SN/T 4283.1-2015
基本信息
标准号： SN/T 4283.1-2015
中文名称：国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分:通用技术规程
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 微孔 基因芯片 检测 方法 通用 技术规程
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4283.1-2015.Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 1:General technical procedure.
1范围
SN/T 4283.1规定了微孔板基因芯片检测方法的通用技术规程,包括微孔板基因芯片的制备、检测流程、结果报告及阳性结果的处置等部分
SN/T 4283.1适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术进行检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。.
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2752.4-2011卫生检疫 人员的自我防护规范第 4部分:实验室人员
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术 语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1微孔板基因芯片 microplate gene chip
与传统的基于玻片或膜的平面式基因芯片不同，其将基因探针按预设模式固定在微孔内，每孔即为一张芯片。本部分涉及的微孔板基因芯片技术具有如下特点:(a)芯片的载体为高分子材质的微孔板，类似于8X12的ELISA反应板,每孔即为一张芯片。可以整板使用有最多96个反应孔，也可以根据实际需要拆装所需的反应孔数,具有微量高通量的特点。b)芯片反应孔面无需有机薄膜涂层修饰或化学生物等的修饰,可直接将基因探针点样到孔面上，在紫外作用下通过氢键结合,使包被的探针不易脱落,具有芯片制备操作简单方便的特点。(c)芯片检测采用化学显色反应的检测方式,其检测原理为生物素化的PCR产物与芯片杂交,经由链霉亲和素碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视也可借助芯片扫描仪进行定量分析,具有快速简便可视的特点。
1范围
SN/T 4283.1规定了微孔板基因芯片检测方法的通用技术规程,包括微孔板基因芯片的制备、检测流程、结果报告及阳性结果的处置等部分
SN/T 4283.1适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术进行检测
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。.
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 2752.4-2011卫生检疫 人员的自我防护规范第 4部分:实验室人员
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术 语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1微孔板基因芯片 microplate gene chip
与传统的基于玻片或膜的平面式基因芯片不同，其将基因探针按预设模式固定在微孔内，每孔即为一张芯片。本部分涉及的微孔板基因芯片技术具有如下特点:(a)芯片的载体为高分子材质的微孔板，类似于8X12的ELISA反应板,每孔即为一张芯片。可以整板使用有最多96个反应孔，也可以根据实际需要拆装所需的反应孔数,具有微量高通量的特点。b)芯片反应孔面无需有机薄膜涂层修饰或化学生物等的修饰,可直接将基因探针点样到孔面上，在紫外作用下通过氢键结合,使包被的探针不易脱落,具有芯片制备操作简单方便的特点。(c)芯片检测采用化学显色反应的检测方式,其检测原理为生物素化的PCR产物与芯片杂交,经由链霉亲和素碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视也可借助芯片扫描仪进行定量分析,具有快速简便可视的特点。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4283.1-2015
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程
Test method of microplate gene chip at frontier port-Part1:Generaltechnicalprocedure2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂屏查真伏
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；—第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；-第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第1部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4283.1—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国河南出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、清华大学深圳研究生院、深圳市南山区慢性病防治院、珠海精标仪器有限公司、深圳图普科技有限公司。本部分主要起草人：顾大勇、辛本强、董瑞玲、廖凌、樊学军、高国龙、刘芳、赵芳、刘春晓、杨燕秋、张树平、史蕾、赵纯中、何建安、刘君、徐媛、林勤丰、徐云庆、张勤、黄恩炯、马岚、张涛、李永进、倪秀1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程
