SN/T 4179-2015
基本信息
标准号： SN/T 4179-2015
中文名称：水仙退化病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：8995917
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4179-2015.Detection and identification of Narcissus degeneration virus.
1范围
SN/T 4179规定了水仙退化病毒血清学、分子生物学检疫鉴定方法。
SN/T 4179适用于石蒜科等寄主植物中水仙退化病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3水仙退化病毒基本信息
中文名称:水仙退化病毒
学名:Narcissus degeneration virus
缩写:NDV
属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。
传播途径:种球传播、机械传播。
NDV的其他信息参见附录A。
4方法原理
水仙退化病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。
5仪器设备及用具
电子天平(1/100g)、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)、PCR反应管、无RNase Eppen-dorf离心管(1.5mL)、研钵、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、低温冰箱和超低温冰箱等。
1范围
SN/T 4179规定了水仙退化病毒血清学、分子生物学检疫鉴定方法。
SN/T 4179适用于石蒜科等寄主植物中水仙退化病毒的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3水仙退化病毒基本信息
中文名称:水仙退化病毒
学名:Narcissus degeneration virus
缩写:NDV
属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)成员。
传播途径:种球传播、机械传播。
NDV的其他信息参见附录A。
4方法原理
水仙退化病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据。
5仪器设备及用具
电子天平(1/100g)、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)、PCR反应管、无RNase Eppen-dorf离心管(1.5mL)、研钵、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、低温冰箱和超低温冰箱等。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4179—2015
水仙退化病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Narcissus degeneration virus2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4179—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：林石明、沈建国、廖富荣、方志鹏、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英1范围
水仙退化病毒检疫鉴定方法
本标准规定了水仙退化病毒血清学、分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于石蒜科等寄主植物中水仙退化病毒的检疫鉴定2规范性引用文件
SN/T4179—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3水仙退化病毒基本信息
中文名称：水仙退化病毒
学名：Narcissusdegenerationvirus缩写：NDV
属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyirus）成员传播途径：种球传播、机械传播。NDV的其他信息参见附录A。
4方法原理
水仙退化病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据5
仪器设备及用具
电子天平（1/1000g）、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）、PCR反应管、无RNaseEppendorf离心管（1.5mL）、研钵、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、低温冰箱和超低温冰箱等。6检测与鉴定www.bzxz.net
6.1抽样检查
按照SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。6.2捕获抗原酶联免疫吸附测试（PTA-ELISA）按附录B给出的方法进行PTA-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。1
SN/T4179—2015
3RT-PCR检测
按附录C给出的方法进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
6.4序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列（或翻译后的氨基酸序列)与已知的NDV相应序列进行比对。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。7结果判定
当PTA-ELISA和RT-PCR检测结果均为阳性时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV）。7.1
7.2当RT-PCR检测结果为阳性、测定的序列为NDV序列时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV)。注：根据国际病毒分类委员会（ICTV)第9次分类报告中马铃薯Y病毒科病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为：CP氨基酸序列一致性小于80%，或者CP基因或整个基因组的核苷酸序列一致性小于76%；并且聚合蛋白的剪切位点不相同。8结果记录
