SN/T 4278-2015
基本信息
标准号： SN/T 4278-2015
中文名称：国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 医学 媒介 昆虫 DNA 条形码 鉴定 操作规程
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4278-2015.Protocol for DNA barcoding identification techniques of medical insect at frontier ports.
1范围
SN/T 4278规定了医学媒介昆虫DNA条形码鉴定中的标本处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。
SN/T 4278适用于检验检疫机构在国境口岸利用DNA条形码技术对成虫(包括肢体残缺不全的成虫)以及蛹、幼虫和卵等依靠形态无法直接鉴定的医学媒介昆虫的种类鉴定工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T 1876医 学媒介生物标本采集、制作及保存规程
SN/T 2752.4卫生检疫 人员的自我防护规范第4部分:实验室人员
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具,在医学媒介昆虫中,一般是指线粒体COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658 bp的标准片段。
3.2DNA条形码鉴定技术DNA barcoding identification technique
一种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术,建立在基因扩增和序列比对的基础之上,它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。
1范围
SN/T 4278规定了医学媒介昆虫DNA条形码鉴定中的标本处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。
SN/T 4278适用于检验检疫机构在国境口岸利用DNA条形码技术对成虫(包括肢体残缺不全的成虫)以及蛹、幼虫和卵等依靠形态无法直接鉴定的医学媒介昆虫的种类鉴定工作。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件.其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T 1876医 学媒介生物标本采集、制作及保存规程
SN/T 2752.4卫生检疫 人员的自我防护规范第4部分:实验室人员
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1DNA条形码DNA barcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具,在医学媒介昆虫中,一般是指线粒体COI(线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658 bp的标准片段。
3.2DNA条形码鉴定技术DNA barcoding identification technique
一种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术,建立在基因扩增和序列比对的基础之上,它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4278—2015
国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程
Protocolfor DNA barcoding identification techniques of medical insectatfrontierports
2015-05-26发布
耐涂风查真
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4278—2015
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：岳巧云、邱德义、聂维忠、李云松、陈健、刘德星、魏晓雅、吴可量、胡佳1
SN/T4278—2015
DNA条形码技术是近年来发展起来的一种建立在基因扩增和序列比对基础之上新的物种鉴定技术，利用生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段进行物种鉴定。该技术不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制，具有快速、准确、低成本等特点。
2003年，加拿大学者PaulHebert等发现线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因片段能够提供一种快速、简便与可信的分类方法，可以准确地区分物种，并首次提出DNA条码（DNABarcoding）的概念
