中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3306.6—2016 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第6部分：黄热病毒 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port—Part 6: Yellow fever virus 2016-03-09发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2016-10-01实施 前言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》共分为6个部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌； 第5部分：布鲁氏菌； 第6部分：黄热病毒。 本部分为SN/T3306的第6部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、浙江省疾病预防控制中心。 本部分主要起草人：吕沁风、吴忠华、郑伟、罗鹏、徐琦、何蕾、李莉、周健青、沈若川、李禾、张严峻、陈寅、李洪波。 1 范围 SN/T3306的本部分规定了国境口岸黄热病毒环介导恒温扩增检测方法。本部分适用于国境口岸出境人员或医学媒介生物携带黄热病毒的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1243 国境口岸黄热病检验规程 SN/T1486 WS/T230 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件： AMV：鸟类骨髓母细胞瘤病毒（Avian myelocytoma virus） dNTP：脱氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate） EDTA：乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid） LAMP：环介导恒温核酸扩增（Loop-mediated isothermal amplification） RNA：核糖核酸（ribonucleic acid） Tris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris(hydroxymethyl)aminomethane·HCl] 4 生物安全要求 所有有关黄热病毒的实验室操作应按照以下规定执行： 黄热病毒病毒培养或动物感染实验在生物安全三级（BSL-3或ABSL-3）实验室内进行； 黄热病毒未经培养的感染材料的操作或灭活材料的操作在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行； 黄热病毒相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行； 黄热病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。 5 对象 5.1 疑似感染黄热病毒出境人员。 5.2 疑似携带黄热病毒的医学媒介生物。 6 技术概要 根据黄热病毒E基因保守序列设计内、外引物，识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在E基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，离心，即可通过白色沉淀是否产生观察判定结果。 7 试剂 在实验过程中需要以下试剂： 引物：位于黄热病毒E基因内（见附录A），组成如下： - 外引物1 (F3)：5'-TGGGAGAGGAGATTCACGT-3' - 外引物2 (B3)：5'-TCAAGCCGCCAAATAGCC-3' - 内引物1 (FIP)：5'-CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG-3' - 内引物2 (BIP)：5'-AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG-3' Bst DNA聚合酶：8 U/μL dNTPs：dATP、dGTP、dTTP、dCTP各10 mmol/L RNA提取试剂盒 Tris-HCl：500 mmol/L AMV逆转录酶：10 U/μL MgSO4：8 mmol/L 甜菜碱：8 mmol/L (NH4)2SO4：100 mmol/L KCl：500 mmol/L Tween-20：10% RNase抑制剂：40 U/μL 8 仪器设备 在实验过程中需要以下仪器设备