SN/T4283.1—2015
SN/T4283的本部分规定了微孔板基因芯片检测方法的通用技术规程，包括微孔板基因芯片的制备、检测流程、结果报告及阳性结果的处置等部分本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术进行检测2规范性引用文件
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
microplategenechip
微孔板基因芯片
与传统的基于玻片或膜的平面式基因芯片不同，其将基因探针按预设模式固定在微孔内，每孔即为一张芯片。本部分涉及的微孔板基因芯片技术具有如下特点：（a）芯片的载体为高分子材质的微孔板，类似于8×12的ELISA反应板，每孔即为以整板使用有最多
96个反应孔，也可以根据实
片。可以
际需要拆装所需的反应孔数，具有微量、高通量的特点(b）芯片反应孔面无需有机薄膜涂层修饰或化学生物等的修饰，可直接将基因探针点样到孔面上，在紫外作用下通过氢键结合，使包被的探针不易脱。（c)芯片检测采用化学显色反应的检测方式，其检测原理为生落，具有芯片制备操作简单方便的特点。物素化的PCR产物与芯片杂交，经由链霉亲和素-碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视也可借助芯片扫描仪进行定量分析，具有快速简便可视的特点。3.2
特异性探针specificprobe
能与样品中的特异性目标核酸杂交，实现检测目的的一段寡核苷酸分子片段3.3
positivecontrolprobe
阳性对照探针
能与预设的特定目标核酸杂交，但与检测目标核酸无交叉杂交反应的一段寡核苷酸分子片段，可以用于实现对全部或部分检测流程进行质量控制。本部分涉及PCR阳性对照探针和杂交阳性对照探针。3.4
阴性对照探针
negativecontrolprobe
即空白对照探针，可以是一段人工设计合成的没有配对杂交对象的或是与本试验无关的寡核苷酸1
SN/T4283.1—2015
片段，甚至也可以是不含任何特意添加的核酸片段，主要用于监控基因芯片的杂交背景。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RT-PCR逆转录PCR(reversetranscription-polymerasechainreaction）SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfonate）UV：紫外线（ultraviolet）
5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4—2011的要求。6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、UV交联仪、PCR仪、生物定全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。6.2主要试剂：微孔板基因芯片检测试剂盒或微孔板（聚苯乙烯材质）、引物（5'端生物素修饰）、探针[5端20个poly(T)修饰J、1×TE缓冲液（pH8.0)（参见附录A中A.1)、探针缓冲液（参见A.2）、漂洗缓冲液（参见A.3）、核酸提取试剂、PCR和RT-PCR反应试剂、杂交反应液（参见A.4）、洗涤液（参见A.5）、显色检测液（参见A.6）、显色液（参见A.7)。7微孔板基因芯片的制备
7.1如有合适的微孔板基因芯片检测试剂盒或适用的已固化好探针的微孔板基因芯片，则可以直接进人检测流程，即第8章
2如没有合适的微孔板基因芯片检测试剂盒或适用的已固化好探针的微孔板基因芯片，需自行固化7.2
探针制备微孔板基因芯片，则按以下步骤进行：a）取整板的空白微孔板或者是按试验要求拆装所需的反应孔板，去离子水逐个清洗微孔，再用ddH，O反复冲洗5次后，干燥备用、b）分别用1×TE缓冲液（pH8.0)溶解合成的各特异性探针以及PCR阳性对照探针、杂交阳性对照探针、阴性对照探针至100μmol/L，然后分别取探针溶液250μL，100μmol/L探针缓冲液75μL，ddH2O175μL，混合均匀成500μL的15μmol/L探针点样溶液待用。使用基因芯片点样仪，按设备操作说明书进行，分别将特异性探针、阳性对照探针、显色阳性对c)
照探针、阴性对照探针按预先设置的位点模式点在微孔板微孔中相应的位置。探针固定位点设置模式可参考B.1。
点好探针的微孔板芯片置于紫外交联仪中设置UV-A，照射0.8J，共价交联固定探针。d)
UV交联后用漂洗缓冲液漂洗2次，ddHO冲洗2次，晾干；可立即使用，也可密闭包装，4℃保存待用。
8微孔板基因芯片检测流程
8.1样品核酸的提取
SN/T4283.1—2015
