SN/T 4283.3-2015.Test method of microplate gene chip at frontier port-Part 3: Seven respiratory viruses.
1范围
SN/T 4283.3规定了国境口岸A、B型流感病毒,副流感病毒I II III型,呼吸道融合病毒以及腺病毒共7种呼吸道病毒的微孔板基因芯片检测方法。
SN/T 4283.3适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对上述7种呼吸道病毒进行检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生 物安全通用要求
SN/T2609国境口岸流感、副流感、呼吸道合胞病毒的酶联免疫吸附试验检测方法
SN/T 2752.4-2011卫生检疫人 员的自我防护规范第4部分:实验室人员
SN/T 4283.1国境口岸 微孔板芯片检测方法第1部分:通用技术规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
SN/T 4283.1和SN/T 2609界定的以及下列术语和定义适用于本文件。
3.1呼吸道病毒respiratory viruses
以呼吸道为侵入门户,先在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖并引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官产生病变的病毒统称。
3.2腺病毒adenovirus
一种无包膜的双链DNA病毒,对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染,其呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎,同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4283.3—2015
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第3部分：7种呼吸道病毒
Test method of microplate gene chip at frontier port-Part3:Seven respiratoryviruses2015-05-26发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-01-01实施
SN/T4283《国境口岸微孔板基因芯片检测方法》为系列标准，分为六个部分：第1部分；通用技术规程；
第2部分：结核分枝杆菌及katG和rpoB耐药变异基因；第3部分：7种呼吸道病毒；
第4部分：肠道病毒及肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型；第5部分：肺炎支原体、肺炎衣原体及嗜肺军团菌；第6部分：12种食源性致病菌。
本部分为SN/T4283的第3部分。
本部分按照GB/T1.12009给出的规则起草。SN/T4283.3—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国深圳出人境检验检疫局、深圳市检验检疫科学研究院、清华大学深圳研究生院、珠海精标仪器有限公司。本部分主要起草人：史蕾、马岚、林勤丰、顾大勇、刘君、刘春晓、赵芳、赵纯中、何建安、徐云庆、李永进。
1范围
国境口岸微孔板基因芯片检测方法第3部分：7种呼吸道病毒
SN/T4283.3—2015
SN/T4283的本部分规定了国境口岸A、B型流感病毒，副流感病毒I、IⅡ、Ⅲ型，呼吸道融合病毒以及腺病毒共7种呼吸道病毒的微孔板基因芯片检测方法。本部分适用于在国境口岸实验室采用微孔板基因芯片技术对上述7种呼吸道病毒进行检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件GB19489实验室生物安全通用要求国境口岸流感、副副流感、呼吸道合胞病毒的酶联免疫吸附试验检测方法SN/T2609
SN/T2752.4一2011卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员国境口岸微孔板芯片检测方法第1部分：通用技术规程SN/T4283.1
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则WS233
3术语和定义
SN/T4283.1和SN/T2609界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1
呼吸道病毒
respiratoryviruses
以呼吸道为侵人门户，先在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖并引起呼吸道局部感染或呼吸道以外组织器官产生病变的病毒统称。
腺病毒adenovirus
