中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4274—2015 国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的三重荧光PCR检测方法 Detection of Salmonella, Shigella and Escherichia coli O157:H7 by triplex real-time PCR at frontier ports 发布日期：2015-05-26 实施日期：2016-01-01 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、上海之江生物科技股份有限公司。 本标准主要起草人：樊学军、田绿波、王莹、陈肖潇、石莹、杨雨、倪卫琴、朱旭平、王宁。 1 范围 本标准规定了国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7三重荧光PCR检测的对象、标本的采集、运输和保存、检测程序及结果报告。本标准适用于国境口岸沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌O157:H7的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.17 食品卫生微生物学检验 肉与肉制品检验 GB 4789.18 食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳与乳制品检验 GB/T 4789.19 食品卫生微生物学检验 蛋与蛋制品检验 GB/T 4789.20 食品卫生微生物学检验 糖果、糕点、蜜饯检验 GB/T 4789.21 食品卫生微生物学检验 冷食菜、豆制品检验 GB/T 4789.22 食品卫生微生物学检验 水产食品检验 GB/T 4789.23 食品卫生微生物学检验 冷冻饮品饮料检验 GB/T 4789.24 食品卫生微生物学检验 调味品检验 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 沙门氏菌 (Salmonella) 属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。菌体大小（0.7μm~1.5μm）×（2.0μm～5.0μm），无芽胞，一般无荚膜，除鸡白沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌外，大多有周身鞭毛。包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌，甚至可导致严重脱水以及急性肾功能衰竭而亡。 3.2 志贺氏菌 (Shigella) 属肠杆菌科，革兰氏阴性杆菌。大小为（0.5μm～0.7μm）×（2μm～3μm），无芽胞，无荚膜，无鞭毛。多数有菌毛。是人类细菌性痢疾最为常见的病原菌。志贺氏菌所致菌痢的病情较重，以全身中毒症状和下部大肠化脓性炎症为主要特征，严重者可发生感染性休克和（或）中毒性脑病。 3.3 大肠杆菌 O157:H7 (Escherichia coli O157:H7) 属肠杆菌科埃希氏菌属，革兰氏阴性杆菌。大小（0.4μm～0.7μm）×（1μm～3μm），无芽胞，有普通菌毛与性菌毛。可致人腹泻、出血性结肠炎，5%～10%的病例并发溶血性尿毒综合征 (HUS)及血栓性血小板减少紫癜 (TTP) 等。 3.4 荧光PCR (fluorescence polymerase chain reaction) 又称为实时荧光PCR（real-time PCR），实时荧光PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法。其原理是在常规PCR的基础上，加入一条特异性的荧光探针，该探针为一条寡核苷酸，两边分别标记一个荧光报告基团和一个荧光淬灭基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，利用Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号。每经过一个PCR循环，荧光信号也和目的片段一样，有个同步指数增长的过程，信号的强度与检测对象的核酸含量成正比，可根据数学模型计算出检测对象的含量。 3.5 Ct值 (cycle threshold) 即循环阈值，指每个反应管内所检测到的荧光信号刚好达到设定的阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 PCR：聚合酶链反应 (polymerase chain reaction) DNA：脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid) Taq酶：Taq DNA聚合酶 (Taq DNA polymerase) MGB：小沟结合物，一种荧光淬灭基团 (minor groove binder) 5 检测