8.1.1可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸的提取，或者可根据样品的不同选择采用相应的商品化的核酸提取试剂盒提取样品DNA，对样品的要求和需量参照试剂盒说明书进行，如可采用TaKaRaDNAisoReagent\试剂盒从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞中提取基因组DNA；TaKaRaBloodGenomeDNAExtractionKit试剂盒从全血中提取DNA；TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit试剂盒从体液中（如：血浆、血清、腹水、细胞培养上清、脑脊髓液、尿液等）中快速纯化DNA；TaKaRaDNAIsolationReagentforMeatandMeatProducts试剂盒从生肉及其加工品、乳制品中提取DNA；TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段；TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKit试剂盒从PCR反应液或其他各种酶促反应液中纯化DNA片段；TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKit试剂盒从质粒中提取纯化质列DNA；TaKaRaDEXPATEasy试剂盒从福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中提取PCR扩增用DNA模板；等等。
8.1.2可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸的提取，或者可根据样品的不同选择采用相应的商品化的核酸提取试剂盒提取样品RNA，对样品的要求和需量参照试剂盒说明书进行，如可采用TaKaRaRNAisoPlus\试剂盒从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA；TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit试剂盒从体液（如：血浆、血清、腹水、细胞培养上清、脑脊髓液、尿液等)中快速纯化病毒RNA；等等。8.2PCR扩增反应
8.2.1待检样品核酸为DNA：可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸（包括阳性对照）的PCR扩增；或者可按照TaKaRaPCR试剂盒\配置25μLPCR反应体系和反应条件：10XPCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L)2μL，MgCl（25mmol/L）2μL，上下游引物（各5μmol/L）混合液2μL,TaqDNA聚合酶0.25μL,模板核酸5μL（或/和含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA），ddH，O11.25uL；PCR反应条件，首先94℃变性5min；然后94℃变性50s，55℃～56℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR的反应体系和反应条件应依据不同检测目标的具体设计要求而对应。8.2.2待检样品核酸为RNA：可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸（包括阳性对照）的RT-PCR扩增；或者可按照TaKaRaOneStepRT-PCRKit试剂盒\配置25μLRT-PCR反应体系和反应条件：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgCl（25mmol/L）2μL，上下游引物（各5μmol/L)混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL（或/和含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddH,O11μL。PCR反应条件，首先42℃反转录40min，然后94℃变性5min；再94℃变性50s55℃~56℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR的反应体系和反应条件应依据不同检测目标的具体设计要求而对应。
8.3微孔板基因芯片杂交反应
8.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至45℃～50℃（依据不同检测的实验要求）。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/T4283.1-2015
8.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100L加入微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。8.3.3如同一样品有多个PCR反应，则每个PCR产物取5uL，混合；如为单一PCR反应，则取该PCR产物1OuL。将PCR产物于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4C后取出并立即置于冰上备用。免费标准bzxz.net
8.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加入芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中45℃～50℃（依据不同检测的实验要求），振荡反应1h。8.4微孔板基因芯片显色反应
8.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加人洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。8.4.2于各反应孔中加入100uL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。8.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHz0冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施8.4的步骤和流程。8.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放人生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择与检测芯片类型相对应的程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B中B.1），对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果（参见B.2）。9结果报告
