中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4276—2015 国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法 Detection of Yersinia pestis in rodents by real-time PCR method at frontier port 2015-05-26发布 2016-01-01实施 国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出入境检验检疫局、北京市海淀区疾病预防控制中心、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：田洁、陆琳、郭惠琳、何斌、刘艳华、任彤、赵静、黄恩炯。 1 范围 本标准规定了国境口岸鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测方法的检测对象，标本的采集、处理、检测程序。本标准适用于国境口岸鼠疫耶尔森菌的荧光PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 28940 病媒生物感染病原体采样规程 鼠类 GB/T 28942 病媒生物感染病原体采样规程 蚤 SN/T 1240 国境口岸鼠类监测规程 SN/T 1292 国境口岸蚤类监测规程 WS 279 鼠疫诊断标准 人间传染的病原微生物名录（卫生部） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鼠疫耶尔森菌 (Yersinia pestis) 俗称鼠疫杆菌，为革兰阴性短粗杆菌，菌体两端钝圆且浓染，亦易被苯胺染料着色，大小为(0.5μm～1.0μm)×(1.0μm～2.0μm)。一般分散存在，偶尔成双或呈短链排列，无鞭毛，不形成芽胞。鼠疫耶尔森菌是鼠疫的病原菌，鼠疫是一种人兽共患的自然疫源性烈性传染病，人类鼠疫多为疫鼠的跳蚤叮咬而感染，是我国法定的甲类传染病。鼠疫传染性强，病死率高，易酿成大流行。鼠疫耶尔森菌主要累及皮肤和淋巴结，其次为败血症、肺炎、脑膜炎。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction） Ct值：循环值，每个反应管的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数（cycle threshold） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） PBS缓冲液：含0.5%吐温-20的pH 7.4的磷酸盐缓冲液 生理盐水：0.9%的氯化钠水溶液。 5 实验室生物安全要求 按照《人间传染的病原微生物名录》规定，本方法中鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测应在GB 19489规定的生物安全II级（BSL-2）实验室内进行。 6 检测对象 6.1 国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌感染者的临床样品 6.2 国境口岸可能携带鼠疫耶尔森菌的医学媒介生物样品 6.3 国境口岸疑似鼠疫耶尔森菌污染的环境样品 7 主要仪器设备 本方法使用的主要仪器如下： 实时荧光PCR仪； 二级生物安全柜； 高压灭菌器； 70℃超低温冰箱（或液氨罐）； 普通冰箱； 高速台式冷冻离心机（最高转速13800g以上，微量可调）； 移液器（10μL、200μL、1000μL）及配套的一次性带滤芯吸头； 水浴锅； 组织研磨器。 8 试剂 本方法使用的主要试剂如下： 无菌生理盐水或三蒸水； Premix Ex Taq™ (Probe PCR)； 引物； 阳性对照； 阴性对照； 探针。 注：1）给出这一信息是为了方便本标准使用者，并不表示只认可该产品。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用等效产品。 9 检测程序 9.1 样本采集 9.1.1 鼠类样品的采集、运输和保存按照GB/T 28940、SN/T 1240操作；蚤类样品的采集按照GB/T 28942、SN/T 1292操作。 9.1.2 临床样品的采集按照WS 279操作。 9.1.3 环境样品按无菌技术操作，取适量置于无菌容器中密封保存。 9.1.4 在采集过程中做好个人防护。 9.2 样品检测 9.2.1 核酸提取 9.2.1.1 煮沸法提取核酸 以无菌方法称取0.2g粉碎的固体环境样品，加入1mL的无菌去离子水，充分振荡。 9.2.1.1.1 2000r/min离心4min，收集上清液，将上清液8000r/min离心5min，收集沉淀；沉淀中加入0.1mL无菌去离子水，沸水中加热5min；8000r/min离心3min，上清液作为PCR扩增。