一种无包膜的双链DNA病毒，对呼吸道、胃肠道、尿道和膀胱、眼、肝脏等均可感染，其呼吸道感染的典型症状是咳嗽、鼻塞和咽炎，同时伴有发热、寒战、头痛和肌肉痛等。4缩略语
SN/T4283.1界定的以及下列缩略语适用于本文件。IAV：A型流感病毒（influenzaAvirus）IBV:B型流感病毒（influenzaBvirus）PIV：副流感病毒（parainfluenzavirus）ADV：腺病毒（adenovirus）
RSV：呼吸道合胞病毒（respiratorysyncytialvirus）1
SN/T4283.3—2015
5生物安全防护要求
5.1实验室应遵循GB19489和WS233对应的生物安全要求5.2实验人员的防护遵循SN/T2752.4一2011的要求。6主要设备和试剂
6.1主要设备：基因芯片点样仪、芯片杂交仪、芯片清洗显色仪、生物芯片全自动扫描判读仪、PCR仪、生物安全柜、离心机、移液器、恒温水浴锅等。6.2主要试剂：呼吸道病毒微孔板基因芯片检测试剂盒或自行设置的呼吸道病毒微孔板基因芯片检测试剂（相关引物及探针序列参见附录A)。7
检测流程
7.1样品核酸的提取
使用RocheHighPureViralNucleicAcidKit提取样品核酸，可同时提取样品中病毒RNA和DNA。
7.2RT-PCR扩增反应
7.2.1可使用试剂盒附带的试剂按说明书要求配置RT-PCR反应体系，或自行配置：每个样品进行两管反应，取适量RNase-freePCR管，分别标示样品编号与管号。每个样品的1号管中配置25μLRTPCR反应体系：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L）2μL，所有上下游引物（各5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL，ddH2O11μL。每个样品的2号管中配置25μLRT-PCR反应体系：10×缓冲液2.5μL，dNTPs（各5μmol/L）2μL，MgClz（25mmol/L)2μL，PCR阳性对照上下游引物（各5μmol/L）混合液2μL，TaqDNA聚合酶0.25μL，AMV反转录酶0.25μL，模板核酸5μL，阳性对照核酸（主要为细菌基因组DNA)2μL，ddHzO9μL。分别振荡混勾，并轻微离心。7.2.2将上述PCR反应管放人PCR仪，设定PCR反应程序：首先42℃反转录40min，然后94℃变性5min；再94℃变性50s，50℃退火50s，72℃延伸50s，共35个循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。若需长期使用请置于一20℃保存。7.3微孔板基因芯片杂交反应
7.3.1开启芯片杂交仪，并设置芯片杂交仪预加热至50℃。7.3.2按试验要求准备所需的微孔板基因芯片，并准确、清晰标记。将杂交反应液平衡至室温，轻轻摇动混合均匀后，分别取100μL加人微孔板各检测孔中；在桌面轻轻平行晃动微孔板，使各孔中的杂交反应液均匀勾覆盖于芯片检测表面并且无气泡产生，如有气泡可以用洁净的细针或加样枪头去除。7.3.3分别取每个样品的1号管和2号管PCR产物各5μL，混合后于PCR仪中95℃加热5min，待PCR仪降温至4℃后取出并立即置于冰上备用。7.3.4取上述已变性处理的10μLPCR产物，加人芯片的对应检测孔中，贴上杂交反应盘胶膜，置于芯片杂交仪中50℃，振荡反应1h。2
7.4微孔板基因芯片显色反应
SN/T4283.3—2015
7.4.1杂交反应结束后，取出微孔板芯片将微孔内的液体用力甩出倒空，每孔加人洗涤液200μL，在桌面轻轻平行晃动微孔板20s（以反应孔内液体不溢出为限），然后用力甩干反应孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体7.4.2于各反应孔中加人100μL显色检测液，室温静置反应20min后，用力甩干反应孔中液体。然后加入200μL洗涤液，静置1min，甩干孔中液体，重复上述动作2遍，最后一次在液体倒掉后将芯片置于擦手纸上轻拍数次，以去除残留液体，7.4.3于各反应孔中加人100μL显色液，室温避光反应8min后，用力甩干孔中液体。ddH，O冲洗芯片内部，于擦手纸上轻拍数次，以去除残留之液体，置于50℃烘箱或室温干燥注：配置芯片清洗显色仪的可使用仪器自带程序，按照操作说明书实施7.4的步骤和流程。7.5
微孔板基因芯片结果检测
将显色反应后的芯片放入生物芯片全自动扫描判读仪内，扫描获得杂交结果图。运行设定的图像分析软件，选择呼吸道病毒芯片结果分析程序，依据芯片探针设置模式（参见附录B），对扫描获得的杂交结果进行自动化的数据分析判定，获得检测结果。结果报告
检测结果可报告为“微孔板基因芯片检测方法：XX×，X××（如有，应列出全部阳性检测目标）为阳性；×XX，XX×（列出全部阴性检测目标)为阴性”。9
阳性结果的处置
检测结果为阳性的样品应做进一步确诊9.1
9.2确诊为阳性结果后应按规定程序向相应部门报告。3
SN/T4283.3—2015
（资料性附录）
呼吸道病毒微孔板基因芯片检测相关的引物及探针呼吸道病毒微孔板基因芯片检测相关的引物及探针如表A.1所示。表A.1