检测结果可报告为“微孔板基因芯片检测方法：×××，×性；×××，×××（如有，列出全部阴性检测目标）为阴性”。10
阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊。10.2确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告（如有，列出全部阳性检测目标）为阳附录A
（资料性附录）
主要试剂
SN/T.4283.1—2015
A.11XTE缓冲液(pH8.0):1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,超纯水定容至100mL，高压灭菌。A.2探针缓冲液：175.3gNaCl,88.2g柠檬酸钠，溶于1000mLDEPC（焦碳酸二乙酯）水中，HCI调节pH至7.0，高压灭菌。
A.3漂洗缓冲液：800mL超纯水中溶解0.27gKH,PO,1.42gNazHPO..8gNaCl.0.2gKCl，然后加人浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1000mL.高温高压灭菌后室温保存。使用时按体积比加人0.05%Tween-20。
A.4杂交反应液：1000mL蒸馏水溶液中包括250mL探针缓冲液，9.89%葡聚糖硫酸钠，1%BSA，0.1%SDS.10μL100μmol/L5'端生物素修饰的与杂交对照探针的配对杂交的核酸片段。A.5洗涤液：1000mL蒸馏水溶液中包括100ml探针缓冲液0.1%SDS。A.6显色检测液：使用前新鲜配制.漂洗缓冲液加1%BSA，0.1%标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素溶液（1mg/mL,Sigma-Aidrich）\)A.7显色液：0.1mol/LTris-HCl.0.15mol/LNaCl.1mmol/LMgCl2，调节pH至9.5。使用时新鲜配制，取5mL加入33μLNBT，16.5μLBCIP（Promega）)S
1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/T4283.1—2015
附录B
（资料性附录）
芯片探针设置模式及检测结果图解B.1微孔板基因芯片的探针固定位点设置模式参考B.1.1在芯片探针固定位点设计时应包含需求的检测目标探针，并应包含有PCR阳性对照探针、杂交阳性对照探针、阴性对照探针至少各1个。所有的探针位点均可以不限于各1个，可按需求重复设置在多个位点。如图B.1中，杂交阳性对照探针点设置有4个，阴性对照探针点设置有2个，PCR阳性对照探针点设置有1个，其余的18个位点都设置为检测探针点。B.1.2应尽可能设计探针固定位点模式为平行的规律分布模式如可以设置为2×2，2×3.2×4等，或者是3×3，3×4，3×5等，又或者是4×4，4×5，4×6等。平行分部位点中不建议设置有空缺位点。如图B.1设置为5×5分布模式。
B.1.3建议可以设置多个PCR阳性对照探针点和杂交阳性对照探针点，特别是在多个位点规律设置杂交阳性对照探针点，可以方便最终的结果检测扫描定位和快速准确分析。如图B.1中，在A1，A5，E1,E5四个角点设置杂交阳性对照探针点，并在C3中心点设置PCR阳性对照探针点。0000
注：图中各小圆点代表不同的探针点，以（12345)为横向点排序，以（ABCDE)为纵向点排序。其中A1，A5，E1E5：杂交阳性对照探针点；A2～A4，B1～B5，C2,C4.D1~D5，E2～E4：检测探针点；C1.C5：阴性对照探针点；C3：PCR阳性对照探针点。
图B.1微孔板基因芯片的探针固定位点设置模式参考图B.2微孔板基因芯片检测结果模式图解质量控制：PCR阳性对照探针点，杂交阳性对照探针点有明显的显色点，其信号值大于等于背景B.2.1
信号平均值5以上；阴性对照探针点没有显色点，且其信号值小于背景信号平均值5以下；试验有效，否则试验无效。
B.2.2结果判定：试验有效时，且检测目标样本点信号值大于等于背景信号平均值5以上时，判定为该6
SN/T4283.1-—2015
检测目标结果阳性；检测目标样本点信号值小于背景信号平均值5以下时，判定为该检测目标结果阴性。如依照图B.1探针设置模式的芯片检测结果示意图：图B.2所示，芯片检测目标结果全部阴性；图B.3所示，芯片A2位点检测目标结果为阳性，其余位点检测目标结果全部为阴性；图B.4所示，芯片A3位点检测目标结果为阳性，其余位点检测目标结果全部为阴性；图B.5所示，芯片B1和B4位点检测目标结果为阳性，其余位点检测目标结果全部为阴性；依此类推，可以对获得的检测结果进行分析判定图B.2
检测目标结果全阴性
A2位点检测目标结果阳性
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国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程
