SN/T 4274-2015
基本信息
标准号： SN/T 4274-2015
中文名称：国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌0157:H7的三重荧光PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 沙门氏菌 氏菌 大肠杆菌 三重 荧光 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4274-2015.Detection of Salmonella ,Shigella and Escherichia coli 0157:H7 by triplex real-time PCR at frontier ports.
1范围
SN/T 4274规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7三重荧光PCR检测的对象,标本的采集、运输和保存,检测程序及结果报告。
SN/T 4274适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 4789.17食品卫生微生物学检验肉 与肉制品检验
GB 4789.18食 品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验
GB/T 4789.19食品 卫生微生物学检验蛋 与蛋制品检验
GB/T 4789.20食品卫生 微生物学检验水产食 品检验
GB/T 4789.21食品卫生微生物学检验冷冻饮 品饮料检验
GB/T 4789.22食品 卫生微生物学检验调味品 检验
GB/T 4789.23食 品卫生微生物学检验冷食菜、豆制 品检验
GB/T 4789.24食品 卫生微生物学检验糖果、糕点 、蜜饯检验
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1沙门氏菌Salmonella
属肠杆菌科,革兰氏阴性杆菌。菌体大小(0.7μm~1.5μm)X(2.0μm~5.0μm),无芽胞,一般无荚膜,除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外,大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。
1范围
SN/T 4274规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7三重荧光PCR检测的对象,标本的采集、运输和保存,检测程序及结果报告。
SN/T 4274适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 4789.17食品卫生微生物学检验肉 与肉制品检验
GB 4789.18食 品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验
GB/T 4789.19食品 卫生微生物学检验蛋 与蛋制品检验
GB/T 4789.20食品卫生 微生物学检验水产食 品检验
GB/T 4789.21食品卫生微生物学检验冷冻饮 品饮料检验
GB/T 4789.22食品 卫生微生物学检验调味品 检验
GB/T 4789.23食 品卫生微生物学检验冷食菜、豆制 品检验
GB/T 4789.24食品 卫生微生物学检验糖果、糕点 、蜜饯检验
GB 19489实验室生物安全通 用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1沙门氏菌Salmonella
属肠杆菌科,革兰氏阴性杆菌。菌体大小(0.7μm~1.5μm)X(2.0μm~5.0μm),无芽胞,一般无荚膜,除鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外,大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒,导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4274—2015
国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的三重荧光PCR检测方法Detection of Salmonella ,Shigella and Escherichia coliO157:H7by triplex real-time PCR at frontier ports2015-05-26发布
中华人民共和国
刮涂层查真伪
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4274—2015
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：樊学军、田绿波、王莹、陈肖潇、石莹、杨雨、倪卫琴、朱旭平、王宁。I
1范围
国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7的三重荧光PCR检测方法SN/T4274—2015
本标准规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7三重荧光PCR检测的对象，标本的采集、运输和保存，检测程序及结果报告本标准适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的筛选检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.17食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验GB4789.18食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验GB/T4789.19
GB/T4789.20
GB/T4789.21
GB/T4789.22
GB/T4789.23
GB/T4789.24
食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验食品卫生微生物学检验水产食品检验食品卫生微生物学检验冷冻饮品饮料检验食品卫生微生物学检验