目标名称
呼吸道病毒微孔板基因芯片检测相关的引物及探针引物及探针序列
F:CGAAATTTCACCATTGCCTT
R:GTCTCACTTCTTCAATCAGCCA
PIVⅢ
GACTTGAATGGARTGATAACAC
P1:CGGAGG免费标准bzxz.net
P2:TCTACAGAGATTCGCTTGCRGAAGCAGP3:GACMTCCACTYACTC
CAAAACAGAAAC
F:CTGGGATAACATCKTCAAACTC
R:TGTTCTGTCGTGCATTATAGG
P1:TGTGATACCACTGACAACAACACCWAC-3P2:GCAAATCTCAAAGGAACAAARACYAG-3P3:AAACTATGCCCAAMSTGTYTCAACTGY-3F:CTGTAATAGCTGCAGGAACAAG
R.CCTTGGAG
TTGTTA
P1:CTCCYTGCCYACT
GTRAATGAGACTA
P2:CGAGT
GAAGGTATAGAAGAYT
ATTTGACA
P3:CTCAAGGGAA
AGACOAAATCT
TCATCG
P4:GCTGCAGGAACAAGGGGTTA
ATCAGTTATGC
P5:GTGTAGGAAGRGGGATAAAYATTGAAP6:CCTTGGAGCGGAGTTGTTA
KAGCCA
F:GATCTAGCTGAACTGAGACTTGC
R:TATGAGACCACCATATACAGGAAA
PI:GATCTAGCTGAACTGAGACTTGCTTTCTATTATTATP2:TCATATCTCTTCCAAAYACAACAGGGCAP3:TGCAGTYGGAAGCGGGATCTATC
F;AGTTGATGAAAGATCAGATTATGC
R:CCTGGTCCAACAGATGGGTAT
P1:TGCATCATCAGGCATAGAAGATATTGTACP2ATYATGATGGYTCAATCTCAACAACAAGP3:ATCTCAACAACAAGATTTAAGAAYAATAAYATAA目标名称
PCR阳性对照
(16SrRNA）
杂交阳性对照
阴性对照
表A.1（续）
引物及探针序列
F:GYATTGGCATTAAGCCTACAA
R:AACTTGACTTTGCTAAGAGCCAT
P1：TAAGCCTACAAAGCAYACTCCCATAATAP2:AAATATGACCTCAACCCGTAAATTCCAAP3:AACCCAWCCAAACYAAGCTATTCC
P4:GATGGAGO
CCTGAAAATTATAGTAATTTAAAAT
P5:CAAACAACARTGCTCAAYAGTTAAGAAGGAP6：AGGAGAGATATAAGATGAAAGATGGGGCP7：AGGAGAGACATAAGATAGAAGATGGGGCF-CCACCTTCTTCCCCAT
R:CTCATKGGCTGGAAGTT
P1:TCCCCATGGCBCACAACACNGC-3
ACTGGGCRGCYTT-3
P2:TCKCGCAA
P3:AACCACAC
YTTYAAGAAGGTSKCCATC-3
P4:AACATGACCAARGACTGGTTCCTGGTP5:TACAAYATYGGMT
ACCAGG
GCTTYTA-3
TTGACGG
F:AAAACTCA
AATGAA
R:GTACAAGGCCCGGGA
AACGTATTCAG
P:GTCGTCAGCTCGT
TGTTGTGAAATO
P:ATGAAGCAYGTC
AGGGCRTGGAT
ACCTCG
P.TCCTCCAATTTGTCCGGTTATCGCT
注1.F表示上游引物，R表示下游引物，P表示控针。注2:引物5'端生物素修饰。
TAAGGAG
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注3：探针5'端20个poly(T)的修饰；同一检测目标的多个探针均勾混合使用，即在点样时的500uL探针点样溶液中要求每个探针的浓度均为15μmol/L。注4：序列中B代表C/G/T，K代表G/T，M代表A/C,N代表A/C/G/T，R代表A/G，S代表C/G，W代表A/T，Y代表C/T。
注5：杂交阳性探针的配对杂交片段为5端生物素修饰的CGAGGTATCCAYGCCCTGACRTGCTTCAT。5
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附录B
（资料性附录）
呼吸道病毒微孔板基因芯片检测探针设置模式呼吸道病毒微孔板基因芯片检测探针设置模式如图B.1所示。D
注：A1，A5E1,E5：杂交阳性对照探针点：A2，A3，A4，B1，B5C2，C4，D5，E2，E3，E4：阴性对照探针点；B2：PIVIⅢ；B3:PIVII；B4.PIVI;C1,C3.C5:PCR阳性对照探针点；D1:ADV;D2:IVB;D3:IVA;D4:RSV图B.1
呼吸道病毒微孔板基因芯片检测探针设置模式图
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