SN/T3306.2—2012 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第2部分：产毒素霍乱弧菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port—Part 2: Cholera toxin-producing Vibrio cholerae 发布日期：2012-12-12 实施日期：2013-07-01 前言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》共分为4部分：第1部分：鼠疫杆菌；第2部分：产毒素霍乱弧菌；第3部分：志贺氏菌；第4部分：嗜肺军团菌。本部分为SN/T3306的第2部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局、中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中国疾病预防控制中心、广州华峰生物科技有限公司。 本部分主要起草人：田桢干、左锋、查期、翰志英、陆哗、章琪、方筠、李晓虹、王传现、何宇平、李平、卢钟山、王婷、阀飚、曹以诚、杜正平、陈狗。 1 范围 SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似样本、环境水等样品中产毒素霍乱弧菌的环介导恒温扩增（LAMP）法。本部分适用于国境口岸产毒素霍乱弧菌的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 230—2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 WS 289 霍乱诊断标准 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件： Betaine：甜菜碱 Bst酶 [Bst DNA polymerase (large fragment)]：Bst DNA聚合酶（大片段） CT (cholera toxin)：霍乱毒素 ctrA (cholera toxin subunit A gene)：霍乱毒素A亚单位基因 DNA (deoxyribonucleic acid)：脱氧核糖核酸 dNTP (deoxyribonucleoside triphosphate)：脱氧核苷三磷酸 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)：乙二胺四乙酸 LAMP (loop-mediated isothermal amplification)：环介导恒温扩增 Triton X-100：聚乙二醇辛基苯基醚 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测产毒素霍乱弧菌，所有培养物和废弃物应参照GB 19489中的有关规定执行。 5 防污染措施 防止污染措施应符合WS/T 230的规定。 6 技术概要 根据产毒素霍乱弧菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，可观察判断结果；另加入核酸显色液，可观察颜色变化判定结果。 7 试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 7.1 引物 根据产毒素霍乱弧菌属特有的靶序列ctrA基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。外引物扩增片段长度：242bp。 外引物1 (F3, 5'-3'): GCAAATGATGATAAGTTATATCGG 外引物2 (B3, 5'-3'): GMCCAGACAATATAGTTTGACC 内引物1 (FIP, 5'-3'): TCTGTCCTCTTGGCATAAGACGCAGATTCTAGACCTCCTG 内引物2 (BIP, 5'-3'): TCAACCTTTATGATCATGCAAGAGGCTCAAACTAATTGAGGTGGAA 环状引物1 (LF, 5'-3'): CACCTGACTGCTTTATTTCA 环状引物2 (LB, 5'-3'): AACTCAGACGGGATTTGTT