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2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；—第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；-第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第1部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4283.1—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国新疆出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国河南出入境检验检疫局、中华人民共和国福建出入境检验检疫局、清华大学深圳研究生院、深圳市南山区慢性病防治院、珠海精标仪器有限公司、深圳图普科技有限公司。本部分主要起草人：顾大勇、辛本强、董瑞玲、廖凌、樊学军、高国龙、刘芳、赵芳、刘春晓、杨燕秋、张树平、史蕾、赵纯中、何建安、刘君、徐媛、林勤丰、徐云庆、张勤、黄恩炯、马岚、张涛、李永进、倪秀1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程
SN/T4283.1—2015
SN/T4283的本部分规定了微孔板基因芯片检测方法的通用技术规程，包括微孔板基因芯片的制备、检测流程、结果报告及阳性结果的处置等部分本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术进行检测2规范性引用文件
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
microplategenechip
微孔板基因芯片
与传统的基于玻片或膜的平面式基因芯片不同，其将基因探针按预设模式固定在微孔内，每孔即为一张芯片。本部分涉及的微孔板基因芯片技术具有如下特点：（a）芯片的载体为高分子材质的微孔板，类似于8×12的ELISA反应板，每孔即为以整板使用有最多
96个反应孔，也可以根据实
片。可以
际需要拆装所需的反应孔数，具有微量、高通量的特点(b）芯片反应孔面无需有机薄膜涂层修饰或化学生物等的修饰，可直接将基因探针点样到孔面上，在紫外作用下通过氢键结合，使包被的探针不易脱。（c)芯片检测采用化学显色反应的检测方式，其检测原理为生落，具有芯片制备操作简单方便的特点。物素化的PCR产物与芯片杂交，经由链霉亲和素-碱性磷酸酶介导的显色反应在芯片表面形成色点沉积，检测结果裸眼可视也可借助芯片扫描仪进行定量分析，具有快速简便可视的特点。3.2
特异性探针specificprobe
能与样品中的特异性目标核酸杂交，实现检测目的的一段寡核苷酸分子片段3.3
positivecontrolprobe
阳性对照探针
能与预设的特定目标核酸杂交，但与检测目标核酸无交叉杂交反应的一段寡核苷酸分子片段，可以用于实现对全部或部分检测流程进行质量控制。本部分涉及PCR阳性对照探针和杂交阳性对照探针。3.4
阴性对照探针
negativecontrolprobe
即空白对照探针，可以是一段人工设计合成的没有配对杂交对象的或是与本试验无关的寡核苷酸1
SN/T4283.1—2015
片段，甚至也可以是不含任何特意添加的核酸片段，主要用于监控基因芯片的杂交背景。4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
BSA牛血清白蛋白（bovineserumalbumin）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）RT-PCR逆转录PCR(reversetranscription-polymerasechainreaction）SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfonate）UV：紫外线（ultraviolet）
5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4—2011的要求。6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、UV交联仪、PCR仪、生物定全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。6.2主要试剂：微孔板基因芯片检测试剂盒或微孔板（聚苯乙烯材质）、引物（5'端生物素修饰）、探针[5端20个poly(T)修饰J、1×TE缓冲液（pH8.0)（参见附录A中A.1)、探针缓冲液（参见A.2）、漂洗缓冲液（参见A.3）、核酸提取试剂、PCR和RT-PCR反应试剂、杂交反应液（参见A.4）、洗涤液（参见A.5）、显色检测液（参见A.6）、显色液（参见A.7)。7微孔板基因芯片的制备
7.1如有合适的微孔板基因芯片检测试剂盒或适用的已固化好探针的微孔板基因芯片，则可以直接进人检测流程，即第8章
2如没有合适的微孔板基因芯片检测试剂盒或适用的已固化好探针的微孔板基因芯片，需自行固化7.2
探针制备微孔板基因芯片，则按以下步骤进行：a）取整板的空白微孔板或者是按试验要求拆装所需的反应孔板，去离子水逐个清洗微孔，再用ddH，O反复冲洗5次后，干燥备用、b）分别用1×TE缓冲液（pH8.0)溶解合成的各特异性探针以及PCR阳性对照探针、杂交阳性对照探针、阴性对照探针至100μmol/L，然后分别取探针溶液250μL，100μmol/L探针缓冲液75μL，ddH2O175μL，混合均匀成500μL的15μmol/L探针点样溶液待用。使用基因芯片点样仪，按设备操作说明书进行，分别将特异性探针、阳性对照探针、显色阳性对c)
照探针、阴性对照探针按预先设置的位点模式点在微孔板微孔中相应的位置。探针固定位点设置模式可参考B.1。
点好探针的微孔板芯片置于紫外交联仪中设置UV-A，照射0.8J，共价交联固定探针。d)
UV交联后用漂洗缓冲液漂洗2次，ddHO冲洗2次，晾干；可立即使用，也可密闭包装，4℃保存待用。
8微孔板基因芯片检测流程
8.1样品核酸的提取
SN/T4283.1—2015