食品卫生微生物学检验
食品卫生微生物学检验
实验室生物安全通用要求
GB19489
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
沙门氏菌Salmonella
调味品检验
冷食菜、豆制品检验
糖果、糕点、蜜饯检验
属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。菌体大小（0.7μm~1.5μm）×（2.0μm～5.0μm），无芽胞，一般无荚膜，除鸡白沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。3.2此内容来自标准下载网
志贺氏菌Shigella
属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小为（0.5um～0.7um）×（2um3um），无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，以全身中毒症状和下部大肠化脓性炎症为主要特征，严重者可发生感染性休克和(或)中毒性脑病。3.3
大肠杆菌0157：H7
7Escherichiacoli0157H7
属肠杆菌科埃希氏菌属属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小（0.4um～0.7μm）×（1μm3μm），无芽胞，有普通菌毛与性菌毛。可致人腹泻、出血性结肠炎，5%～10%的病例并发溶血性尿毒综合征1
SN/T4274—2015
(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等3.4
fluorescencepolymerasechainreaction荧光PCR
又称为实时荧光PCR（real-timePCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5°-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。
Ct值cyclethreshold
即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）MGB：小沟结合物，一种荧光淬灭基团（minorgroovebinder）5
检测对象
5.1疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7感染者的临床标本如粪便。疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7污染环境标本如水样，以及食品。5.2
生物安全和PCR防污染要求
检测工作中的个人防护参照GB19489。6.2
实验室应遵循GB19489对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。6.3
使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。仪器和试剂
仪器和器材
本方法使用主要仪器和器材：
实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管；生物安全柜；
高速台式离心机（离心速度13800g以上）；台式离心机（离心速度900g）；涡振荡器；
恒温水浴锅；
高压灭菌锅；
低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱：
微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL)及配套带滤芯吸头；一离心管（1.5mL）。
生理盐水
蒸馏水和NaCI浓度配制为0.9%的生理盐水。7.2.2
检测试剂盒
试剂盒包括以下组分：
DNA提取液（含0.9%NaCI和0.1%EDTA-Na2的混合液）；a）
SN/T4274—2015
10XPCR缓冲液（500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2，100mmol/LTris·HCl,pH8.3)；dNTP(10mmol/L);
Taq酶（5U/μL);
阴性对照品（灭菌双蒸水ddH,O)；阳性对照品（人工制备含沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7检测序列的质粒）；引物和探针（详见7.2.3）。
引物和探针
引物和探针序列如下：
沙门氏菌：
上游引物：5-TTTCCTGCGGTACTGTTAATTAC-3下游引物：5'-GGCTTCAATCAAGATAAGACG-3°探针：5-FAM-TTCGTCTGGCATTATC(MGB)-3b）志贺氏菌：
上游引物：5-ATGTTAAGGTTGCAGCTCTCTTTG-3下游引物：5'-ACAATACTCCTTGAGCACCATACG-3探针：5'-HEX-TTCTTGACATCCTCCACG(MGB)-3c）大肠杆菌0157：H7：
上游引物：5'-ACGGTTCAGGCCACTACAGG-3下游引物：5-TCTTTCGCCAGCACGTTCAC-3探针:5'-Red610-ACTAACTCCGATTCTGA(MGB)-38
检测程序
8.1样本的采集
粪便标本
采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集5g～8g，水样便采集1mL～3mL。亦可用以湿润的直肠棉拭插人直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，有可见粪便的棉拭放入采便管内。采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。3
SN/T4274—2015
水样标本
水样用无菌容器采集3mL～5mL，密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。
食品标本
肉与肉制品的取样方法按GB/T4789.17的规定。乳与乳制品的取样方法按GB4789.18的规定、蛋与蛋制品的取样方法按GB/T4789.19的规定。各种水产食品及其制品的取样方法按GB/T4789.20的规定清凉饮料的取样方法按GB/T4789.21的规定。调味品的取样方法按GB/T4789.22的规定。冷食菜、豆制品的取样方法按GB/T4789.23的规定。糖果、糕点、蜜伐的取样方法按GB/T4789.24的规定8.2样本的运送与保存
