及混杂的植物残体中的燕麦全蚀病菌进行判定。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4074—2014
燕麦全蚀病菌检疫鉴定方法
Detection and indentification of Gaeumannomyces graminis var.avenae2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4074—2014
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国黄埔出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局本标准主要起草人：莫瑾、龚强、田茜、王昕、白雪、姜金林、周慧平、彭梓、谭建锡、钟国强、章桂明、张祥林、朱金国。
1范围
燕麦全蚀病菌检疫鉴定方法
SN/T4074—2014
本标准规定了燕麦全蚀病菌（Gaeumannomycesgraminisvar.avenae）的检疫鉴定方法本标准适用于禾本科植物、草本植物的种苗、种子及混杂的植物残体中的燕麦全蚀病菌的检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1809进出境植物种子检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样SN/T2589
植物病原真菌检测规范
3燕麦全蚀病菌基本信息
学名：Gaemannomydesgraminisvar分类地位：子囊菌亚门（Ascomycotina
科（Diaporthaceae）、顶囊壳属（Gaeumannomwenae(E.M.Turner)Dennis
核菌纲（Pyrenomycetes）
、球壳菌目（Sphaeriales）、间座壳yces）禾顶囊壳菌（Gaeumannomycesgramims）。传播途径：病菌以菌丝体在病株组织或病残体在土壤中越冬（越夏）。禾草的整个生育期及其各个
部位均可受到侵染，
燕麦全蚀病菌的其他信息见附录A4方法原理
根据植株的植株病状进行现场检验，并采用形态学特征、分子生物学和致病性测定对植物种苗、植物种子及混杂的植物残体中的燕麦全蚀病菌进行判定。5
仪器和耗材
仪器设备
PCR仪、超净工作台、体视显微镜、灭菌锅、制冰机、核酸蛋白分析仪、高速冷冻离心机，台式小型离心机、超低温冰箱、人工气候培养箱、常规冰箱、旋涡震荡器、微量进样器、电泳仪、凝胶成像系统、酶标仪。
5.2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR缓冲液、dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP）、TaqDNA聚合酶，PDA培养基、PDB培养基、0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液见附录B。1
SN/T4074—2014
6抽样
按照SN/T1809及SN/T2122规定进行取样。7病菌的鉴定
7.1种苗检验
症状检查
观察植株是否带有典型或疑似全蚀病的症状，症状见第A.2章。7.1.2形态学特征
切取生长有典型或疑似症状植株的染病部位，进行菌丝体和子囊壳的观察，对子囊壳进行徒手切片镜检。
菌丝体形态有两种，少数为纤细而灰色，大多数是厚壁、粗壮的黑褐色菌丝，菌丝体常形成黑色的菌丝束、菌丝团，多呈锐角分支、在主支和侧支交界处各产生一横隔形成“人八”形的菌丝体（见第C.2章）。瓶梗和瓶梗孢子：较多的是单个的瓶梗侧生在菌丝上，也有松散地集生在菌丝的分支处或菌丝末端呈穗状。瓶梗基部窄缩，中下部较宽、向上渐窄，端部为领带状。瓶梗孢子为（3μm～7μm）×（1um～2μm），弯曲呈新月形或半月形。子囊壳埋生于叶鞘内，烧瓶状，有弯曲的柱状喙部伸出于寄主组织之外，子囊壳表面有栗褐色毛绒状物，子囊壳黑色，直径330μm～550μm。子囊2～8个，子囊平行排列于子囊腔内，棒状，无色，直形或弯曲，有多数线状侧丝，子囊大小为（110μm150μm）×（12μm~16μm）（见附录C.3）。接触液态水时，子囊壁溶化，子囊孢子射出。子囊孢子成束或分散排列，丝状，无色，略弯，多胞有3～7个假隔膜，（110μm～130μm）×（2.5um～3.5um）。有时子囊孢子萌发时，产生小形单胞、镰形或新月形分生孢子。
7.1.3病原菌的分离培养
取待检样品的根、茎基部或叶鞘等部位（如有明显染病症状的部位应取染病部位)切成1cm长的小段，用蒸馏水冲洗掉表面的泥土杂物后，用0.1%次氯酸钠或70%乙醇消毒1min～2min，无菌水冲洗3次后，滤纸吸干水分，用灭菌解剖刀横切成1mm～5mm的小片，放置在PDA培养基上，每皿5~10片，25℃±1℃培养3d～10d，全蚀病菌在PDA培养基上生长菌落特征为：培养3d～5d菌落生长出白色絮状菌丝团，然后菌落逐渐产生暗黑色菌丝束，迎光观察菌丝束组成的菌落似绒毛毯状（见第C.1章）。将典型或疑似菌落纯化后进行进一步鉴定。7.1.4分子生物学鉴定
直接取有明显症状的植物组织进行总DNA提取，也可取培养基上生长的菌丝体进行DNA提取。提取方法见附录D。若使用提取试剂盒则按照试剂盒说明进行提取。两种方法收集菌体：一种是当纯化后菌丝长满培养基表面时，直接从平板上刮取菌丝；另一种是从平板上挑菌饼到液体PDB培养基中，28℃、180r/min振荡培养5d～7d，过滤收集菌丝，经冷冻抽干收集干燥的菌丝，一20℃保存备用。提取得到的DNA按照附录D进行分子生物学鉴定。2
