SN/T 4283.2-2015
基本信息
标准号： SN/T 4283.2-2015
中文名称：国境口岸微孔板基因芯片检测方法第2部分:结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 微孔 基因芯片 检测 方法 结核 分枝杆菌 耐药 变异 基因
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4283.2-2015.Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 2: Mycobacterium tuberculosis and drug resistant mutations of katG and rpoB genes.
1范围
SN/T 4283.2规定了国境口岸结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因的微孔板基因芯片检测方法。
SN/T 4283.2适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对结核分枝杆菌及katG和rpoB两个耐药变异基因进行检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 1262国境口岸结核病 检验规程
SN/T 2752.4- -2011 卫生检疫人员的自我防护规范 第4部分:实验室人员
SN/T 3312结核分枝杆菌 r-干扰素体外检测方法
SN/T 4283.1国境口岸 微孔板芯片检测方法第1部分:通用技术规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
SN/T 4283.1和SN/T 1262、SN/T 3312界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1耐药变异基因drug resistant mutations
由于发生碱基的插人、缺失、置换等而导致耐药产生的基因。耐药基因变异是结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制。
3.2katG基因katG gene
过氧化氢酶过氧化物酶(catalase-peoxidase)的编码基因。
1范围
SN/T 4283.2规定了国境口岸结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因的微孔板基因芯片检测方法。
SN/T 4283.2适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对结核分枝杆菌及katG和rpoB两个耐药变异基因进行检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 1262国境口岸结核病 检验规程
SN/T 2752.4- -2011 卫生检疫人员的自我防护规范 第4部分:实验室人员
SN/T 3312结核分枝杆菌 r-干扰素体外检测方法
SN/T 4283.1国境口岸 微孔板芯片检测方法第1部分:通用技术规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
SN/T 4283.1和SN/T 1262、SN/T 3312界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1耐药变异基因drug resistant mutations
由于发生碱基的插人、缺失、置换等而导致耐药产生的基因。耐药基因变异是结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制。
3.2katG基因katG gene
过氧化氢酶过氧化物酶(catalase-peoxidase)的编码基因。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4283.2—2015
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第2部分：结核分枝杆菌及katG
和rpoB耐药变异基因
Test method of microplategene chip atfrontierport-Part 2:Mycobacterium tuberculosis and drug resistantmutationsofkatGand rpoBgenes2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂层查真代
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第2部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4283.2—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、深圳市南山区慢性病防治院、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：刘春晓、杨燕秋、张涛、张树平、刘君、顾大勇、史蕾、赵纯中、何建安、徐云庆、李永进。
1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第2部分：结核分枝杆菌及katG
和rpoB耐药变异基因
SN/T4283.2—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因的微孔板基因芯片检测方法。
本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对结核分枝杆菌及katG和rpoB两个耐药变异基因进行检测
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1262国境口岸结核病检验规程SN/T2752.4—2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员
SN/T3312结核分枝杆菌-干扰素体外检测方法SN/T4283.1国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程WS233
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
SN/T4283.1和SN/T1262、SN/T3312界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
drugresistantmutations
耐药变异基因
由于发生碱基的插人、缺失、置换等而导致耐药产生的基因。耐药基因变异是结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制。
katG基因katGgene
过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peoxidase）的编码基因。3.3
rpoB基因
rpoBgene
结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase，DPRP）β亚单位的编码基因。
4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。1
SN/T4283.2—2015
KatG：过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peroxidase）rpoB：RNA聚合酶β亚单位（RNApolymerasebeta-subunit）MTB：结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis）WT：野生型（wildtype）
5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求2实验人员的防护遵循SN/T2752.4—2011的要求。5.2
6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等6.2主要试剂：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测试剂盒或自行设置结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A)。7检测流程
