SN/T 4283.4-2015
基本信息
标准号： SN/T 4283.4-2015
中文名称：国境口岸微孔板基因芯片检测方法第4部分:肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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相关标签： 国境 口岸 微孔 基因芯片 检测 方法 肠道病毒 病毒
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4283.4-2015.Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 4: Enterovirus，enterovirus 71 and coxsackie virus A16.
1范围
SN/T 4283.4规定了国境口岸肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型鉴别的微孔板基因芯片检测方法。
SN/T 4283.4适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型的鉴别检测。
2规范性引用文件.
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB.19489实验室生物安全通用要求
SN/T 2752.4-2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分:实验室人员
SN/T 4283.1国境口 岸微孔板基因芯月检测方法第 1部分:通用技术规程
Ws233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
SN/T 4283.1 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1肠道病毒enterovirus
又称肠病毒,属于小RNA病毒科Picornaviridae )的肠病毒属(Enterovirus),是一类具有相同的形态结构和生物学特点、形态最小的单股正链RNA病毒。肠道病毒包括小儿麻痹病毒(polioviruses)3个型,柯萨奇病毒(coxsackieviruses)A组23个型、B组6个型,伊科病毒(echoviruses)31个型及肠道病毒( enteroviruses)68型~72型。
1范围
SN/T 4283.4规定了国境口岸肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型鉴别的微孔板基因芯片检测方法。
SN/T 4283.4适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型的鉴别检测。
2规范性引用文件.
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB.19489实验室生物安全通用要求
SN/T 2752.4-2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分:实验室人员
SN/T 4283.1国境口 岸微孔板基因芯月检测方法第 1部分:通用技术规程
Ws233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
SN/T 4283.1 界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1肠道病毒enterovirus
又称肠病毒,属于小RNA病毒科Picornaviridae )的肠病毒属(Enterovirus),是一类具有相同的形态结构和生物学特点、形态最小的单股正链RNA病毒。肠道病毒包括小儿麻痹病毒(polioviruses)3个型,柯萨奇病毒(coxsackieviruses)A组23个型、B组6个型,伊科病毒(echoviruses)31个型及肠道病毒( enteroviruses)68型~72型。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4283.4—2015
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型
Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 4:Enterovirusenterovirus 71 and coxsackie virus A162015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂属责
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
-第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；一第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第4部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4283.4—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：赵纯中、刘芳、黄恩炯、顾大勇、何建安、史蕾、刘春晓、赵芳、徐云庆、李永进。I
1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型柯萨奇病毒A16型
SN/T4283.4—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型鉴别的微孔板基因芯片检测方法。
本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型的鉴别检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB.19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员SN/T4283.1国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
SN/T4283.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
肠道病毒enterovirus
又称肠病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）的肠病毒属（Enterovirus），是一类具有相同的形态结构和生物学特点、形态最小的单股正链RNA病毒。肠道病毒包括小儿麻痹病毒（polioviruses）3个型，柯萨奇病毒（coxsackieviruses）A组23个型、B组6个型，伊科病毒（echoviruses）31个型及肠道病毒（enteroviruses)68型～72型。3.2
肠道病毒71型enterovirus71
肠道病毒的一种，感染性强且致病率高，可经由肠胃道（粪-口、水、食物污染）或呼吸道（飞沫、咳嗽或打喷嚏）传染，也可经由接触病人皮肤水泡的液体而受到感染。6岁以下儿童发病率最高，主要引起手足口病，与柯萨奇病毒A16型（coxsackievirusA16）导致的临床症状极为相似，很难分辨，只能依靠实验室的病毒检测技术来鉴别。3.3
柯萨奇病毒A16型
coxsackievirusA16
肠道病毒的一种，是引起手足口病的主要肠道病毒，其导致的症状与肠道病毒71型极为相似。1
SN/T4283.4—2015
4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。EV：肠道病毒（enterovirus）
EV71：肠道病毒71型（enterovirus71)CoxA16：柯萨奇病毒A16型（coxsackievirusA16）5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求。6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。6.2主要试剂：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置的肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型微孔板基因芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A）。
7检测流程
7.1样品核酸的提取
使用RocheHighPureViralNucleicAcidKit提取样品中病毒RNA，具体使用方法参考试剂说明书。
7.2RT-PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置RT-PCR反应体系，或自行配置25μLRT-PCR反应体系：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L)2μL，所有上下游引物（各5μmol/L)混合液2μL，TagDNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddH,O11μL。振荡混匀，并轻微离心。7.2.2将上述PCR反应管放入PCR仪，设定PCR反应程序：首先42℃反转录40min，然后94℃变性5min；再94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。若需长期使用请置于一20℃保存。7.3微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100μL加入微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。7.3.3取样品PCR产物10μL于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。