对于不立即检测的样本，应保存于一20℃待检。样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。8.3样本的前处理
粪便标本
，放置于有0.5mL生理盐水的离心管中，振荡混匀，采集成形便5g～8g（尽可能取黏液脓血部分）发，沉淀用于核酸提取。
16200g离心2min。去尽上清液
2水样标本
取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。8.3.3
食品标本
取处理后的标本1mL～3mL16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。8.4样本的DNA提取
在标本的前处理沉淀中，加人100uLDNA提取液充分混勾，沸水浴10min（误差不超过1min）。16200g离心5min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按其说明书操作。
8.5荧光PCR检测
试剂配制
反应体系设置为40μL，组成如下：a)
10XPCR缓冲液
dNTP(10mmol/L)
沙门菌Bp-F（20μmol/L）
沙门菌Bp-R（20μmol/L）
沙门菌Bp-probe(20μmol/L）
志贺菌Bp-F(20μmol/L）
志贺菌Bp-R(20μmol/L)
志贺菌Bp-probe(20μmol/L）
大肠杆菌O157：H7Bp-F（20umol/L）大肠杆菌O157:H7Bp-R(20μmol/L）大肠杆菌O157：H7Bp-probe(20μmol/L）Tag酶（5U/μL)
SN/T4274—2015
依据上述反应体系分别配制待检标本、阳性对照品、阴性对照品的荧光PCR检测反应液，并置于PCR反应管中。
8.5.2PCR扩增
8.5.2.1反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置37℃×2min,94℃×2min;93℃X
15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40μL。8.5.2.2荧光通道检测选择：选择FAM、HEX利Red1610通道。使用ABI系列PCR仪时，请务必于passivereference和quencher处选择\none”8.5.2.3因不同荧光PCR仪的性能差异，可通过条件优化适当调整PCR循环的温度和时间。9
结果判定
基线和阐值设定
基线调整取6～15个循环的荧光信号，阅值设定原则以阈值线刚好超过HO检测荧光曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整9.2
质量控制
阴性对照（ddH,O)在FAM.HEX和Red610通道检测结果应为UNDET；阳性对照品FAM、HEX和Red610通道检测结果Ct值均≤35，且有明显的扩增曲线：否则实验视为无效9.3
检测结果的判定
检测结果的判定应按照表1规定。表1检测结果的判定
UNDET或40
报告为沙门氏菌荧光PCR检测阳性结果判断
检测样品低于检测限，报告为沙门氏菌荧光PCR检测阴性待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告沙门氏菌荧光PCR检测阳性；否则建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告沙门氏菌荧光PCR检测阳性；否则判为阴性，报告沙门氏菌荧光PCR检测阴性SN/T4274—2015
Red610
UNDET或40
UNDET或40
检测注意事项
表1（续）
报告为志贺氏菌荧光PCR检测阳性结果判断
检测样品低于检测限，报告为志贺氏菌荧光PCR检测阴性待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告志贺氏菌荧光PCR检测阳性；否则建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告志贺氏菌荧光PCR检测阳性；否则判为阴性，报告志贺氏菌荧光PCR检测阴性报告为大肠杆菌O157:H7荧光PCR检测阳性检测样品低于检测限，报告为大肠杆菌O157:H7荧光PCR检测阴性待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告人肠杆菌O157：H7灾光PCK检测阳性；否则建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告大肠杆菌O157：H7荧光PCR检测阳性；否则判为阴性，报告大肠杆菌O157:H7荧光PCR检测阴性实验室环境污染，试剂污染，样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。当检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限10°copies/mL时可能会发生假阴性的结果。6
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国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的三重荧光PCR检测方法Detection of Salmonella ,Shigella and Escherichia coliO157:H7by triplex real-time PCR at frontier ports2015-05-26发布
中华人民共和国
刮涂层查真伪
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4274—2015
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。本标准主要起草人：樊学军、田绿波、王莹、陈肖潇、石莹、杨雨、倪卫琴、朱旭平、王宁。I
1范围
国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7的三重荧光PCR检测方法SN/T4274—2015