2010年，由26个国家合作成立了国际生命条码联盟（iBOL），致力于将DNA条形码技术发展成为通用的一种高效、准确的物种鉴定方式，目前全球已经有超过50个国家参加此联盟，目的是构建全球物种分子鉴定平台。BOLD生物条形码数据系统（Barcodingoflifedatasystem）作为国际条形码组织的专用数据库及鉴定平台，对DNA条形码及凭证标本的筛选有着严格的要求，如：必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集（采集人、带GPS定位信息的采集地点的经纬度）等详细信息，要求基因片段必须大于500bp、提供所使用的PCR引物序列、测序图谱、原始序列等追踪档案。目前BOLD系统中已经包含超过20万种生物的DNA条形码序列，而且正以很快的速度增长对于涉及国境口岸卫生安全的医学媒介昆虫鉴定而言，一般利用长度约为658bp的COI基因作为标准的DNA条形码序列，跟BOLD、NCBI系统等数据库进行比对。本标准主要起草人多年来一直从事DNA条形码鉴定工作，实验室近年已原始积累了300多种媒介昆虫的DNA条形码数据5000余条，具有丰富的利用DNA条形码技术进行物种鉴定的经验。本标准根据国际生命条码联盟（iBOL)对DNA条形码的规定，结合国境口岸媒介监测工作的特点而制定，以推动和规范全国各地检验检疫机构利用DNA条形码技术鉴定医学媒介昆虫的实验室操作，从而达到获得准确可靠结果的目的。Ⅱ
1范围
国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程
SN/T4278—2015
本标准规定了医学媒介昆虫DNA条形码鉴定中的标本处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。
本标准适用于检验检疫机构在国境口岸利用DNA条形码技术对成虫（包括肢体残缺不全的成虫）以及蛹、幼虫和卵等依靠形态无法直接鉴定的医学媒介昆虫的种类鉴定工作，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法实验室生物安全通用要求
GB19489
SN/T1876
医学媒介生物标本采集、制作及保存规程卫生检疫人员的自我防护规范
SN/T2752.4
WS/T230免费标准bzxz.net
3术语和定义
本文件。
第4部分：实验室人员
临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用下列术语和定义适用于本文件
DNA条形码
DNA barcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在医学媒介昆虫中，一般是指线粒体COI（线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658bp的标准片段。
DNAbarcodingidentificationtechniqueDNA条形码鉴定技术
-种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.3
凭证标本voucherspecimen
获取DNA条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是形态不完整的标本，但与本标本的DNA条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。对于体型特别小的标本（如螨等），可以是同一批同种标本中的一个个体。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集等详细信息，以便于日后查证。1
SN/T4278—2015
分子凭证molecularvoucher
与凭证标本相对应的基因组DNA、PCR产物、DNA条形码序列及峰图，做克隆还应包括含DNA条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于日后查证。
空白对照blankcontrol
从基因组DNA提取步骤开始至PCR扩增和PCR产物检测整个过程，没有加人任何医学媒介昆虫组织的空白的灭菌洁净1.5mL离心管，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照没有PCR产物条带产生。3.6
positivecontrol
阳性对照
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的.在正常反应情况下，一定能产生PCR产物的DNA为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有PCR产物带产生，3.7
negativecontrol
阴性对照
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ddH,O代替模板DNA而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正常，确认没有受到污染，阴性对照没有PCR产物条带产生。3.8
序列相似度similarityofthesequences反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。3.9
FASTA格式FASTAformat
生物信息学术语，又称Pearson格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用“>”起始，随后可以添加序列名或者注释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或者氨基酸编码符号，如核苷酸使用ATGC表示，序列中不能出现回车等字符。