7.1样品核酸的提取
7.1.1痰液等标品DNA的提取如下：吸取痰液于酪样或脓性黏液部分（或胸水、肺泡灌洗液、浑浊的脑脊液离心后取沉淀物）2mL于无菌尖底离心管内，加人等量临用前新鲜配制的消化液（4%NaOH50mL+2.94%柠檬酸钠50ml+N-乙酰-L，使之充
15s~20s，室温静置15min，
3000g离心15min，弃去上清液。半胱氨酸
g，充分溶解混匀），置涡旋混均器上混匀0.3
分液化至清亮
加人无菌PH
6.8PBS缓冲液至20mL，混勾，
沉淀中提取样品
DNA，可参照SN/T4283.1。
7.1.2培养的菌落样品DNA可直接提取，参照SN/T4283
7.2PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置PCRR反应体系，或自行配置25uLPCR反应体系：10XPCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（含PCR阳性对照）（各5μmol/L)混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA),ddHzO11.25μL；振荡混勾，并轻微离心。7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存备用；若需长期使用请置于一20℃保存。
7.3微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100uL加人微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。2
SN/T4283.2—2015
7.3.3取样品PCR产物10uL于PCR仪中95C加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。
7.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加人芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中45℃，振荡反应1h。7.4微孔板基因芯片显色反应
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加入洗涤液200L，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。7.4.2于各反应孔中加入100pL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩于反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHzO冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥。注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放人生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择结核分枝杆菌及katG和异基因芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B)，对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果。8结果报告
检测结果报告可分为以下几种模式如未检出MTB，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB阴性”。如检出MTB，且全部的突变位点检测结果均为阴性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB（katG315野生型；rpoB511/513野生型；rpoB516野生型；rpoB522野生型：rpoB526野生型；rpoB531野生型）”。
如检出MTB，且katG相关的突变位点检测结果为阴性，而rpoB相关的某个或多个突变位点检测结果为阳性，则报告为微孔板基因芯片检测方法：MTB[katG315野生型；rpoBXXX突变（***→###）；或/和rpoB×××突变（***→###）”如检出MTB，且rpoB相关的突变位点检测结果为阴性，而katG相关的某个或多个突变位点检测结果为阳性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB[katG315突变（***→###）；或/和katG315突变（***→###）；rpoB511/513野生型：rpoB516野生型；rpoB522野生型；rpoB526野生型；rpoB531野生型”。如检出MTB，且katG和rpoB相关的某个或多个突变位点检测结果为阳性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB[katG315突变（***-→###）；或/和katG315突变（***→###）；rpoB×××野生型；或/和rpoBX××野生型rpoB×××突变（***→###）；或/和rpoB×××突变（***→###）]。注：本章出现的rpoB×××突变（***→###）中的×××指代氮基酸位置，如511,513或516等；***→###指代碱基的突变情况，如CAC→GAC或TCG-→TTG等。3
SN/T4283.2—2015
阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊9.1
确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告。A.1
附录A
（资料性附录）
SN/T4283.2—2015此内容来自标准下载网
结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的引物及探针结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的引物如表A.1所示结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的引物表A.1
引物名称
PCR阳性对照
(16SrRNA)
引物序列
F:TGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCR:GCTCTCCGTCAGCTCCCACTCGTAGCCF:CGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTR:GACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT
F:CCGCAAAGTGTGGCTAACCC
R:GAGCGTAGGCGTCGGTGACA
F:AAAACTCAAATGAATTGACGG
R:GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGT注1：F表示上游引物，R表示下游引物注2：引物5'端生物素修饰。
结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的探针如表A.2所示。表A.2
IS6110
结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的探针氨基酸
氨基酸替
代类型
Ser(WT)
Ser-+Thrl
Ser+Thr2
Leu(WT)
Gln(WT)
Asp(WT)
AspVal
Ser(WT)
His(WT)
His-→+Tyr
His+Asp
Ser(WT)
Ser-+Leu
碱基替代
AGC→ACC
AGCACA
GAC→GTC
CAC-→TAC
CACGAC
TCG→TTG
探针序列
GCGATCACCAGCGGCATCGA
GCGATCACCACCGGCATCGA
CGATCACCACAGGCATCGAG
GCCAGCTGAGCCAATTCATG
CAATTCATGGACCAGAACAAC
CAATTCATGGTCCAGAACAAC
ACCCGCTGTCGGGGTTGACC
GGGTTGACCCACAAGCGCCG
GGGTTGACCTACAAGCGCCG
GGGTTGACCGACAAGCGCCG
CGCCGACTGTCGGCGCTGGG
GCCGACTGTTGGCGCTGGG
CACCTATGTGTCGACCTGGGCAG
SN/T4283.2—2015
