SN/T 4283.5-2015.Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 5 : Mycoplasma pneumonia，chlamydia pneumonia and legionella pneumophila.
1范围
SN/T 4283.5规定了国境口岸3种非典型肺炎病原体(肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌)的微孔板基因芯片检测方法。
SN/T 4283.5适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对3种非典型肺炎病原体(肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌)检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T2351出入境口岸军团菌检验规程
SN/T 2752.4- -2011卫生 检疫人员的自我防护规范第4部分:实验室人员
SN/T2770国境口岸军团菌荧光PCR检测方法
SN/T 4283.1国境口 岸微孔板芯片检测方法第1 部分:通用技术规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
SN/T 4283. 1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1非典型肺炎atypical pneumonia
是相对于典型肺炎而言的,多由支原体、衣原体、军团菌、立克次体、病毒及其他一些不明微生物等病原引起,症状、肺部体征、验血结果没有典型肺炎感染明显,一些病毒性肺炎抗菌素无效。
3.2肺炎支原体mycoplasma pneumonia
引起非典型性肺炎的常见病原体,大小约为0.2μm~0.3μm,呈现高度的多形态性，没有细胞壁，胞质内含有环状双链DNA游离于胞质内,是基因组最小的原核细胞。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4283.5—2015
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌
Testmethod of microplate gene chip at frontier port-Part 5:Mycoplasmapneumonia,chlamydiapneumonia andlegionella pneumophila2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第5部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4283.5—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出人境检验检疫局、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：何建安、樊学军、徐媛、高国龙、廖凌、赵纯中、史蕾、刘春晓、赵芳、徐云庆、李永进。
1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌
SN/T4283.5—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸3种非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌）的微孔板基因芯片检测方法本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对3种非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌)检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T2351出入境口岸军团菌检验规程SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员SN/T2770国境口岸军团菌荧光PCR检测方法SN/T4283.1国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程微生物和生物医学实验室生物安全通用准则WS233
3术语和定义
SN/T4283.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件3.1
atypicalpneumonia
非典型肺炎
是相对于典型肺炎而言的，多由支原体、衣原体、军团菌、立克次体、病毒及其他一些不明微生物等病原引起，症状、肺部体征、验血结果没有典型肺炎感染明显，一些病毒性肺炎抗菌素无效。3.2
mycoplasmapneumoniawwW.bzxz.Net
肺炎支原体
引起非典型性肺炎的常见病原体，大小约为0.2um～0.3μm，呈现高度的多形态性，没有细胞壁，胞质内含有环状双链DNA游离于胞质内，是基因组最小的原核细胞。3.3
肺炎衣原体chlamydiapneumonia主要引起非典型性肺炎，原体形态多样，核区呈圆形，位于细胞中央，核区和细胞膜之间有较宽的原生质区。肺炎衣原体不能体外培养，只能在细胞内寄生，鸡胚对其不敏感，因此一般用细胞培养传代。由于肺炎衣原体感染没有典型的临床表现，其诊断主要依靠实验室检测，1
SN/T4283.5—2015
晴肺军团菌legionellapneumophila又名退伍军人杆菌，属军团菌科军团菌属，为有鞭毛的革兰氏阴性杆菌，兼性需氧，无芽孢，无荚膜主要存在于温暖潮湿的自然环境，也广泛分布于人工供水系统中，是一种原发的人类病原体，可引发军团病。
4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。MP：肺炎支原体（mycoplasmapneumonia）CP：肺炎衣原体（chlamydiapneumonia）LP：嗜肺军团菌（legionellapneumophila）5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求，5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等6.2主要试剂：非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌）的微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置的非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌）的微孔板基因芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A）。7检测流程
7.1样品核酸的提取
按照SN/T2351和SN/T2770处理样品，提取基因组DNA。7.2PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置PCR反应体系，或自行配置25μLPCR反应体系：10×PCR缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（含PCR阳性对照）（各5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddH.O11.25μL；振荡混匀，并轻微离心。7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先95℃变性5min；然后95℃变性20s，50℃退火20s，72℃延伸40s，10个循环；然后95℃变性20s，53℃退火20s72℃延伸40s，25个循环；最后72℃延伸10min，4℃保存备用；若需长期使用请置于一20℃保存。7.3
微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至45℃。7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇2
SN/T4283.5—2015
动混合均匀后，分别取100μL加入微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。7.3.3取样品PCR产物10uL于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。
7.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加人芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中45℃，振荡反应1h。7.4微孔板基因芯片显色反应
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加人洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。7.4.2于各反应孔中加人100μL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体。7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHzO冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥。注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放入生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择非典型肺炎病原体（肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌)生物芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B)，对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果。
8结果报告
检测结果可报告为“微孔板基因芯片检测方法：X×X，XX×（如有，应列出全部阳性检测目标）为阳性；×××，×××（如有，列出全部阴性检测目标)为阴性”。9阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊。9.1
9.2确诊为阳性结果后应按规定和程序向相应部门报告。3
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附录A
（资料性附录）
MP、CP、LP微孔板基因芯片检测相关的引物和探针MP、CP、LP微孔板基因芯片检测相关的引物和探针如表A.1所示，表A.1
目标名称
MP、CP、LP微孔板基因芯片检测相关的引物和探针引物和探针序列
F:AGGCTCAGGTCAATCTGGCGTGGA
PCR阳性对照
(16SrRNA)
杂交阳性对照
阴性对照
R:GGATCAAACAGATCGGTGACTGGGT
P1:ACCAAgCACGAGTGACGGAAACA
P2:CTGAAAGCAACGCCGCAAAG
F：CAGAAGAAAAAAATAAACATGCGATAGGR:AACAGGTGCTGGCTTTGTTTCCGCACTAP:CGCTAACGAGTATGGCGAGTTGCT
F:ACCGAACAGCAAATGAAAGA
R：AACGCCTGGCTTGTTTTTGT
P：AACAAGTTTCAGAAAGATTTGATGGCAAAGF:AAAACTCAAATGAATTGACGG
R:GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGTP：GTCGTOAGCTCGT
TGTTGTGAAATG
P：ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCGGTCCGGTTATCGCT
P:TCCTCOAATTT
注1：F表示上游引物，R表示下游引物，P表示探针。注2：引物5'端生物素修饰。
注3：探针5端20个poly(T)的修饰：同一检测目标的多个探针均匀混合使用，即在点样时的500μL探针点样溶液中要求每个探针的浓度均为15umol/L注4：序列中R代表A/G，Y代表C/T注5：杂交阳性探针的配对杂交片段为5'端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT。4
附录B
（资料性附录）
MP、CP、LP微孔板基因芯片检测探针设置模式MP、CP、LP微孔板基因芯片检测探针设置模式如图B.1所示。SN/T4283.5—2015
注：A1,A3，C1，C3：杂交阳性对照探针点；A2：MP，BI：阴性对照探针点：B2：PCR阳性对照探针点：B3：CP；C2: LP。
图B.1MP、CP、LP微孔板基因芯片检测探针设置模式图
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