记录样品信息及各项检测数据，包括样品米源、种类，检测时间、地点、方法和结果等，以及检测人员签字。血清学检测结果保留吸光值的数据，分子生物学检测结果保留电泳照片及测序峰图等。9样品保存
阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。2
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
水仙退化病毒基本信息
SN/T4179—2015
石蒜科（Amaryllidaceae）的中国水仙（Narcissustazettavar.chinensis）、红口水仙（N.poeticus）、喇水仙（N.pseudonarcissus）和石蒜（Lycorisradiata）等。A.2病害症状
在水仙上表现为叶片褪绿条纹、斑驳，花杂色、畸形，以及植株矮化等症状。A.3
分布地区
主要分布于英国、新西兰、中国等国家A.4传播途径
鳞茎种球等繁殖材料是远距离扩散的主要途径；自然条件下机械传播。A.5
粒体形态
病毒粒体为线条状，长750nm～770nm（参见图A.1）。病毒的粒体（标尺为200nm；Chen，etal.，2007）图A.1
SN/T4179—2015
病毒基因组
正义、单链RNA病毒，基因组全序列大小为9816个核苷酸（不包含polyA尾），具有马铃薯Y病毒属的典型基因组结构特征（参见图A.2）。AI
P1-Pro
HC-Pro
(+2 fs)
Helicase
ATPase
VPgProteaseReplicase
Membrane
anchor
A(n)3'OH
马铃薯Y病毒属基因组结构示意图（以烟草蚀纹病毒为例，King，etal.,2012）B.1试剂
间接样品提取缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na2CO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN，）
附录B
（规范性附录）
PTA-ELISA检测方法
聚乙烯吡略烷酮（PVP，MW24~40000）20.0g
加人蒸馏水900mL，用HCI调节pH到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO.）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI）
叠氮化钠（NaN3）
加人900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCI调节pH到7.4，然后加水至1LB.1.3
PBST缓冲液（洗涤缓冲液）
每升PBS中加人0.5mL的吐温-20。抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液B.1.4
三羟基氨甲烷盐酸盐（Tris-HCI)三羟甲基氨基甲烷（Tris）
氯化钠（NaCI)
吐温-20（Tween-20）
脱脂奶粉
加人蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.5底物（pNPP）缓冲液（pH9.8)氯化镁（MgCl2）
叠氮化钠（NaNs）
二乙醇胺HN（CHCH,OH)，
溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.6抗体
病毒抗体：水仙退化病毒抗体。SN/T4179—2015
SN/T4179—2015
酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。B.2程序
B.2.1样品制备
称取一定量的待测样品（种球取芽上的幼叶或取外部鳞片、植株取叶片，每株取约0.1g，10株混合成约0.5g～1.0g的样品），按1：10（质量体积比）比例加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000×g离心5min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按说明书进行B.2.2包被抗原
加人制备好的检测样品，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。100μL/孔，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次～6次。B.2.3加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度，加人到酶联板的孔中，100μL/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次。B.2.4加酶标抗体
将酶标抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100uL/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次
B.2.5加底物
人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），将底物对硝基苯磷酸脂（pNPP）加100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育6吸光值的测定
室温下避光静置至阳性对照孔明显显色，B.3
结果判断
用酶标仪在405nm处读取吸光值。B.3.1对照孔的OD4os值（空白对照、阴性对照及阳性对照孔）质量控制应该满足以下条件：空白对照和阴性对照孔的OD4os值<0.15（如果阴性对照孔的OD45值<0.05时，按0.05计算）；
阳性对照OD40s值与阴性对照OD5之比值>5；同一样品的重复性基本一致。
在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：B.3.2
样品OD405值与阴性对照OD405之比值>2，判为阳性；样品OD405值与阴性对照OD405之比值接近阈值，判为可疑样品，需重新检测；样品OD405值与阴性对照OD405之比值<2，判为阴性B.3.3若满足不了B.3.1质量控制要求，需要重新检测，或用其他方法加以验证。6
C.1主要试剂
C.1.1RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸C.1.2
2RT-PCR试剂