SN/T4283.4-2015
7.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加入芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中50℃，振荡反应1h。7.4微孔板基因芯片显色反应
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加人洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.2于各反应孔中加人100uL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHz0冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥。注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放入生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B)，对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果。8结果报告
检测结果报告可分为以下几种模式：一如均未检出，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：肠道病毒阴性”。-如肠道病毒检测结果为阳性，肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型检测结果均为阴性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：肠道病毒阳性；肠道病毒71型阴性，柯萨奇病毒A16型阴性”。一如肠道病毒检测结果为阳性，肠道病毒71型检测结果为阳性，柯萨奇病毒A16型检测结果为阴性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：肠道病毒71型阳性”。一如肠道病毒检测结果为阳性，肠道病毒71型检测结果为阴性，柯萨奇病毒A16型检测结果为阳性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：柯萨奇病毒A16型阳性”。9阳性结果的处置
9.1检测结果为阳性的样品应做进一步确诊。9.2确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告。3
SN/T4283.4—2015
附录A
（资料性附录）
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相关的引物及探针A.1
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相关的引物如表A.1所示。表A.1
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相关的引物引物名称
EV通用
EV71,CoxA16通用
PCR阳性对照（16SrRNA）
注1：F表示上游引物，R表示下游引物。注2：引物5'端生物素修饰。
引物序列
F:AAGAGYCTATTGAGCTA
R:CACYGGATGGCCAATCCAA
F:GGITGGTRSTGGAARTTIC
R:ARRTTIATCCAYTGRTGIGG
AAAACTCAAATGAATTGACGG
R：GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGT注3：序列中I代表次黄昔（Inosine）碱基：Y代表C/T：R代表A/G;S代表（EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相表A.2
探针名称
CoxA16
PCR阳性对照
杂交阳性对照
阴性对照Www.bzxZ.net
关的探针如表
A.2所示。
及LV71.CoxA16行
微孔板基因芯片检测相关的探针EV及
探针序列
CTCCGGCCCCTG
AATGCGGCTAATC
P2:TGTCGTAACGSGC
AASTCYGYRGCG
GGAACCGAC
P3:TACTTTGGGTGT
TCCGTGTTTCHTTTTAT
GCTGATG
CTTATAAGCAO
CACTCAACCCGGT
CAATATCA
CAATTAACAGTG
TGGCATTCO
P3:TRCARCACCCGTACGTGCTYGATGCTGGSAP1：CTCGGCACTATCGCAGGAGGGACCGGGAATP2：CCTACGCCACTACACAGCCTGGTCAGGTTGP:GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG
P:ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCGP：TCCTCCAATTTGTCCGGTTATCGCT注1：探针5'端20个poly(T)的修饰。注2：探针序列中I代表次黄苷（Inosine)碱基：Y代表C/T；R代表A/G;S代表G/C;H代表A/C/T。注3：同一检测目标的多个探针均匀混合使用，即在点样时的500μL探针点样溶液中要求每个探针的浓度均为15μmol/L。
注4：杂交阳性探针的配对杂交片段为5'端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT。附录B
（资料性附录）
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测探针设置模式EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测探针设置模式如图B.1所示。8自8
SN/T4283.4—2015
注：A1A5，E1E5：杂交阳性对照操针点：A2.A4.B1.B3B5.C2.C4.D1,D3.D4,D5,E2，E4：阴性对照探针点；A3，C1,C3C5，E3.PCR阳性对照探针点B2.EV,B4EV71;D2.CoxA16图B.1EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测探针设置模式图S
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国境口岸微孔板基因芯片检测方法第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型
Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 4:Enterovirusenterovirus 71 and coxsackie virus A162015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂属责
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分：通用技术规程；
-第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；一第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第4部分。
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4283.4—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国甘肃出人境检验检疫局、中华人民共和国福建出人境检验检疫局、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：赵纯中、刘芳、黄恩炯、顾大勇、何建安、史蕾、刘春晓、赵芳、徐云庆、李永进。I
1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型柯萨奇病毒A16型
SN/T4283.4—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型鉴别的微孔板基因芯片检测方法。
本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对肠道病毒以及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型的鉴别检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文
件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB.19489实验室生物安全通用要求SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员SN/T4283.1国境口岸微孔板基因芯片检测方法第1部分：通用技术规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
SN/T4283.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
肠道病毒enterovirus