示例1：
AGGCTCCGGATGCGCTAGCCATTGCAAAATCGGGGCTCCCCCCGATGCTAGTCGATGCTGTAGCTAGGCTCCGGATGCGCTAGCCATTGCAAAATCGGGGCTCCCCCCGATGCTAGTCGATGCTGTAGC4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BOLD：生物条形码数据系统（barcodingof lifedatasystem）NCBI：美国生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）5要求
实验室的生物安全应符合GB19489规定，实验室人员防护应符合SN/T2752.4要求，实验中用水2
应符合GB/T6682要求，PCR扩增检测应符合WS/T230要求。仪器及试剂耗材
仪器设备
SN/T4278—2015
普通台式离心机（最大相对离心力大于14000g）、各量程可调移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、可调式恒温浴、PCR工作站或者超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。做克隆的实验室，还需要配备37℃培养箱和超低温冰箱。6.2
试剂、耗材
分析纯无水乙醇、动物组织基因组DNA提取试剂或试剂盒、DNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNA分子量标准、核酸染料、TAE电泳液，1.5mL离心管、0.2mLPCR管、各量程的移液器吸头、无粉一次性手套。6.3
3引物
LCO14905'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3HCO21985'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3DNA条形码序列的获得
7.1标本的处理
采集的卵、幼虫、蛹或成虫，及时采用冷冻或毒瓶处死后，投人大于75%（体积分数）的乙醇固定标本制作及保存按照SN/T1876执行7.2
基因组DNA的抽提
7.2.1取样
董取成虫一只前足的节，若虫一只前足或者一只卵；螺类、蚊类和蝇类成虫取一只前足或一个蛹、一头幼虫、一只卵；蜱类、蚤类、螨类等个体小的种类可取一头完整的个体7.2.2
DNA抽提
将上述样品置于灭菌的洁净1.5mL离心管中研磨至粉末状或者糜状，按动物组织基因组DNA酚氯仿法（参见附录A)或试剂盒进行基因组DNA的抽提7.3PCR扩增
PCR扩增体系
根据实际情况，可以选择50μL体系或25μL体系。50μL体系各组分的配比见表1。3
SN/T4278—2015
组分名称
缓冲液（10×）
表150μL体系各组分的配比
dNTP(各2.5mmol/L)
正向引物（20μmol/L）
反向引物（20μmol/L）
TaqDNA聚合酶（5U/μL)）
模板（50ng/μL~100ng/μl）
25μL体系各组分用量是50μL体系的一半量。PCR扩增条件
94℃预变性3min；94℃变性30s.52℃退火30s.72℃延伸30s.运行30个循环；72℃延伸10min。
可根据媒介昆虫的种类不同，适当调节退火温度，调节范围一般在50℃～68℃之间。7.4
PCR产物的检测
琼脂糖加1X的TAE缓冲液配成1%的琼脂糖凝胶，加热充分溶解后，降温至50℃左右，按照核酸染料的说明加入适量的核酸染料，混匀。在制胶板上放人制胶槽，插上胶孔小的梳子（如：厚度1.0mm，11齿），倒入适量的琼脂糖凝胶（约15mL，根据胶槽的大小不同，适当调整用量），直到整个制胶槽表面形成均匀胶层。室温静置凝固，垂直轻拔梳子，备用。TAE电泳缓冲液的配制参见附录B。7.4.2点样
将制胶板和胶块放人电泳槽内，带胶孔的一端位于负电极端，加入适量的1XTAE电泳缓冲液至完全浸没胶块。一个胶孔中加入6μL的DNA分子量标准，其他胶孔中分别加入6μL混和上样缓冲液的PCR产物（5μL的PCR产物中加人1μL的6X上样缓冲液）。7.4.3
电泳检测
电压5V/cm，依据胶块的大小，时间在20min～40min之间。将胶块整个移人凝胶成像仪，检查有无目的片段，片段的大小约为710bp左右（参见附录C)。7.5
5PCR产物的纯化
如需要纯化，选用胶孔大的梳子（如：厚度1.5mm，13齿），按照7.4.1～7.4.3重新制胶、点样、电泳，将带目的片段的胶割下，按琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作指导说明书进行PCR产物的纯化。需要时也可委托测序公司进行纯化。
PCR纯化产物的测序
委托专业的测序公司进行测序，按照所选委托公司的要求进行送样。有条件的实验室可进行克隆4
测序。纯化后PCR产物的克隆步骤参见附录D。8序列分析及比对鉴定
1序列的有效性
SN/T4278—2015
通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列（遵照附录E中的E.1执行）且长度大于500bp为有效序列。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段后应能得到一个具有完整开放阅读框的拼接序列，并可翻译成一条完整的蛋白质序列；否则序列仅供参考（遵照附录E中的E.2执行)。
