SN/T 4275-2015.Detection of Burkholderia pseudomallei by real-time PCR at frontier ports.
1范围
SN/T 4275规定了国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测的对象,标本的采集、运输和保存,检测程序及结果报告。
SN/T 4275适用于国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室 生物安全通用要 求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1类鼻疽伯克霍尔德菌Burkholderia pseudomallei
属革兰氏阴性菌,是引起人及动物严重感染性疾病类鼻疽的病原体。该菌广泛分布于东南亚和澳大利亚北部的水及土壤中。我国疫源地主要分布于海南、广东、广西、湖南、贵州、福建、香港、台湾等省区。人群对该菌普遍易感，临床症状表现复杂多样,分为急性败血症型、亚急性型、慢性型和亚临床型,最严重的症状是合并肺炎和急性败血症。该病病死率高。
3.2荧光PCRfluorescence polymerase chain reaction
又名实时荧光PCR(real-timePCR),实时荧光PCR方法有多种,本标准采用的是TaqMan水解探针法,其原理是在常规PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针,该探针为- .条寡核苷酸,两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时,利用Taq酶的5'-3’外切酶活性将探针酶切水解,使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环,荧光信号也和目的片段一样,有一个同步指数增长的过程,信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4275—2015
国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测方法
Detection of Burkholderia pseudomallei byreal-timePCR atfrontierports2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4275—2015
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国黑龙江出人境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：田绿波、樊学军、翰文东、陈肖潇、石莹、杨雨、倪卫琴、朱旭平、王宁。I
1范围
国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的实时荧光PCR检测方法
SN/T4275—2015
本标准规定了国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测的对象，标本的采集、运输和保存，检测程序及结果报告。
本标准适用于国境口岸类鼻疽伯克霍尔德菌的筛选检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法实验室生物安全通用要求
GB19489
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
南Burkholderia
类鼻疽伯克霍尔德菌
pseudomallei
属革兰氏阴性菌，是引起人及动物严感染性疾病类鼻疽的病原体。该菌广泛分布于东南亚和澳曹
主要分布于海百
大利亚北部的水及土壤中。我国疫源地、广东、广西、湖南、贵州、福建、香港、台湾等省现复杂多样，分为急性败
血症型亚急性型、慢性型和亚临床型，区。人群对该菌普遍易感，临床症状表
最严重的症状是合并肺炎和急性败血症3.2
荧光PCR
该病病死率高。
ymerase chain reaction
fluorescence poly
PCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TagMan水解探又名实时荧光PCR（real-time）针法，其原理是在常规PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Tag酶的5\-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有一个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。
Ct值cyclethreshold
即循环阅值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
SN/T4275—2015
Bp：类异疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei）PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）FAM：6-羧基荧光素（6-carboxyfluorescein）MGB：小沟结合物，一种荧光淬灭基团（minorgroovebinder）dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）5检测对象
疑似类鼻疽伯克霍尔德菌感染的临床标本如血液、痰液、尿、粪便、局部病灶及脓性渗出物。环境污染标本如水样、泥土。
生物安全和PCR防污染要求
检测工作中的个人防护参照GB19489。实验室应遵循GB19489对生物安全2级（BSL-2）实验室的生物安全要求使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。仪器和试剂
仪器和器材
本方法使用主要仪器和设备如下：实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管；生物安全柜；
高速台式离心机（离心速度13800g以上）；台式离心机（离心速度900g）；漩涡振荡器；
恒温水浴锅；
高压灭菌锅；
低温冷藏、冷冻冰箱；
微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL)及配套带滤芯吸头；离心管。