本标准规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7三重荧光PCR检测的对象，标本的采集、运输和保存，检测程序及结果报告本标准适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的筛选检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T4789.17食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验GB4789.18食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验GB/T4789.19
GB/T4789.20
GB/T4789.21
GB/T4789.22
GB/T4789.23
GB/T4789.24
食品卫生微生物学检验蛋与蛋制品检验食品卫生微生物学检验水产食品检验食品卫生微生物学检验冷冻饮品饮料检验食品卫生微生物学检验
食品卫生微生物学检验
食品卫生微生物学检验
实验室生物安全通用要求
GB19489
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
沙门氏菌Salmonella
调味品检验
冷食菜、豆制品检验
糖果、糕点、蜜饯检验
属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。菌体大小（0.7μm~1.5μm）×（2.0μm～5.0μm），无芽胞，一般无荚膜，除鸡白沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。3.2此内容来自标准下载网
志贺氏菌Shigella
属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小为（0.5um～0.7um）×（2um3um），无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，以全身中毒症状和下部大肠化脓性炎症为主要特征，严重者可发生感染性休克和(或)中毒性脑病。3.3
大肠杆菌0157：H7
7Escherichiacoli0157H7
属肠杆菌科埃希氏菌属属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小（0.4um～0.7μm）×（1μm3μm），无芽胞，有普通菌毛与性菌毛。可致人腹泻、出血性结肠炎，5%～10%的病例并发溶血性尿毒综合征1
SN/T4274—2015
(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等3.4
fluorescencepolymerasechainreaction荧光PCR
又称为实时荧光PCR（real-timePCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5°-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。
Ct值cyclethreshold
即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
PCR：聚合酶链反应（polymerasechainreaction）DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）MGB：小沟结合物，一种荧光淬灭基团（minorgroovebinder）5
检测对象
5.1疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7感染者的临床标本如粪便。疑似沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7污染环境标本如水样，以及食品。5.2
生物安全和PCR防污染要求
检测工作中的个人防护参照GB19489。6.2
实验室应遵循GB19489对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求。6.3
使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。仪器和试剂
仪器和器材
本方法使用主要仪器和器材：
实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管；生物安全柜；
高速台式离心机（离心速度13800g以上）；台式离心机（离心速度900g）；涡振荡器；
恒温水浴锅；
高压灭菌锅；
低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱：
微量可调移液器（10μL、100μL、200μL、1000μL)及配套带滤芯吸头；一离心管（1.5mL）。
生理盐水
蒸馏水和NaCI浓度配制为0.9%的生理盐水。7.2.2
检测试剂盒
试剂盒包括以下组分：
DNA提取液（含0.9%NaCI和0.1%EDTA-Na2的混合液）；a）
SN/T4274—2015
10XPCR缓冲液（500mmol/LKCl,15mmol/LMgCl2，100mmol/LTris·HCl,pH8.3)；dNTP(10mmol/L);
Taq酶（5U/μL);
阴性对照品（灭菌双蒸水ddH,O)；阳性对照品（人工制备含沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157：H7检测序列的质粒）；引物和探针（详见7.2.3）。
引物和探针
引物和探针序列如下：
沙门氏菌：
上游引物：5-TTTCCTGCGGTACTGTTAATTAC-3下游引物：5'-GGCTTCAATCAAGATAAGACG-3°探针：5-FAM-TTCGTCTGGCATTATC(MGB)-3b）志贺氏菌：
上游引物：5-ATGTTAAGGTTGCAGCTCTCTTTG-3下游引物：5'-ACAATACTCCTTGAGCACCATACG-3探针：5'-HEX-TTCTTGACATCCTCCACG(MGB)-3c）大肠杆菌0157：H7：