序列比对
与BOLD系统或NCBI的序列进行比对。具体操作遵照附录F和附录G进行。9结果判定
根据序列的相似度判定昆虫的种类，相似度最高且≥99.0%者，可判定为同一种类序列相似度小于99.0%大于98.0%者，结论可做参考，需参考形态学特征进行综合判断。序列相似度≤98.0%者，不能进行种类的判断当BOLD与NCBI给出不同结论时，以BOLD给出的结论为准，NCBI给出的结论供参考。S
SN/T4278—2015
附录A
（资料性附录）
酚氯仿法提取基因组DNA的操作程序A.1将样本研磨加人细胞裂解液（0.1mol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl.0.5%SDS，pH8.0）和蛋白酶K，56℃温育30min。
A.214000g离心2min将上清液加人至一新的离心管中，然后再加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1)，14000g离心5min10min，取上清液至一新的离心管中。A.3加人等体积的饱和酚，颠倒混匀14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管A.4加人等体积的饱和酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)，颠倒混匀，14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管。
加人等体积的饱和酚，颠倒混勾，14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管A.5
加人2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，14000g离心5min，弃上清液。加人500μL的70%（体积分数）乙醇，14000g离心1min，弃上清液，重复该步骤一次室温或者37℃彻底干燥离心管，加人50μL经高压灭菌的ddHO溶解DNA，提取的DNA保存在4℃备用，长期保存需一20℃保存。
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国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程
Protocolfor DNA barcoding identification techniques of medical insectatfrontierports
2015-05-26发布
耐涂风查真
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4278—2015
本标准起草单位：中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检疫局。
本标准主要起草人：岳巧云、邱德义、聂维忠、李云松、陈健、刘德星、魏晓雅、吴可量、胡佳1
SN/T4278—2015
DNA条形码技术是近年来发展起来的一种建立在基因扩增和序列比对基础之上新的物种鉴定技术，利用生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段进行物种鉴定。该技术不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制，具有快速、准确、低成本等特点。
2003年，加拿大学者PaulHebert等发现线粒体细胞色素C氧化酶亚基I(COI)基因片段能够提供一种快速、简便与可信的分类方法，可以准确地区分物种，并首次提出DNA条码（DNABarcoding）的概念
2010年，由26个国家合作成立了国际生命条码联盟（iBOL），致力于将DNA条形码技术发展成为通用的一种高效、准确的物种鉴定方式，目前全球已经有超过50个国家参加此联盟，目的是构建全球物种分子鉴定平台。BOLD生物条形码数据系统（Barcodingoflifedatasystem）作为国际条形码组织的专用数据库及鉴定平台，对DNA条形码及凭证标本的筛选有着严格的要求，如：必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集（采集人、带GPS定位信息的采集地点的经纬度）等详细信息，要求基因片段必须大于500bp、提供所使用的PCR引物序列、测序图谱、原始序列等追踪档案。目前BOLD系统中已经包含超过20万种生物的DNA条形码序列，而且正以很快的速度增长对于涉及国境口岸卫生安全的医学媒介昆虫鉴定而言，一般利用长度约为658bp的COI基因作为标准的DNA条形码序列，跟BOLD、NCBI系统等数据库进行比对。本标准主要起草人多年来一直从事DNA条形码鉴定工作，实验室近年已原始积累了300多种媒介昆虫的DNA条形码数据5000余条，具有丰富的利用DNA条形码技术进行物种鉴定的经验。本标准根据国际生命条码联盟（iBOL)对DNA条形码的规定，结合国境口岸媒介监测工作的特点而制定，以推动和规范全国各地检验检疫机构利用DNA条形码技术鉴定医学媒介昆虫的实验室操作，从而达到获得准确可靠结果的目的。Ⅱ
1范围
国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程
