SN/T 3306.3-2012
基本信息
标准号： SN/T 3306.3-2012
中文名称：国境口岸环介导恒温扩增(LAMP)检测方法第3部分:志贺氏菌
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：2049052
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3306.3-2012.Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontier port-Part 3:Shigella.
1范围
SN/T 3306.3规定了国境口岸检测疑似传染病的粪便样品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
SN/T 3306.3适用于国境口岸志贺氏菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T 230-2002临 床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
wS 287-2008 细 菌性和阿米巴性痢疾诊断标准
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bst酶:Bst DNA polymerase( large fragment),Bst DNA聚合酶(大片段)。
DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸
dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸，
LAMP: loop- mediated isothermal amplfication,环介导恒温扩增。
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全,应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测志贺氏菌,所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。
1范围
SN/T 3306.3规定了国境口岸检测疑似传染病的粪便样品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
SN/T 3306.3适用于国境口岸志贺氏菌的筛选检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB 19489实验室生物安 全通用要求
WS/T 230-2002临 床诊断中聚合酶链反应(PCR)技术的应用
wS 287-2008 细 菌性和阿米巴性痢疾诊断标准
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bst酶:Bst DNA polymerase( large fragment),Bst DNA聚合酶(大片段)。
DNA:deoxyribonucleic acid,脱氧核糖核酸
dNTP:deoxyribonucleoside triphosphate,脱氧核苷三磷酸，
LAMP: loop- mediated isothermal amplfication,环介导恒温扩增。
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全,应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测志贺氏菌,所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3306.3—2012
国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP)检测方法第3部分：志贺氏菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontierport-Part 3:Shigella
2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩散（LAMP)检测方法》共分为4部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌。
本部分为SN/T3306的第3部分、
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3306.3—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、正元盛邦（天津）生物科技有限公司。本部分主要起草人：左锋、柴宏森、李国鹏、杨春江、刘涛、祁军、谭绪良。1
1范围
SN/T3306.3—2012
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第3部分：志贺氏菌
SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似传染病的粪便样品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
本部分适用于国境口岸志贺氏菌的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS287-2008细菌性和阿米巴性痫疾诊断标准3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bst酶:BstDNApolymerase
edlarge
ragment)，BstDNA聚合酶（大片段）。DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTP:deoxyribonucleosidetriphosate，脱氧核苷三磷酸
LAMP：loop-mediatedisothermalamplification，环介导恒温扩增。4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测志贺氏菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施
防止污染措施应符合WS/T230的规定。6技术概要
根据志贺氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸1
SN/T3306.3—2012