PCR阳性对照
杂交阳性对照
阴性对照
氨基酸
氨基酸替
代类型
注1：探针5端20个poly(T)的修饰。表A.2（续）
碱基替代
探针序列
GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG
ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCGTCCTCCAATTTGTCCGGTTATCGCT
注2：杂交阳性探针的配对杂交片段为5'端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT，6
附录B
（资料性附录）
SN/T4283.2—2015
结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测探针设置模式结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测探针设置模式如图B.1所示注：A1.A5，E1,E5：杂交阳性对照探针点：B1C1，C2,C4，D1，E3：阴性对照探针点；C3；PCR阳性对照探针点；A2：MTB；B2：WT，katG315野生型；D2：T1，表示katG315突变型（AGC→ACC)：E2：T2，表示katG315突变型（AGC→ACA）；A3：WT1，表示rpoB511/513野生型；A4：WT2，表示rpoB516野生型：B3：WT3，表示rpoB522野生型；B4：WT4，表示rpoB526野生型；B5：WT5，表示rpoB531野生型；D3：Mut1，表示rpoB516突变型（GAC→GTC)；D4：Mut2A，表示rpoB526突变型（CAC→TAC）：E4：Mut2B，表示rpoB526突变型（CAC-→GAC);D5：Mut3，表示rpoB531突变型（TCG→TTG）。图B.1结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测探针设置模式图
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国境口岸微孔板基因芯片检测方法第2部分：结核分枝杆菌及katG
和rpoB耐药变异基因
Test method of microplategene chip atfrontierport-Part 2:Mycobacterium tuberculosis and drug resistantmutationsofkatGand rpoBgenes2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂层查真代
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第2部分。
本部分按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。SN/T4283.2—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、深圳市南山区慢性病防治院、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：刘春晓、杨燕秋、张涛、张树平、刘君、顾大勇、史蕾、赵纯中、何建安、徐云庆、李永进。
1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第2部分：结核分枝杆菌及katG
和rpoB耐药变异基因
SN/T4283.2—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因的微孔板基因芯片检测方法。
本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对结核分枝杆菌及katG和rpoB两个耐药变异基因进行检测
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1262国境口岸结核病检验规程SN/T2752.4—2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员
SN/T3312结核分枝杆菌-干扰素体外检测方法SN/T4283.1国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程WS233
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
SN/T4283.1和SN/T1262、SN/T3312界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
drugresistantmutations
耐药变异基因
由于发生碱基的插人、缺失、置换等而导致耐药产生的基因。耐药基因变异是结核分枝杆菌产生耐药性的主要机制。
katG基因katGgene
过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peoxidase）的编码基因。3.3
rpoB基因
rpoBgene
结核杆菌DNA依赖RNA聚合酶（DNA-dependentRNApolymerase，DPRP）β亚单位的编码基因。
4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。1
SN/T4283.2—2015
KatG：过氧化氢酶-过氧化物酶（catalase-peroxidase）rpoB：RNA聚合酶β亚单位（RNApolymerasebeta-subunit）MTB：结核分枝杆菌（mycobacteriumtuberculosis）WT：野生型（wildtype）
5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求2实验人员的防护遵循SN/T2752.4—2011的要求。5.2
6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等6.2主要试剂：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测试剂盒或自行设置结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A)。7检测流程
7.1样品核酸的提取
7.1.1痰液等标品DNA的提取如下：吸取痰液于酪样或脓性黏液部分（或胸水、肺泡灌洗液、浑浊的脑脊液离心后取沉淀物）2mL于无菌尖底离心管内，加人等量临用前新鲜配制的消化液（4%NaOH50mL+2.94%柠檬酸钠50ml+N-乙酰-L，使之充
15s~20s，室温静置15min，
3000g离心15min，弃去上清液。半胱氨酸
g，充分溶解混匀），置涡旋混均器上混匀0.3
分液化至清亮
加人无菌PH
6.8PBS缓冲液至20mL，混勾，
沉淀中提取样品
DNA，可参照SN/T4283.1。
7.1.2培养的菌落样品DNA可直接提取，参照SN/T4283
7.2PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置PCRR反应体系，或自行配置25uLPCR反应体系：10XPCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（含PCR阳性对照）（各5μmol/L)混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA),ddHzO11.25μL；振荡混勾，并轻微离心。7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先95℃变性5min；然后95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存备用；若需长期使用请置于一20℃保存。
7.3微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100uL加人微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。2
SN/T4283.2—2015
7.3.3取样品PCR产物10uL于PCR仪中95C加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。