SN/T4278—2015
本标准规定了医学媒介昆虫DNA条形码鉴定中的标本处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。
本标准适用于检验检疫机构在国境口岸利用DNA条形码技术对成虫（包括肢体残缺不全的成虫）以及蛹、幼虫和卵等依靠形态无法直接鉴定的医学媒介昆虫的种类鉴定工作，2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法实验室生物安全通用要求
GB19489
SN/T1876
医学媒介生物标本采集、制作及保存规程卫生检疫人员的自我防护规范
SN/T2752.4
WS/T230免费标准bzxz.net
3术语和定义
本文件。
第4部分：实验室人员
临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用下列术语和定义适用于本文件
DNA条形码
DNA barcode
生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在医学媒介昆虫中，一般是指线粒体COI（线粒体细胞色素C氧化酶亚基I)上的658bp的标准片段。
DNAbarcodingidentificationtechniqueDNA条形码鉴定技术
-种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上，它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。3.3
凭证标本voucherspecimen
获取DNA条形码等分子数据的来源（母体）标本。凭证标本可以是形态不完整的标本，但与本标本的DNA条形码数据等分子凭证必须是一一对应的关系。对于体型特别小的标本（如螨等），可以是同一批同种标本中的一个个体。凭证标本的保存非常重要，必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集等详细信息，以便于日后查证。1
SN/T4278—2015
分子凭证molecularvoucher
与凭证标本相对应的基因组DNA、PCR产物、DNA条形码序列及峰图，做克隆还应包括含DNA条形码片段的阳性转化子。分子凭证的保存非常重要，必须有唯一性的编号、存放等详细信息，以便于日后查证。
空白对照blankcontrol
从基因组DNA提取步骤开始至PCR扩增和PCR产物检测整个过程，没有加人任何医学媒介昆虫组织的空白的灭菌洁净1.5mL离心管，与其他受试的昆虫平行进行操作以观察实验是否处于正常状态。空白对照没有PCR产物条带产生。3.6
positivecontrol
阳性对照
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的.在正常反应情况下，一定能产生PCR产物的DNA为反应模板，用于观察整个反应体系和反应过程是否正常，阳性对照应有PCR产物带产生，3.7
negativecontrol
阴性对照
在PCR扩增过程中，与受试样品平行进行的，用ddH,O代替模板DNA而进行的对照反应，用于观察整个反应体系是否正常，确认没有受到污染，阴性对照没有PCR产物条带产生。3.8
序列相似度similarityofthesequences反映序列间相似程度的数值，一般以百分数表示。3.9
FASTA格式FASTAformat
生物信息学术语，又称Pearson格式，是一种用文本表示核苷酸序列或者氨基酸序列的格式。核苷酸或者氨基酸碱基用单个字母表示，序列的第一行一般用“>”起始，随后可以添加序列名或者注释，第二行为序列本身，只允许使用既定的核苷酸或者氨基酸编码符号，如核苷酸使用ATGC表示，序列中不能出现回车等字符。
示例1：
AGGCTCCGGATGCGCTAGCCATTGCAAAATCGGGGCTCCCCCCGATGCTAGTCGATGCTGTAGCTAGGCTCCGGATGCGCTAGCCATTGCAAAATCGGGGCTCCCCCCGATGCTAGTCGATGCTGTAGC4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BOLD：生物条形码数据系统（barcodingof lifedatasystem）NCBI：美国生物技术信息中心（NationalCenterforBiotechnologyInformation）5要求
实验室的生物安全应符合GB19489规定，实验室人员防护应符合SN/T2752.4要求，实验中用水2
应符合GB/T6682要求，PCR扩增检测应符合WS/T230要求。仪器及试剂耗材
仪器设备
SN/T4278—2015
普通台式离心机（最大相对离心力大于14000g）、各量程可调移液器（10μL、20μL、100μL、200μL、1000μL）、可调式恒温浴、PCR工作站或者超净工作台、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、冰箱。做克隆的实验室，还需要配备37℃培养箱和超低温冰箱。6.2
试剂、耗材
分析纯无水乙醇、动物组织基因组DNA提取试剂或试剂盒、DNA聚合酶、dNTP、琼脂糖、DNA分子量标准、核酸染料、TAE电泳液，1.5mL离心管、0.2mLPCR管、各量程的移液器吸头、无粉一次性手套。6.3
3引物