8.1.1可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸的提取，或者可根据样品的不同选择采用相应的商品化的核酸提取试剂盒提取样品DNA，对样品的要求和需量参照试剂盒说明书进行，如可采用TaKaRaDNAisoReagent\试剂盒从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞中提取基因组DNA；TaKaRaBloodGenomeDNAExtractionKit试剂盒从全血中提取DNA；TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit试剂盒从体液中（如：血浆、血清、腹水、细胞培养上清、脑脊髓液、尿液等）中快速纯化DNA；TaKaRaDNAIsolationReagentforMeatandMeatProducts试剂盒从生肉及其加工品、乳制品中提取DNA；TaKaRaMiniBESTAgaroseGelDNAExtractionKit试剂盒从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段；TaKaRaMiniBESTDNAFragmentPurificationKit试剂盒从PCR反应液或其他各种酶促反应液中纯化DNA片段；TaKaRaMiniBESTPlasmidPurificationKit试剂盒从质粒中提取纯化质列DNA；TaKaRaDEXPATEasy试剂盒从福尔马林固定的石蜡包埋组织切片中提取PCR扩增用DNA模板；等等。
8.1.2可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸的提取，或者可根据样品的不同选择采用相应的商品化的核酸提取试剂盒提取样品RNA，对样品的要求和需量参照试剂盒说明书进行，如可采用TaKaRaRNAisoPlus\试剂盒从动物组织、植物材料、各种微生物、培养细胞等中提取TotalRNA；TaKaRaMiniBESTViralRNA/DNAExtractionKit试剂盒从体液（如：血浆、血清、腹水、细胞培养上清、脑脊髓液、尿液等)中快速纯化病毒RNA；等等。8.2PCR扩增反应
8.2.1待检样品核酸为DNA：可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸（包括阳性对照）的PCR扩增；或者可按照TaKaRaPCR试剂盒\配置25μLPCR反应体系和反应条件：10XPCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L)2μL，MgCl（25mmol/L）2μL，上下游引物（各5μmol/L）混合液2μL,TaqDNA聚合酶0.25μL,模板核酸5μL（或/和含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA），ddH，O11.25uL；PCR反应条件，首先94℃变性5min；然后94℃变性50s，55℃～56℃退火50s，72℃延伸50s，35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR的反应体系和反应条件应依据不同检测目标的具体设计要求而对应。8.2.2待检样品核酸为RNA：可根据相应的微孔板基因芯片检测试剂盒要求进行样品核酸（包括阳性对照）的RT-PCR扩增；或者可按照TaKaRaOneStepRT-PCRKit试剂盒\配置25μLRT-PCR反应体系和反应条件：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgCl（25mmol/L）2μL，上下游引物（各5μmol/L)混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL（或/和含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddH,O11μL。PCR反应条件，首先42℃反转录40min，然后94℃变性5min；再94℃变性50s55℃~56℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。PCR的反应体系和反应条件应依据不同检测目标的具体设计要求而对应。
8.3微孔板基因芯片杂交反应
8.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至45℃～50℃（依据不同检测的实验要求）。1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
SN/T4283.1-2015
8.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100L加入微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。8.3.3如同一样品有多个PCR反应，则每个PCR产物取5uL，混合；如为单一PCR反应，则取该PCR产物1OuL。将PCR产物于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4C后取出并立即置于冰上备用。免费标准bzxz.net
8.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加入芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中45℃～50℃（依据不同检测的实验要求），振荡反应1h。8.4微孔板基因芯片显色反应