5×RT缓冲液、dNTP混合液（各10mmol/L）SN/T4179—2015
乙酯（DEPO）处理的双蒸水。
M-MuLV反转录酶（200U/uL）、RNA酶抑制剂（RNasin）、10×PCR缓冲液（含20mmol/L的Mg）、TaqDNA聚合酶（2.5U/μL)。C.1.310×TBE缓冲液（Tris-Borate-EDTA）Tris碱
加H2O溶解，定容至1L。
C.1.4电泳试剂
琼脂糖、0.5μg/μL的溴化乙锭溶液、10×TBE缓冲液。C.1.5引物序列与合成
根据已报道的NDV基因组序列设计一对用于特异性的引物（见表C.1），由生物公司合成。表C
引物名称
(5-3')
引物序列（
引物序列及其位置
基因名称
ACCGTTGGCATCACTAAG
ACTGGTTCCACGCTCCTA
核内含体蛋白b(largenuclearinclusionproteins，NIb）。为GenBank的JQ395041序列相对位置。总RNA的提取
7992-8009
8614-8597
片段大小
取约0.1g样品组织置于研钵中，加人1mLPBST缓冲液研磨，4℃，10000×g离心5min，取上清并将上清液迅速转移至灭菌的1.5mL离心管中，并加人1mLTRIzol试剂，剧烈振荡后，室温静置5min；4℃，12000×g离心10min，取上清；加人三氯甲烷300μL，剧烈振荡15s，室温静置5min，4℃，12000×g离心15min，取上层水相；加人等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃，12000×g离心10min，弃上清；加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃，7500×g离心3min，7
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水仙退化病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Narcissus degeneration virus2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4179—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：林石明、沈建国、廖富荣、方志鹏、吴媛、陈青、陈红运、黄蓬英1范围
水仙退化病毒检疫鉴定方法
本标准规定了水仙退化病毒血清学、分子生物学检疫鉴定方法。本标准适用于石蒜科等寄主植物中水仙退化病毒的检疫鉴定2规范性引用文件
SN/T4179—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3水仙退化病毒基本信息
中文名称：水仙退化病毒
学名：Narcissusdegenerationvirus缩写：NDV
属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyirus）成员传播途径：种球传播、机械传播。NDV的其他信息参见附录A。
4方法原理
水仙退化病毒的血清学、分子生物学特性是制定本检疫鉴定方法的主要依据5
仪器设备及用具
电子天平（1/1000g）、高速冷冻离心机、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像分析系统、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）、PCR反应管、无RNaseEppendorf离心管（1.5mL）、研钵、微波炉、磁力搅拌器、恒温水浴锅、高压灭菌锅、低温冰箱和超低温冰箱等。6检测与鉴定www.bzxz.net
6.1抽样检查
按照SN/T2122给出的方法进行抽样、取样。6.2捕获抗原酶联免疫吸附测试（PTA-ELISA）按附录B给出的方法进行PTA-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。1
SN/T4179—2015
3RT-PCR检测
按附录C给出的方法进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
6.4序列测定与分析
将PCR产物回收后，进行克隆、测序，或者PCR产物直接测序（序列测定可由专业的生物公司完成）。把测定的核苷酸序列（或翻译后的氨基酸序列)与已知的NDV相应序列进行比对。注：序列比对可利用NCBI网站上的BLAST软件进行，网址为http：//ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。7结果判定
当PTA-ELISA和RT-PCR检测结果均为阳性时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV）。7.1
7.2当RT-PCR检测结果为阳性、测定的序列为NDV序列时，则判定为检出水仙退化病毒（NDV)。注：根据国际病毒分类委员会（ICTV)第9次分类报告中马铃薯Y病毒科病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为：CP氨基酸序列一致性小于80%，或者CP基因或整个基因组的核苷酸序列一致性小于76%；并且聚合蛋白的剪切位点不相同。8结果记录
记录样品信息及各项检测数据，包括样品米源、种类，检测时间、地点、方法和结果等，以及检测人员签字。血清学检测结果保留吸光值的数据，分子生物学检测结果保留电泳照片及测序峰图等。9样品保存
阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。2
A.1寄主范围
附录A
（资料性附录）
水仙退化病毒基本信息
SN/T4179—2015
石蒜科（Amaryllidaceae）的中国水仙（Narcissustazettavar.chinensis）、红口水仙（N.poeticus）、喇水仙（N.pseudonarcissus）和石蒜（Lycorisradiata）等。A.2病害症状
在水仙上表现为叶片褪绿条纹、斑驳，花杂色、畸形，以及植株矮化等症状。A.3
分布地区
主要分布于英国、新西兰、中国等国家A.4传播途径
鳞茎种球等繁殖材料是远距离扩散的主要途径；自然条件下机械传播。A.5
粒体形态
病毒粒体为线条状，长750nm～770nm（参见图A.1）。病毒的粒体（标尺为200nm；Chen，etal.，2007）图A.1
SN/T4179—2015
病毒基因组
正义、单链RNA病毒，基因组全序列大小为9816个核苷酸（不包含polyA尾），具有马铃薯Y病毒属的典型基因组结构特征（参见图A.2）。AI