主要试剂
除另有规定外，所有化学试剂均采用分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格生理盐水
灭菌蒸馏水和NaCI配制浓度为0.9%的生理盐水7.2.44%Na0H
灭菌蒸馏水和NaOH配制浓度为4%的NaOH溶液。2
7.2.5DNA提取液
含0.9%NaCI和0.1%EDTA-Na2的混合液。实时荧光PCR试剂
实时荧光PCR试剂包括以下组分：SN/T4275—2015
10XPCR缓冲液（500mmol/LKCl,15mmol/LMgC12100mmol/LTris·HCl，pH8.3)；a
dNTP(10mmol/L);
Taq酶（5U/μL)；
空白对照品（灭菌双蒸水ddH,O）；d）
阳性对照品（人工制备含Bp检测序列的质粒）；e
引物和探针。
实时荧光PCR检测的引物和探针
类鼻疽伯克霍尔德菌的特异性引物和探针：Bp-F:5′-TCCTCCTTCTCGGTCATGC-3*Bp-R:5'-CGGTAACTCAGCGGATTCC-3\Bp-probe:5-FAM-CAATCTCACCAGCGTT(MGB)-3检测程序
8.1样本的采集
8.1.1粪便标本
采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集5g～8g，水样便采集1mL～3mL。亦可用以湿润的直肠棉拭插入直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，有可见粪便的棉拭放入采便管内。采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检8.1.2
血液标本
采取静脉血2mL，置于灭菌的一次性非肝素抗凝试管中，外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。
8.1.3痰液标本
用无菌5mL玻璃管取受检者肺深部咳出痰液1mL～3mL，密闭后，外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。8.1.4脓液标本
用无菌棉签采取病灶深部液置无菌试管中，密闭后，外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。
8.1.5尿液标本
用无菌容器采集3mL～5mL受检者清洁中段尿，密闭后，外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。3
SN/T4275—2015
6环境污染标本
8.1.6.1水样用无菌容器采集3mL～5mL，外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。
8.1.6.2泥土用无菌蒸馏水3mL～5mL制成悬液，装人无菌容器中，外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。样本的运送与保存
样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。对于不立即检测的样本，可保存于一20℃待检。8.3
样本的前处理
粪便标本
挑取米粒大小粪便，放置于有0.5m上清液，沉淀用于核酸提取。
血液标本
无需处理可直接用于核酸提取
8.3.3痰液、黏稠脓液标本
盐水的离心管中，振荡混匀，16200g离心2min。去尽标本中加人4倍体积的4%NaOH，摇匀，室温放置30min液化，取0.5mL样品至1.5mL离心管中，再加人0.5mL4%NaOH室温放置10min后16200g离心5min。沉淀中加无菌生理盐水1mL，打匀，16200g离心5min，再重复洗涤8.3.4尿液、水样脓液、环境污染标本次。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。取标本或制成的标本悬液
支3mL，16200g离心2min。
8.4样本的DNA提取
处理沉淀中，或
在粪便、痰液、脓液、尿液、环境污染标本的前100μL血液标本中，加入100μLDNA提取液充分混匀，沸水浴1Qmin（误差不超过1min）。16200g离心5min，上清可直接作为荧光PCR反应的DNA模板。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按其说明书操作。8.5bzxZ.net
实时荧光PCR反应液配制
反应体系设置为25μL，组成如下：a)
10×PCR缓冲液
dNTP(10mmol/L)
Bp-F(20μmol/L)
Bp-R(20μmol/L)
Bp-probe(20 μmol/L)
Taq酶（5U/μL)
依据上述反应体系分别配制待检标本、阳性对照品、阴性对照品的荧光PCR检测反应液，并置于PCR反应管中。
PGR扩增
SN/T4275-—2015
PCR反应管置于荧光PCR仪上，反应参数设置为：94℃X2min；93℃×15s，60℃×60s，循环40次；单通道荧光检测在60℃。反应体系为25μL，荧光通道检测选择FAM通道，因不同荧光PCR仪的性能差异，可通过条件优化适当调整PCR循环的温度和时间。9结果判定及报告
基线和阐值设定
基线调整取6～15个循环的荧光信号，值设定原则以阈值线刚好超过阴性对照品的检测荧光曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。9.2
质控标准
阴性对照无扩增曲线及Ct值，同时阳性对照Ct值应<35，且有明显扩增曲线，否则实验视为无效，9.3检测结果的判定
9.3.1待检标本无Ct值，且无扩增曲线，则报告为类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测阴性。9.3.2待检标本Ct值≤35，且有典型扩增曲线，则报告为类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测阳性。9.3.3待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测阳性；否则建议采用浓缩方式RT-PCR
处理核酸样本，再重新进行实时荧光检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测阳性：否则判为阴性，报告类鼻疽伯克霍尔德菌荧光PCR检测阴性
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