LCO14905'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3HCO21985'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3DNA条形码序列的获得
7.1标本的处理
采集的卵、幼虫、蛹或成虫，及时采用冷冻或毒瓶处死后，投人大于75%（体积分数）的乙醇固定标本制作及保存按照SN/T1876执行7.2
基因组DNA的抽提
7.2.1取样
董取成虫一只前足的节，若虫一只前足或者一只卵；螺类、蚊类和蝇类成虫取一只前足或一个蛹、一头幼虫、一只卵；蜱类、蚤类、螨类等个体小的种类可取一头完整的个体7.2.2
DNA抽提
将上述样品置于灭菌的洁净1.5mL离心管中研磨至粉末状或者糜状，按动物组织基因组DNA酚氯仿法（参见附录A)或试剂盒进行基因组DNA的抽提7.3PCR扩增
PCR扩增体系
根据实际情况，可以选择50μL体系或25μL体系。50μL体系各组分的配比见表1。3
SN/T4278—2015
组分名称
缓冲液（10×）
表150μL体系各组分的配比
dNTP(各2.5mmol/L)
正向引物（20μmol/L）
反向引物（20μmol/L）
TaqDNA聚合酶（5U/μL)）
模板（50ng/μL~100ng/μl）
25μL体系各组分用量是50μL体系的一半量。PCR扩增条件
94℃预变性3min；94℃变性30s.52℃退火30s.72℃延伸30s.运行30个循环；72℃延伸10min。
可根据媒介昆虫的种类不同，适当调节退火温度，调节范围一般在50℃～68℃之间。7.4
PCR产物的检测
琼脂糖加1X的TAE缓冲液配成1%的琼脂糖凝胶，加热充分溶解后，降温至50℃左右，按照核酸染料的说明加入适量的核酸染料，混匀。在制胶板上放人制胶槽，插上胶孔小的梳子（如：厚度1.0mm，11齿），倒入适量的琼脂糖凝胶（约15mL，根据胶槽的大小不同，适当调整用量），直到整个制胶槽表面形成均匀胶层。室温静置凝固，垂直轻拔梳子，备用。TAE电泳缓冲液的配制参见附录B。7.4.2点样
将制胶板和胶块放人电泳槽内，带胶孔的一端位于负电极端，加入适量的1XTAE电泳缓冲液至完全浸没胶块。一个胶孔中加入6μL的DNA分子量标准，其他胶孔中分别加入6μL混和上样缓冲液的PCR产物（5μL的PCR产物中加人1μL的6X上样缓冲液）。7.4.3
电泳检测
电压5V/cm，依据胶块的大小，时间在20min～40min之间。将胶块整个移人凝胶成像仪，检查有无目的片段，片段的大小约为710bp左右（参见附录C)。7.5
5PCR产物的纯化
如需要纯化，选用胶孔大的梳子（如：厚度1.5mm，13齿），按照7.4.1～7.4.3重新制胶、点样、电泳，将带目的片段的胶割下，按琼脂糖凝胶回收试剂盒的操作指导说明书进行PCR产物的纯化。需要时也可委托测序公司进行纯化。
PCR纯化产物的测序
委托专业的测序公司进行测序，按照所选委托公司的要求进行送样。有条件的实验室可进行克隆4
测序。纯化后PCR产物的克隆步骤参见附录D。8序列分析及比对鉴定
1序列的有效性
SN/T4278—2015
通过查看序列的原始峰图，有效序列段峰高、基部杂峰少且低的序列（遵照附录E中的E.1执行）且长度大于500bp为有效序列。将符合要求的序列进行拼接，去除引物片段后应能得到一个具有完整开放阅读框的拼接序列，并可翻译成一条完整的蛋白质序列；否则序列仅供参考（遵照附录E中的E.2执行)。
序列比对
与BOLD系统或NCBI的序列进行比对。具体操作遵照附录F和附录G进行。9结果判定
根据序列的相似度判定昆虫的种类，相似度最高且≥99.0%者，可判定为同一种类序列相似度小于99.0%大于98.0%者，结论可做参考，需参考形态学特征进行综合判断。序列相似度≤98.0%者，不能进行种类的判断当BOLD与NCBI给出不同结论时，以BOLD给出的结论为准，NCBI给出的结论供参考。S
SN/T4278—2015
附录A
（资料性附录）
酚氯仿法提取基因组DNA的操作程序A.1将样本研磨加人细胞裂解液（0.1mol/LEDTA，10mmol/LTris-HCl.0.5%SDS，pH8.0）和蛋白酶K，56℃温育30min。
A.214000g离心2min将上清液加人至一新的离心管中，然后再加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1)，14000g离心5min10min，取上清液至一新的离心管中。A.3加人等体积的饱和酚，颠倒混匀14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管A.4加人等体积的饱和酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1)，颠倒混匀，14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管。
加人等体积的饱和酚，颠倒混勾，14000g离心5min，转移上清液至一新的离心管A.5
加人2倍体积的无水乙醇，颠倒混匀，14000g离心5min，弃上清液。加人500μL的70%（体积分数）乙醇，14000g离心1min，弃上清液，重复该步骤一次室温或者37℃彻底干燥离心管，加人50μL经高压灭菌的ddHO溶解DNA，提取的DNA保存在4℃备用，长期保存需一20℃保存。
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