根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据志贺氏菌属特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1,内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物1(F3,5-3):GTTCCTTGACCGCCTTTCC外引物2(B3,5'-3'):GAGGGTTTTCCGGAGATTGT内引物1(FIP,5'-3'):TTT CCAGCCATGCAG CGA CCGATACCGTCT CTGCACGC内引物2(BIP,5-3)：CTCTGCGGAGCTTCGACAGCTCCCACAGCTCTCAGTGG环状引物1(LF,5-3'):CACCTGACTGCTTTATTTCA环状引物2(LB,5'-3')：AACTCAGACGGGATTTGTTAGG7.2
Bst酶：8U/μL。
7.3dNTP:10mmol/L。
7.410XThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L(NH,),SO,、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100。5MgCl2:25mmol/L。
7.6甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000XSYBRGreenI。7.7
阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。仪器和设备
移液器：量程0.5μL~10uL，量程10μL～100μL，量程100μL~1000μ。8.27
高速台式离心机：≥7000g。
塑料离心管：1.5mL。
8.4水浴锅或加热模块。
5计时器。
检测程序
志贺氏菌LAMP检测程序见图1。
操作步骤
10.1样品前处理
待测样品
前处理后的样本、选性增菌液、培养后的可疑菌株细菌DNA提取
LAMP反应
结果观察
传统方法确认
志贺氏菌LAMP检测程序
SN/T3306.3—2012
10.1.1参照WS287—2008中A.1.2.1标本的收集进行样本采集。选取采集后的100mg固形样本或200μL液体样本充分混悬于1mL无菌水中，2000r/min离心，2min，去除离心沉淀，上清液用于模板DNA制备。
10.1.2参照WS287一2008中A.1.2.2病原分离进行增菌。增菌后选取可疑纯菌落一个，混悬于1mL无菌水中，用于模板DNA制备。10.2模板DNA的制备
10.2.1参照WS/T2302002中5.3样品的处理中的原则制备检测模板，可采用下述方法，也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，并按其说明提取制备模板DNA。10.2.2阳性对照制备：志贺菌标准菌株接种于营养肉汤中37℃培养过夜，将1mL培养液运用商品化的DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA，所提取的细菌基因组DNA经灭菌水稀释10°倍，约o.1μg/mL。
10.2.3前处理样本模板DNA的制备将10.1处理后的样本至于100℃水浴10min，12000r/min离心，2min，上清液即为模板DNA。SN/T3306.3—2012
10.3环介导恒温核酸扩增
10.3.1反应体系
志贺氏菌LAMP反应体系见表1。
缓冲液
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3)
内侧上游引物（FIP)
内侧下游引物（BIP)
环状上游引物(LF)
环状下游引物（LB)
甜菜碱
BstDNA聚合酶
DNA模板
去离子水
反应过程
志贺氏菌LAMP反应体系
工作液浓度
20μmol/L
20μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
10mmol/L
25mmol/L
5mol/L
8U/μL
按照表1所述配制反应体系。
加样量
于65℃恒温扩增1h，80℃2min使酶失活，反应即结束。空白对照、阴性对照、阳性对照设置10.3.3.1
每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以无菌水代替DNA模板。阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。10.4结果观察
反应体系终浓度
0.2μmol/LbZxz.net
0.2μmol/L
1.6μmol/L
1.6μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
1.4mmol/L
6.0mmol/L
0.16U/μL
在上述反应管中加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料SYBRGreen I。
结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体呈橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌a)
落进一步按WS287细菌性和阿米巴性疾诊断标准中的操作步骤进行确认后报告结果；阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则可报告检验结果为阴性。b)
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国境口岸环介导恒温扩增（LAMIP)检测方法第3部分：志贺氏菌
Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontierport-Part 3:Shigella
2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩散（LAMP)检测方法》共分为4部分：第1部分：鼠疫杆菌；
第2部分：产毒素霍乱弧菌；
第3部分：志贺氏菌；
第4部分：嗜肺军团菌。
本部分为SN/T3306的第3部分、
本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3306.3—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出人境检验检疫局、正元盛邦（天津）生物科技有限公司。本部分主要起草人：左锋、柴宏森、李国鹏、杨春江、刘涛、祁军、谭绪良。1
1范围
SN/T3306.3—2012
国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法第3部分：志贺氏菌
SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似传染病的粪便样品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增(LAMP)法。
本部分适用于国境口岸志贺氏菌的筛选检测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求WS/T230—2002临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用WS287-2008细菌性和阿米巴性痫疾诊断标准3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
Bst酶:BstDNApolymerase
edlarge
ragment)，BstDNA聚合酶（大片段）。DNA：deoxyribonucleicacid，脱氧核糖核酸dNTP:deoxyribonucleosidetriphosate，脱氧核苷三磷酸
LAMP：loop-mediatedisothermalamplification，环介导恒温扩增。4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测志贺氏菌，所有培养物和废弃物应参照GB19489中的有关规定执行。5防污染措施
防止污染措施应符合WS/T230的规定。6技术概要
根据志贺氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸1
SN/T3306.3—2012
根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加人显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。
试剂和材料
除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T6682中一级水的要求。7.1引物：根据志贺氏菌属特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1,内引物2和环状引物1,环状引物2。外引物1(F3,5-3):GTTCCTTGACCGCCTTTCC外引物2(B3,5'-3'):GAGGGTTTTCCGGAGATTGT内引物1(FIP,5'-3'):TTT CCAGCCATGCAG CGA CCGATACCGTCT CTGCACGC内引物2(BIP,5-3)：CTCTGCGGAGCTTCGACAGCTCCCACAGCTCTCAGTGG环状引物1(LF,5-3'):CACCTGACTGCTTTATTTCA环状引物2(LB,5'-3')：AACTCAGACGGGATTTGTTAGG7.2
Bst酶：8U/μL。
7.3dNTP:10mmol/L。
7.410XThermoPol缓冲液：含200mmol/LTris-HCl(pH8.8)、100mmol/L(NH,),SO,、100mmol/LKCl、20mmol/LMgSO4、1%TritonX-100。5MgCl2:25mmol/L。
7.6甜菜碱：5mol/L。
显色液：浓度为1000XSYBRGreenI。7.7
阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。仪器和设备
移液器：量程0.5μL~10uL，量程10μL～100μL，量程100μL~1000μ。8.27
高速台式离心机：≥7000g。
塑料离心管：1.5mL。
8.4水浴锅或加热模块。
5计时器。
检测程序
志贺氏菌LAMP检测程序见图1。
操作步骤
10.1样品前处理
待测样品
前处理后的样本、选性增菌液、培养后的可疑菌株细菌DNA提取
LAMP反应
结果观察
传统方法确认
志贺氏菌LAMP检测程序
SN/T3306.3—2012
10.1.1参照WS287—2008中A.1.2.1标本的收集进行样本采集。选取采集后的100mg固形样本或200μL液体样本充分混悬于1mL无菌水中，2000r/min离心，2min，去除离心沉淀，上清液用于模板DNA制备。
10.1.2参照WS287一2008中A.1.2.2病原分离进行增菌。增菌后选取可疑纯菌落一个，混悬于1mL无菌水中，用于模板DNA制备。10.2模板DNA的制备
10.2.1参照WS/T2302002中5.3样品的处理中的原则制备检测模板，可采用下述方法，也可使用等效的商品化DNA提取试剂盒，并按其说明提取制备模板DNA。10.2.2阳性对照制备：志贺菌标准菌株接种于营养肉汤中37℃培养过夜，将1mL培养液运用商品化的DNA提取试剂盒提取的细菌基因组DNA，所提取的细菌基因组DNA经灭菌水稀释10°倍，约o.1μg/mL。
10.2.3前处理样本模板DNA的制备将10.1处理后的样本至于100℃水浴10min，12000r/min离心，2min，上清液即为模板DNA。SN/T3306.3—2012
10.3环介导恒温核酸扩增
10.3.1反应体系
志贺氏菌LAMP反应体系见表1。
缓冲液
外侧上游引物（F3）
外侧下游引物（B3)
内侧上游引物（FIP)
内侧下游引物（BIP)
环状上游引物(LF)
环状下游引物（LB)
甜菜碱
BstDNA聚合酶
DNA模板
去离子水
反应过程
志贺氏菌LAMP反应体系
工作液浓度
20μmol/L
20μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
100μmol/L
10mmol/L
25mmol/L
5mol/L
8U/μL
按照表1所述配制反应体系。
加样量
于65℃恒温扩增1h，80℃2min使酶失活，反应即结束。空白对照、阴性对照、阳性对照设置10.3.3.1
每次反应应设置阴性对照、空白对照和阳性对照。空白对照以无菌水代替DNA模板。阴性对照以DNA提取液代替DNA模板。10.4结果观察
反应体系终浓度
0.2μmol/LbZxz.net
0.2μmol/L
1.6μmol/L
1.6μmol/L
0.8μmol/L
0.8μmol/L
1.4mmol/L
6.0mmol/L
0.16U/μL
在上述反应管中加入2μL显色液，轻轻混匀并在黑色背景下观察。显色液优选为荧光染料SYBRGreen I。
结果判定
在空白对照和阴性对照反应管液体呈橙色，阳性对照反应管液体呈绿色的条件下：阳性结果：待检样品反应管液体呈绿色，该样品结果为初筛阳性，对样品的增菌液或可疑纯菌a)
落进一步按WS287细菌性和阿米巴性疾诊断标准中的操作步骤进行确认后报告结果；阴性结果：待检样品反应管液体呈橙色，则可报告检验结果为阴性。b)
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