7.1.5致病性测定
SN/T4074—2014
营养钵中装人灭菌沙土，并接人培养7d、直径1cm的待测菌饼。将催芽2d，出芽一致的燕麦种子播于菌饼上，并覆盖2cm的灭菌土。每天光照18h(18h，18℃和6h，12℃）培养。培育4周后，进行症状检查。观察根部或叶鞘部呈现第A.2章中描述的症状的，挑取典型部位进行菌丝和子囊壳的观察，符合燕麦全蚀病菌特征的判断为燕麦全蚀病菌。7.2种子检验
7.2.1病残体
仔细观察所抽取样本中是否携带有带病残体，将病残体切成1cm长的小段，按照7.1.3中方法进行病原菌的分离培养和菌体的观察，纯化后的菌株按7.1.4或7.1.5进行进一步鉴定。7.2.2种子bzxz.net
若未发现植物病、残体，可将种子样品充分混勾，制成平均样品，从每份平均样品中取10g作为检验样品加人90mL灭菌的0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液（pH7.0）中，室温静置10min，充分振荡，悬液去渣后8000r/min离心10min，小心地弃去上清液，再加入0.001%吐温20-磷酸盐缓冲液（pH7.0）重悬沉淀，如此反复洗涤三次。加入10mL0.85%的生理盐水重悬沉淀，得到样本提取液。可取1.0mL样本提取液，8000r/min离心10min，弃去上清液后取沉淀进行分子生物学鉴定，鉴定步骤见附录D。鉴定结果为阳性的取样品提取液，按10倍稀释法进行稀释，取三个适当浓度的稀释液各1.0mL涂布于PDA培养基上，25℃土1℃条件下培养3d～10d观察菌落生长情况，出现7.1.3中菌落形态的菌则进行进一步鉴定
8结果判定
若从燕麦植株上直接观察到典型的燕麦全蚀病特征，分离得到的菌株符合7.1.3燕麦全蚀病菌特征的，可判定为燕麦全蚀病菌。若从其他样本上分离得到的菌株形态符合7.1.3燕麦全蚀病菌特征的，可初步判定为检出燕麦全蚀病菌，需利用7.1或7.2方法进一步检测若致病性测定或者分子生物学测定结果符合燕麦全蚀病菌特征的，可判定为燕麦全蚀病菌。9样品和菌种的保存
样品和菌种的保存按照SN/T2589执行10
处理及生物安全措施
对检出燕麦全蚀病菌的样品及其分离菌株、检测过程中的废弃物，需经有效的除害处理方式处理以防止对环境的扩散。
SN/T4074—2014
A.1名称
附录A
（规范性附录）
燕麦全蚀病菌症状特征及相关信息中文名：禾顶囊壳燕麦变种、全蚀病菌燕麦变种英文名：Take-allpatch
A,2症状特征
染病植株根部、茎基部、地下茎等地下器官变为黑色，根系很短小，病株很易由土壤中拔出，后来茎基部和叶鞘内侧以及茎表面出现灰黑色菌丝体，后呈栗褐色，膏药状。土壤湿度较大时，病叶鞘内侧出现黑褐色小粒，即病菌的子囊壳。干旱时，子囊壳很少产生，病株地上部分发黄，矮小细弱，穗部白色，籽粒不实。草地发生此病后出现大小不一的枯草区m以上，呈浅黄色、红褐色或赤铜色，稍凹陷。病区初起近似圆形，不断向外扩伸，最终变为浅褐色、灰色。后来死草区内部因有抗病的禾草种类侵人，成为中央绿色、四周变色的“蛙眼”状。3寄主范围
rostis)
冰草属（Agropyron）、剪股颖属（Agr燕麦草属（Arrhenatherum）、燕麦属（Avena）、雀麦属（Bromus）、发草属（Deschampsid）、披碱草属（Elymus
属（Lolium）、蘭草属（Phalaris）、梯牧草属（Phleum）cum）、狗尾草属（Setaria）的多种作物和牧草A.4分布
茅属（Festuca）、大麦属（Hordeum）、黑麦草早熟禾属（Poa）黑麦属（Secale）、小麦属（Triti-世界各国分布广泛，我国尚未有该病害发生的报道。A.5传播途径和发病条件
全蚀病侵染的最适土温为12℃18℃，但6℃~8℃的低温也能侵染，土温5℃~15℃发病最重。一旦浸染成功，温度的影响就不明显了。而多雨、灌溉、积水等使土壤表层有充足水分的环境都有利于病菌的侵染发病。在凉爽而潮湿的天气，病菌侵入地下组织，并通过根部或匍匐茎生长及植物间的接触扩展蔓延。随着气温变暖，空气变得干燥，开始显症。子囊壳在秋季产生，暖和的冬季也可能产生。马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）B.1
马铃薯
葡萄糖
琼脂粉
蒸馏水
1000ml
附录B
（规范性附录）
培养基及试剂
SN/T4074—2014
将上述成分煮沸充分溶解后，调节pH值至6.8，21℃高压灭菌20min，使用前添加已过滤除菌的链霉素溶液和L-半胱氨酸溶液，使其终浓度分别为300μg/mL和0.1%。B.2
马铃薯葡萄糖培养基（PDB）
马铃薯
葡萄糖
酵母膏
蒸馏水
1000ml
将上述成分煮沸充分溶解后，12130.001%吐温20-磷酸盐缓冲液
Na2HPO,12H20
吐温-20
C高压灭菌20min，4℃保存备用。1000.0ml
将上述成分煮沸充分溶解后，调节pH值至7.0，121℃高压灭菌20min。5
SN/T4074—2014
菌落形态图
见图c.1。
菌丝体形状图
见图C.2。
附录C
（规范性附录）
燕麦全蚀病菌形态图
PDA培养基上燕麦全蚀病菌生长情况图C.2菌丝体形态
成株症状及子囊
见图C.3。
一成株症状；
子囊壳；
子囊；
子囊孢子。
注：此图引自SamanthaL.Thomas（2004）。3成株症状及子囊
SN/T4074—2014
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