P1-Pro
HC-Pro
(+2 fs)
Helicase
ATPase
VPgProteaseReplicase
Membrane
anchor
A(n)3'OH
马铃薯Y病毒属基因组结构示意图（以烟草蚀纹病毒为例，King，etal.,2012）B.1试剂
间接样品提取缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（Na2CO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN，）
附录B
（规范性附录）
PTA-ELISA检测方法
聚乙烯吡略烷酮（PVP，MW24~40000）20.0g
加人蒸馏水900mL，用HCI调节pH到9.6，然后加蒸馏水至1L，4℃储存。磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）
氯化钠（NaCI）
磷酸二氢钾（KH,PO.）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI）
叠氮化钠（NaN3）
加人900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCI调节pH到7.4，然后加水至1LB.1.3
PBST缓冲液（洗涤缓冲液）
每升PBS中加人0.5mL的吐温-20。抗体稀释缓冲液/酶标抗体稀释缓冲液B.1.4
三羟基氨甲烷盐酸盐（Tris-HCI)三羟甲基氨基甲烷（Tris）
氯化钠（NaCI)
吐温-20（Tween-20）
脱脂奶粉
加人蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.5底物（pNPP）缓冲液（pH9.8)氯化镁（MgCl2）
叠氮化钠（NaNs）
二乙醇胺HN（CHCH,OH)，
溶于800mL蒸馏水中，用HCl调pH至9.8，蒸馏水定容至1L，4℃储存。B.1.6抗体
病毒抗体：水仙退化病毒抗体。SN/T4179—2015
SN/T4179—2015
酶标抗体：碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG。B.2程序
B.2.1样品制备
称取一定量的待测样品（种球取芽上的幼叶或取外部鳞片、植株取叶片，每株取约0.1g，10株混合成约0.5g～1.0g的样品），按1：10（质量体积比）比例加入包被缓冲液，用研钵研磨成浆，8000×g离心5min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按说明书进行B.2.2包被抗原
加人制备好的检测样品，同时设置阴性对照、阳性对照和空白对照。每个处理至少设2个重复。100μL/孔，37℃孵育1h或4℃冰箱孵育过夜，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次～6次。B.2.3加病毒抗体
将病毒抗体按说明稀释至工作浓度，加人到酶联板的孔中，100μL/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次。B.2.4加酶标抗体
将酶标抗体按说明稀释至工作浓度，加入到酶联板的孔中，100uL/孔，37℃孵育1h，倒去酶联板孔中溶液，用PBST洗涤4次~6次
B.2.5加底物
人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），将底物对硝基苯磷酸脂（pNPP）加100μL/孔，加入到酶联板中，室温避光孵育6吸光值的测定
室温下避光静置至阳性对照孔明显显色，B.3
结果判断
用酶标仪在405nm处读取吸光值。B.3.1对照孔的OD4os值（空白对照、阴性对照及阳性对照孔）质量控制应该满足以下条件：空白对照和阴性对照孔的OD4os值<0.15（如果阴性对照孔的OD45值<0.05时，按0.05计算）；
阳性对照OD40s值与阴性对照OD5之比值>5；同一样品的重复性基本一致。
在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判断如下：B.3.2
样品OD405值与阴性对照OD405之比值>2，判为阳性；样品OD405值与阴性对照OD405之比值接近阈值，判为可疑样品，需重新检测；样品OD405值与阴性对照OD405之比值<2，判为阴性B.3.3若满足不了B.3.1质量控制要求，需要重新检测，或用其他方法加以验证。6
C.1主要试剂
C.1.1RNA提取试剂
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测方法
TRIzol试剂、三氯甲烷、异丙醇、70%乙醇、焦碳酸C.1.2
2RT-PCR试剂
5×RT缓冲液、dNTP混合液（各10mmol/L）SN/T4179—2015
乙酯（DEPO）处理的双蒸水。
M-MuLV反转录酶（200U/uL）、RNA酶抑制剂（RNasin）、10×PCR缓冲液（含20mmol/L的Mg）、TaqDNA聚合酶（2.5U/μL)。C.1.310×TBE缓冲液（Tris-Borate-EDTA）Tris碱
加H2O溶解，定容至1L。
C.1.4电泳试剂
琼脂糖、0.5μg/μL的溴化乙锭溶液、10×TBE缓冲液。C.1.5引物序列与合成
根据已报道的NDV基因组序列设计一对用于特异性的引物（见表C.1），由生物公司合成。表C
引物名称
(5-3')
引物序列（
引物序列及其位置
基因名称
ACCGTTGGCATCACTAAG
ACTGGTTCCACGCTCCTA
核内含体蛋白b(largenuclearinclusionproteins，NIb）。为GenBank的JQ395041序列相对位置。总RNA的提取
7992-8009
8614-8597
片段大小
取约0.1g样品组织置于研钵中，加人1mLPBST缓冲液研磨，4℃，10000×g离心5min，取上清并将上清液迅速转移至灭菌的1.5mL离心管中，并加人1mLTRIzol试剂，剧烈振荡后，室温静置5min；4℃，12000×g离心10min，取上清；加人三氯甲烷300μL，剧烈振荡15s，室温静置5min，4℃，12000×g离心15min，取上层水相；加人等体积的异丙醇，颠倒混匀后室温下静置15min，4℃，12000×g离心10min，弃上清；加人1mL75%的乙醇洗涤沉淀2次，每次4℃，7500×g离心3min，7
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