SN/T 3306.6-2016.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 6: Yellow fever virus.
1范围
SN/T 3306.6规定了国境口岸黄热病毒环介导恒温扩增检测方法。
SN/T 3306.6适用于国境口岸出入境人员或医学媒介生物携带黄热病毒的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注8期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1243国境口 岸黄热病检验规程
SN/T1486输人性蚊类携带的黄热病毒检测方法
WS/T230临床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AMV:鸟类骨髓母细胞瘤病毒(Avianmyelocytomavirus)
dNTP:脱氧核苷三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate)
EDTA:乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)
LAMP :环介导恒温核酸扩增(loop mediated isothermal amplification)
RNA:核糖核酸( ribonucleic acid)
Tris-HCl:三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[ tris (hydroxynethyl)aminomethane-HCI]
4生物安全要求
所有有关黄热病毒的实验室操作应按照以下规定执行:
一黄热病毒病毒培养或动物感染实验在生物安全三级(BSL-3或ABSL-3)实验室内进行;
一黄热病毒未经培养的感染材料 的操作或灭活材料的操作在生物安全二级(BSL-2)实验室内进行;

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.6—2016
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第6部分：黄热病毒
Loop-mediated isothermal amplificationdetectionmethodatfrontierport-Part6:Yellowfevervirus
2016-03-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-10-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP)检测方法》共分为6个部分第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
—第4部分：嗜肺军团菌；
一第5部分：布鲁氏菌；
一第6部分：黄热病毒
本部分为SN/T3306的第6部分
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3306.6—2016
本部分起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、浙江省疾病预防控制中心。本部分主要起草人：吕沁风、吴忠华、郑伟、罗鹏、徐琦、何蕾、李莉、周健青、沈若川、李禾、张严峻陈寅、李洪波。
1范围
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第6部分：黄热病毒
SN/T3306的本部分规定了国境口岸黄热病毒环介导恒温扩增检测方法。SN/T3306.6—2016
本部分适用于国境口岸出人境人员或医学媒介生物携带黄热病毒的筛选检测。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1243国境口岸黄热病检验规程SN/T1486
WS/T230
3缩略语
输人性蚊类携带的黄热病毒检测方法临床诊断中聚合酶链反应（PCR)技术的应用下列缩略语适用于本文件
AMV：鸟类骨髓母细胞瘤病毒（Avianmyelocytomairus）
dNTP：脱氧核苷三磷酸（
deoxyribonucleosidetriphosphate)EDTA：乙二胺四乙酸（ethylen
LAMP：环介导恒温核酸
扩增1
diamine tetraad
eticacid)
opmediatedisothermal
amplification)
RNA：核糖核酸（ribonucleicacidTris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[tris（hydroxymethyl)aminomethane-HCI]4
生物安全要求
所有有关黄热病毒的实验室操作应按照以下规定执行黄热病毒病毒培养或动物感染实验在生物安全三级（BSL-3或ABSL-3)实验室内进行；黄热病毒未经培养的感染材料的操作或灭活材料的操作在生物安全二级（BSL-2)实验室内进行；
黄热病毒相关的无感染性的材料操作在生物安全一级（BSL-1)实验室内进行；黄热病毒感染性材料运输包装分类为A类，UN编号为UN2814。5对象
疑似感染黄热病毒出人境人员。5.2
疑似携带黄热病毒的医学媒介生物。SN/T3306.6—2016
6技术概要
根据黄热病毒E基因保守序列设计内、外引物，识别靶序列上的六个独立区域，利用Bst DNA聚合酶启动循环链置换反应，在E基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁)形成乳白色沉淀，离心，即可通过白色沉淀是否产生观察判定结果。试剂
在实验过程中需要以下试剂：
引物：位于黄热病毒E基因内（见附录A），组成如下：外引物1(F3）：5-TGGGAGAGGAGATTCACGT-3；·
外引物2（B3)：5'-TCAAGCCGCCAAATAGCC-3'.