上游引物：5'-ACGGTTCAGGCCACTACAGG-3下游引物：5-TCTTTCGCCAGCACGTTCAC-3探针:5'-Red610-ACTAACTCCGATTCTGA(MGB)-38
检测程序
8.1样本的采集
粪便标本
采集病人发病早期新鲜粪便于一次性无菌采便管内，成形便采集5g～8g，水样便采集1mL～3mL。亦可用以湿润的直肠棉拭插人直肠内3cm～5cm处并轻轻旋转，有可见粪便的棉拭放入采便管内。采便管外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。3
SN/T4274—2015
水样标本
水样用无菌容器采集3mL～5mL，密闭后外表贴上带有唯一识别号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。
食品标本
肉与肉制品的取样方法按GB/T4789.17的规定。乳与乳制品的取样方法按GB4789.18的规定、蛋与蛋制品的取样方法按GB/T4789.19的规定。各种水产食品及其制品的取样方法按GB/T4789.20的规定清凉饮料的取样方法按GB/T4789.21的规定。调味品的取样方法按GB/T4789.22的规定。冷食菜、豆制品的取样方法按GB/T4789.23的规定。糖果、糕点、蜜伐的取样方法按GB/T4789.24的规定8.2样本的运送与保存
对于不立即检测的样本，应保存于一20℃待检。样本运输采用冰壶加冰或泡沫盒加冰密封运输。8.3样本的前处理
粪便标本
，放置于有0.5mL生理盐水的离心管中，振荡混匀，采集成形便5g～8g（尽可能取黏液脓血部分）发，沉淀用于核酸提取。
16200g离心2min。去尽上清液
2水样标本
取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。8.3.3
食品标本
取处理后的标本1mL～3mL16200g离心2min。去尽上清液，沉淀用于核酸提取。8.4样本的DNA提取
在标本的前处理沉淀中，加人100uLDNA提取液充分混勾，沸水浴10min（误差不超过1min）。16200g离心5min，上清可直接用于荧光PCR反应。也可以使用商品化的DNA提取试剂盒并按其说明书操作。
8.5荧光PCR检测
试剂配制
反应体系设置为40μL，组成如下：a)
10XPCR缓冲液
dNTP(10mmol/L)
沙门菌Bp-F（20μmol/L）
沙门菌Bp-R（20μmol/L）
沙门菌Bp-probe(20μmol/L）
志贺菌Bp-F(20μmol/L）
志贺菌Bp-R(20μmol/L)
志贺菌Bp-probe(20μmol/L）
大肠杆菌O157：H7Bp-F（20umol/L）大肠杆菌O157:H7Bp-R(20μmol/L）大肠杆菌O157：H7Bp-probe(20μmol/L）Tag酶（5U/μL)
SN/T4274—2015
依据上述反应体系分别配制待检标本、阳性对照品、阴性对照品的荧光PCR检测反应液，并置于PCR反应管中。
8.5.2PCR扩增
8.5.2.1反应管置于定量荧光PCR仪上，推荐循环参数设置37℃×2min,94℃×2min;93℃X
15s，60℃×60s，循环40次；单点荧光检测在60℃。反应体系为40μL。8.5.2.2荧光通道检测选择：选择FAM、HEX利Red1610通道。使用ABI系列PCR仪时，请务必于passivereference和quencher处选择\none”8.5.2.3因不同荧光PCR仪的性能差异，可通过条件优化适当调整PCR循环的温度和时间。9
结果判定
基线和阐值设定
基线调整取6～15个循环的荧光信号，阅值设定原则以阈值线刚好超过HO检测荧光曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整9.2
质量控制
阴性对照（ddH,O)在FAM.HEX和Red610通道检测结果应为UNDET；阳性对照品FAM、HEX和Red610通道检测结果Ct值均≤35，且有明显的扩增曲线：否则实验视为无效9.3
检测结果的判定
检测结果的判定应按照表1规定。表1检测结果的判定
UNDET或40
报告为沙门氏菌荧光PCR检测阳性结果判断
检测样品低于检测限，报告为沙门氏菌荧光PCR检测阴性待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告沙门氏菌荧光PCR检测阳性；否则建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告沙门氏菌荧光PCR检测阳性；否则判为阴性，报告沙门氏菌荧光PCR检测阴性SN/T4274—2015
Red610
UNDET或40
UNDET或40
检测注意事项
表1（续）
报告为志贺氏菌荧光PCR检测阳性结果判断
检测样品低于检测限，报告为志贺氏菌荧光PCR检测阴性待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告志贺氏菌荧光PCR检测阳性；否则建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告志贺氏菌荧光PCR检测阳性；否则判为阴性，报告志贺氏菌荧光PCR检测阴性报告为大肠杆菌O157:H7荧光PCR检测阳性检测样品低于检测限，报告为大肠杆菌O157:H7荧光PCR检测阴性待检标本Ct值35～40之间时，重复检测一次，若重新检测的Ct值仍介于35和40之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告人肠杆菌O157：H7灾光PCK检测阳性；否则建议采用浓缩方式处理核酸样本，再重新进行实时荧光PCR检测，若重新检测的Ct值有明显减少趋势，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告大肠杆菌O157：H7荧光PCR检测阳性；否则判为阴性，报告大肠杆菌O157:H7荧光PCR检测阴性实验室环境污染，试剂污染，样品交叉污染会出现假阳性结果；试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果。当检测样本中被检核酸浓度含量低于最低检测限10°copies/mL时可能会发生假阴性的结果。6
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