7.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加人芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中45℃，振荡反应1h。7.4微孔板基因芯片显色反应
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加入洗涤液200L，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。7.4.2于各反应孔中加入100pL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩于反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHzO冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥。注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放人生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择结核分枝杆菌及katG和异基因芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B)，对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果。8结果报告
检测结果报告可分为以下几种模式如未检出MTB，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB阴性”。如检出MTB，且全部的突变位点检测结果均为阴性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB（katG315野生型；rpoB511/513野生型；rpoB516野生型；rpoB522野生型：rpoB526野生型；rpoB531野生型）”。
如检出MTB，且katG相关的突变位点检测结果为阴性，而rpoB相关的某个或多个突变位点检测结果为阳性，则报告为微孔板基因芯片检测方法：MTB[katG315野生型；rpoBXXX突变（***→###）；或/和rpoB×××突变（***→###）”如检出MTB，且rpoB相关的突变位点检测结果为阴性，而katG相关的某个或多个突变位点检测结果为阳性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB[katG315突变（***→###）；或/和katG315突变（***→###）；rpoB511/513野生型：rpoB516野生型；rpoB522野生型；rpoB526野生型；rpoB531野生型”。如检出MTB，且katG和rpoB相关的某个或多个突变位点检测结果为阳性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：MTB[katG315突变（***-→###）；或/和katG315突变（***→###）；rpoB×××野生型；或/和rpoBX××野生型rpoB×××突变（***→###）；或/和rpoB×××突变（***→###）]。注：本章出现的rpoB×××突变（***→###）中的×××指代氮基酸位置，如511,513或516等；***→###指代碱基的突变情况，如CAC→GAC或TCG-→TTG等。3
SN/T4283.2—2015
阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊9.1
确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告。A.1
附录A
（资料性附录）
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结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的引物及探针结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的引物如表A.1所示结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的引物表A.1
引物名称
PCR阳性对照
(16SrRNA)
引物序列
F:TGGAAGAGCTCGTATGGCACCGGAACCR:GCTCTCCGTCAGCTCCCACTCGTAGCCF:CGTGGAGGCGATCACACCGCAGACGTR:GACCTCCAGCCCGGCACGCTCACGT
F:CCGCAAAGTGTGGCTAACCC
R:GAGCGTAGGCGTCGGTGACA
F:AAAACTCAAATGAATTGACGG
R:GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGT注1：F表示上游引物，R表示下游引物注2：引物5'端生物素修饰。
结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的探针如表A.2所示。表A.2
IS6110
结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测相关的探针氨基酸
氨基酸替
代类型
Ser(WT)
Ser-+Thrl
Ser+Thr2
Leu(WT)
Gln(WT)
Asp(WT)
AspVal
Ser(WT)
His(WT)
His-→+Tyr
His+Asp
Ser(WT)
Ser-+Leu
碱基替代
AGC→ACC
AGCACA
GAC→GTC
CAC-→TAC
CACGAC
TCG→TTG
探针序列
GCGATCACCAGCGGCATCGA
GCGATCACCACCGGCATCGA
CGATCACCACAGGCATCGAG
GCCAGCTGAGCCAATTCATG
CAATTCATGGACCAGAACAAC
CAATTCATGGTCCAGAACAAC
ACCCGCTGTCGGGGTTGACC
GGGTTGACCCACAAGCGCCG
GGGTTGACCTACAAGCGCCG
GGGTTGACCGACAAGCGCCG
CGCCGACTGTCGGCGCTGGG
GCCGACTGTTGGCGCTGGG
CACCTATGTGTCGACCTGGGCAG
SN/T4283.2—2015
PCR阳性对照
杂交阳性对照
阴性对照
氨基酸
氨基酸替
代类型
注1：探针5端20个poly(T)的修饰。表A.2（续）
碱基替代
探针序列
GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG
ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCGTCCTCCAATTTGTCCGGTTATCGCT
注2：杂交阳性探针的配对杂交片段为5'端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT，6
附录B
（资料性附录）
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结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测探针设置模式结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测探针设置模式如图B.1所示注：A1.A5，E1,E5：杂交阳性对照探针点：B1C1，C2,C4，D1，E3：阴性对照探针点；C3；PCR阳性对照探针点；A2：MTB；B2：WT，katG315野生型；D2：T1，表示katG315突变型（AGC→ACC)：E2：T2，表示katG315突变型（AGC→ACA）；A3：WT1，表示rpoB511/513野生型；A4：WT2，表示rpoB516野生型：B3：WT3，表示rpoB522野生型；B4：WT4，表示rpoB526野生型；B5：WT5，表示rpoB531野生型；D3：Mut1，表示rpoB516突变型（GAC→GTC)；D4：Mut2A，表示rpoB526突变型（CAC→TAC）：E4：Mut2B，表示rpoB526突变型（CAC-→GAC);D5：Mut3，表示rpoB531突变型（TCG→TTG）。图B.1结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因微孔板芯片检测探针设置模式图
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