内引物1(FIP)：5'-CCACGCCTTTCATGGTCTGAGTTTACCAGTGGCACAAAGAGG-3;内引物2(BIP)：5-AGACACCGCCTGGGATTTYAGGCAGAGCCAAACACCGTATG-3'。BstDNA聚合酶：8U/μL。
-dNTPs：dATPdGTPdTTP、dCTP各1ommol/L。RNA提取试剂盒。
-Tris-HCl500mmol/L。
-AMV逆转录酶：10U/μL。
MgSO.:8mmol/L。
甜菜碱：8mmol/L。
(NH),SO4:100mmol/L。
KCl:500mmol/L。
Tween-20:10%。
-RNase抑制剂：40U/μL。
仪器设备
在实验过程中需要以下仪器设备：移液器：量程0.1μ2.5μ，量程1μ～10μ，量程10μ100μ，量程100μ~1000μL
高速台式离心机：≥10000g；
普通台式离心机；
水浴锅或加热模块；
-70℃超低温冰箱；
计时器。
检测程序
黄热病毒LAMP检测程序见图1。
操作步骤
标本的采集和RNA提取
待测标本
病毒核酸提取
LAMP反应
确认实验
传统方法复核
黄热病毒LAMP检测程序
SN/T3306.6—2016
标本采集和RNA提取按SN/T1243或SN/T1486操作，也可使用市售等效试剂盒。LAMP检测
反应体系
反应体系见表1。
引物F3
引物B3
引物FIP
引物BIP
BstDNA聚合酶
AMV逆转录酶
黄热病毒LAMP反应体系
工作液浓度
10μmol/L
10μmol/L
50μmol/L
50μmol/L
8U/μL
10U/μL
加样量/μL
反应体系终浓度
0.1μmol/L
0.1 μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
0.32U/μL
SN/T3306.6-—2016
RNase抑制剂
Tris-HCl
Tween-20
甜菜碱
模板/空白对照/阴性
对照/阳性对照
灭菌去离子水
工作液浓度
40U/μL
10mmol/L
500mmol/L
500mmol/L
100mmol/L
100mmol/L
8mmol/LwwW.bzxz.Net
表1（续）
加样量/ul
反应体系终浓度
1.4mmol/L
20mmol/L
10mmol/L
8mmol/L
8mmol/l
0.8mmol/L
模板根据提取的浓度可酌情加1ul～5μL，其他对照加样量为5μl补足至25μl
空白对照、阴性对照和阳性对照的设置每次实验均应设空白对照、阴性对照和阳性对照空白对照：以灭菌双蒸水替代核酸模板阴性对照：以核酸提取液替
代核酸模板
阳性对照：含靶序列的核酸作入为核酸模板
反应过程
10.2.3.1按表1配制反应体系，在对应编号的反应管中加人制备的核酸提取液，盖紧管盖，瞬时离心10s。防污染方法和措施按WS/T
230操作
63℃扩增60min
10.3结果观察
离心1200g，3min，观察白色
10.4结果判断和报告
10.4.1LAMP反应的质量控制
反应结果应同时符合以下两个条件，否则实验结果无效，应更换试剂重新检测：空白对照和阴性对照反应管离心后未见白色沉淀；阳性对照反应管离心后可见白色沉淀。10.4.2LAMP反应的结果判断和报告10.4.2.1
阳性：待检标本反应管离心后可见白色沉淀，报告为黄热病毒LAMP检测阳性。阴性：待检标本反应管离心后未见白色沉淀，报告为黄热病毒LAMP检测阴性，黄热病毒LAMP检测阳性，说明从该待测标本中检测到目的基因片段，提示可能有黄热病毒存在，如需确认应对该标本做进一步的分离鉴定，可按SN/T1243进行确认。4
附录A
（规范性附录）
黄热病毒靶基因序列
SN/T3306.6—2016
黄热病毒E基因序列（AccessionNo：GQ379162.1，位置：2107bp~2321bp）：2lo1 tatcgttggg agaggagatt cacgtctcac ttaccagtgg cacaaagagg gaagctcaat216l aggaaagttg ttcactcaga ccatgaaagg cgtggaacgc ctggccgtca tgggagacgt2221 cgcctgggat ttcagctccg ctggagggtt cttcacttcg gttgggaaag gaattcatac228l ggtgtttggc tctgccttte aggggctatt tggcggcttg aactggataa caaaggtcat5
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