SN/T 4278—2015 国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程 Protocol for DNA barcoding identification techniques of medical insect at frontier ports 发布日期：2015-05-26 实施日期：2016-01-01 发布单位：国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国河北出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：岳巧云、邱德义、聂维忠、李云松、陈健、刘德星、魏晓雅、吴可量、胡佳。 引言 DNA条形码技术是近年来发展起来的一种建立在基因扩增和序列比对基础之上的新物种鉴定技术，利用生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段进行物种鉴定。该技术不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制，具有快速、准确、低成本等特点。 2003年，加拿大学者 Paul Hebert 等发现线粒体细胞色素C氧化酶亚基I (COI) 基因片段能够提供一种快速、简便与可信的分类方法，可以准确地区分物种，并首次提出DNA条码 (DNA barcoding) 的概念。 2010年，由26个国家合作成立了国际生命条码联盟 (iBOL)，致力于将DNA条形码技术发展成为通用的一种高效、准确的物种鉴定方式，目前全球已经有超过50个国家参加此联盟，目的是构建全球物种分子鉴定平台。BOLD生物条形码数据系统 (Barcoding of life data system) 作为国际条形码组织的专用数据库及鉴定平台，对DNA条形码及凭证标本的筛选有着严格的要求，如：必须有唯一性标本编号、存放、鉴定以及采集（采集人、带GPS定位信息的采集地点的经纬度）等详细信息，要求基因片段必须大于500bp、提供所使用的PCR引物序列、测序图谱、原始序列等追踪档案。目前BOLD系统中已经包含超过20万种生物的DNA条形码序列，而且正以很快的速度增长。 对于涉及国境口岸卫生安全的医学媒介昆虫鉴定而言，一般利用长度约为658bp的COI基因作为标准的DNA条形码序列，跟BOLD、NCBI系统等数据库进行比对。本标准主要起草人多年来一直从事DNA条形码鉴定工作，实验室近年已原始积累了300多种媒介昆虫的DNA条形码数据5000余条，具有丰富的利用DNA条形码技术进行物种鉴定的经验。本标准根据国际生命条码联盟 (iBOL) 对DNA条形码的规定，结合国境口岸媒介监测工作的特点而制定，以推动和规范全国各地检验检疫机构利用DNA条形码技术鉴定医学媒介昆虫的实验室操作，从而达到获得准确可靠结果的目的。 1 范围 本标准规定了医学媒介昆虫DNA条形码鉴定中的标本处理、基因扩增、序列分析、比对鉴定及结果判定等操作程序和规范。 本标准适用于检验检疫机构在国境口岸利用DNA条形码技术对成虫（包括肢体残缺不全的成虫）以及蛹、幼虫和卵等依靠形态无法直接鉴定的医学媒介昆虫的种类鉴定工作。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1876 医学媒介生物标本采集、制作及保存规程 SN/T 2752.4 卫生检疫人员的自我防护规范 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应 (PCR) 技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 DNA条形码 (DNA barcode) 生物体内能够代表该物种的、标准的、有足够变异的、易扩增且相对较短的DNA片段。DNA条形码已经成为物种鉴定的重要工具，在医学媒介昆虫中，一般是指线粒体COI (线粒体细胞色素C氧化酶亚基I) 上的658bp的标准片段。 3.2 DNA条形码鉴定技术 (DNA barcoding identification technique) 一种利用DNA条形码基因片段进行生物物种鉴定和系统进化关系研究的技术，建立在基因扩增和序列比对的基础之上。它具有不受物种发育状态、雌雄性个体及形态特征完整性与否的限制、减少对分类专家的依赖、不受主观因素影响、准确率高、借助互联网可以实现数据共享等特点。 3.3 凭证标本 (voucher specimen)