8.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加人洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。8.4.2于各反应孔中加入100uL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。8.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHz0冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施8.4的步骤和流程。8.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放人生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择与检测芯片类型相对应的程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B中B.1），对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果（参见B.2）。9结果报告
检测结果可报告为“微孔板基因芯片检测方法：×××，×性；×××，×××（如有，列出全部阴性检测目标）为阴性”。10
阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊。10.2确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告（如有，列出全部阳性检测目标）为阳附录A
（资料性附录）
主要试剂
SN/T.4283.1—2015
A.11XTE缓冲液(pH8.0):1mol/LTris-HCl(pH8.0)1mL,0.5mol/LEDTA(pH8.0)0.2mL,超纯水定容至100mL，高压灭菌。A.2探针缓冲液：175.3gNaCl,88.2g柠檬酸钠，溶于1000mLDEPC（焦碳酸二乙酯）水中，HCI调节pH至7.0，高压灭菌。
A.3漂洗缓冲液：800mL超纯水中溶解0.27gKH,PO,1.42gNazHPO..8gNaCl.0.2gKCl，然后加人浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1000mL.高温高压灭菌后室温保存。使用时按体积比加人0.05%Tween-20。
A.4杂交反应液：1000mL蒸馏水溶液中包括250mL探针缓冲液，9.89%葡聚糖硫酸钠，1%BSA，0.1%SDS.10μL100μmol/L5'端生物素修饰的与杂交对照探针的配对杂交的核酸片段。A.5洗涤液：1000mL蒸馏水溶液中包括100ml探针缓冲液0.1%SDS。A.6显色检测液：使用前新鲜配制.漂洗缓冲液加1%BSA，0.1%标记有碱性磷酸酶的链霉亲和素溶液（1mg/mL,Sigma-Aidrich）\)A.7显色液：0.1mol/LTris-HCl.0.15mol/LNaCl.1mmol/LMgCl2，调节pH至9.5。使用时新鲜配制，取5mL加入33μLNBT，16.5μLBCIP（Promega）)S
1）给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。
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附录B
（资料性附录）
芯片探针设置模式及检测结果图解B.1微孔板基因芯片的探针固定位点设置模式参考B.1.1在芯片探针固定位点设计时应包含需求的检测目标探针，并应包含有PCR阳性对照探针、杂交阳性对照探针、阴性对照探针至少各1个。所有的探针位点均可以不限于各1个，可按需求重复设置在多个位点。如图B.1中，杂交阳性对照探针点设置有4个，阴性对照探针点设置有2个，PCR阳性对照探针点设置有1个，其余的18个位点都设置为检测探针点。B.1.2应尽可能设计探针固定位点模式为平行的规律分布模式如可以设置为2×2，2×3.2×4等，或者是3×3，3×4，3×5等，又或者是4×4，4×5，4×6等。平行分部位点中不建议设置有空缺位点。如图B.1设置为5×5分布模式。
B.1.3建议可以设置多个PCR阳性对照探针点和杂交阳性对照探针点，特别是在多个位点规律设置杂交阳性对照探针点，可以方便最终的结果检测扫描定位和快速准确分析。如图B.1中，在A1，A5，E1,E5四个角点设置杂交阳性对照探针点，并在C3中心点设置PCR阳性对照探针点。0000
注：图中各小圆点代表不同的探针点，以（12345)为横向点排序，以（ABCDE)为纵向点排序。其中A1，A5，E1E5：杂交阳性对照探针点；A2～A4，B1～B5，C2,C4.D1~D5，E2～E4：检测探针点；C1.C5：阴性对照探针点；C3：PCR阳性对照探针点。
图B.1微孔板基因芯片的探针固定位点设置模式参考图B.2微孔板基因芯片检测结果模式图解质量控制：PCR阳性对照探针点，杂交阳性对照探针点有明显的显色点，其信号值大于等于背景B.2.1
信号平均值5以上；阴性对照探针点没有显色点，且其信号值小于背景信号平均值5以下；试验有效，否则试验无效。
B.2.2结果判定：试验有效时，且检测目标样本点信号值大于等于背景信号平均值5以上时，判定为该6
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检测目标结果阳性；检测目标样本点信号值小于背景信号平均值5以下时，判定为该检测目标结果阴性。如依照图B.1探针设置模式的芯片检测结果示意图：图B.2所示，芯片检测目标结果全部阴性；图B.3所示，芯片A2位点检测目标结果为阳性，其余位点检测目标结果全部为阴性；图B.4所示，芯片A3位点检测目标结果为阳性，其余位点检测目标结果全部为阴性；图B.5所示，芯片B1和B4位点检测目标结果为阳性，其余位点检测目标结果全部为阴性；依此类推，可以对获得的检测结果进行分析判定图B.2
检测目标结果全阴性
A2位点检测目标结果阳性
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