又称肠病毒，属于小RNA病毒科（Picornaviridae）的肠病毒属（Enterovirus），是一类具有相同的形态结构和生物学特点、形态最小的单股正链RNA病毒。肠道病毒包括小儿麻痹病毒（polioviruses）3个型，柯萨奇病毒（coxsackieviruses）A组23个型、B组6个型，伊科病毒（echoviruses）31个型及肠道病毒（enteroviruses)68型～72型。3.2
肠道病毒71型enterovirus71
肠道病毒的一种，感染性强且致病率高，可经由肠胃道（粪-口、水、食物污染）或呼吸道（飞沫、咳嗽或打喷嚏）传染，也可经由接触病人皮肤水泡的液体而受到感染。6岁以下儿童发病率最高，主要引起手足口病，与柯萨奇病毒A16型（coxsackievirusA16）导致的临床症状极为相似，很难分辨，只能依靠实验室的病毒检测技术来鉴别。3.3
柯萨奇病毒A16型
coxsackievirusA16
肠道病毒的一种，是引起手足口病的主要肠道病毒，其导致的症状与肠道病毒71型极为相似。1
SN/T4283.4—2015
4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。EV：肠道病毒（enterovirus）
EV71：肠道病毒71型（enterovirus71)CoxA16：柯萨奇病毒A16型（coxsackievirusA16）5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求。5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求。6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。6.2主要试剂：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置的肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型微孔板基因芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A）。
7检测流程
7.1样品核酸的提取
使用RocheHighPureViralNucleicAcidKit提取样品中病毒RNA，具体使用方法参考试剂说明书。
7.2RT-PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置RT-PCR反应体系，或自行配置25μLRT-PCR反应体系：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L)2μL，所有上下游引物（各5μmol/L)混合液2μL，TagDNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL（含阳性对照核酸1μL，主要为细菌基因组DNA)，ddH,O11μL。振荡混匀，并轻微离心。7.2.2将上述PCR反应管放入PCR仪，设定PCR反应程序：首先42℃反转录40min，然后94℃变性5min；再94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。若需长期使用请置于一20℃保存。7.3微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100μL加入微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。7.3.3取样品PCR产物10μL于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。
SN/T4283.4-2015
7.3.4取上述已变性处理的PCR产物10μL加入芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中50℃，振荡反应1h。7.4微孔板基因芯片显色反应
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加人洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.2于各反应孔中加人100uL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加人200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddHz0冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥。注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放入生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B)，对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果。8结果报告
检测结果报告可分为以下几种模式：一如均未检出，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：肠道病毒阴性”。-如肠道病毒检测结果为阳性，肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型检测结果均为阴性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：肠道病毒阳性；肠道病毒71型阴性，柯萨奇病毒A16型阴性”。一如肠道病毒检测结果为阳性，肠道病毒71型检测结果为阳性，柯萨奇病毒A16型检测结果为阴性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：肠道病毒71型阳性”。一如肠道病毒检测结果为阳性，肠道病毒71型检测结果为阴性，柯萨奇病毒A16型检测结果为阳性，则报告为“微孔板基因芯片检测方法：柯萨奇病毒A16型阳性”。9阳性结果的处置
9.1检测结果为阳性的样品应做进一步确诊。9.2确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告。3
SN/T4283.4—2015
附录A
（资料性附录）
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相关的引物及探针A.1
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相关的引物如表A.1所示。表A.1
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相关的引物引物名称
EV通用
EV71,CoxA16通用
PCR阳性对照（16SrRNA）
注1：F表示上游引物，R表示下游引物。注2：引物5'端生物素修饰。
引物序列
F:AAGAGYCTATTGAGCTA
R:CACYGGATGGCCAATCCAA
F:GGITGGTRSTGGAARTTIC
R:ARRTTIATCCAYTGRTGIGG
AAAACTCAAATGAATTGACGG
R：GTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGT注3：序列中I代表次黄昔（Inosine）碱基：Y代表C/T：R代表A/G;S代表（EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测相表A.2
探针名称
CoxA16
PCR阳性对照
杂交阳性对照
阴性对照Www.bzxZ.net
关的探针如表
A.2所示。
及LV71.CoxA16行
微孔板基因芯片检测相关的探针EV及
探针序列
CTCCGGCCCCTG
AATGCGGCTAATC
P2:TGTCGTAACGSGC
AASTCYGYRGCG
GGAACCGAC
P3:TACTTTGGGTGT
TCCGTGTTTCHTTTTAT
GCTGATG
CTTATAAGCAO
CACTCAACCCGGT
CAATATCA
CAATTAACAGTG
TGGCATTCO
P3:TRCARCACCCGTACGTGCTYGATGCTGGSAP1：CTCGGCACTATCGCAGGAGGGACCGGGAATP2：CCTACGCCACTACACAGCCTGGTCAGGTTGP:GTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATG
P:ATGAAGCAYGTCAGGGCRTGGATACCTCGP：TCCTCCAATTTGTCCGGTTATCGCT注1：探针5'端20个poly(T)的修饰。注2：探针序列中I代表次黄苷（Inosine)碱基：Y代表C/T；R代表A/G;S代表G/C;H代表A/C/T。注3：同一检测目标的多个探针均匀混合使用，即在点样时的500μL探针点样溶液中要求每个探针的浓度均为15μmol/L。
注4：杂交阳性探针的配对杂交片段为5'端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT。附录B
（资料性附录）
EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测探针设置模式EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测探针设置模式如图B.1所示。8自8
SN/T4283.4—2015
注：A1A5，E1E5：杂交阳性对照操针点：A2.A4.B1.B3B5.C2.C4.D1,D3.D4,D5,E2，E4：阴性对照探针点；A3，C1,C3C5，E3.PCR阳性对照探针点B2.EV,B4EV71;D2.CoxA16图B.1EV及EV71、CoxA16微孔板基因芯片检测探针设置模式图S
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