中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3306.3—2012 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第3部分：志贺氏菌 Loop-mediated isothermal amplification detection method at frontierport—Part 3: Shigella 2012-12-12 发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2013-07-01 实施 前言 SN/T3306《国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法》共分为4部分： 第1部分：鼠疫杆菌； 第2部分：产毒素霍乱弧菌； 第3部分：志贺氏菌； 第4部分：嗜肺军团菌。 本部分为SN/T3306的第3部分。 本部分按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本部分起草单位：中华人民共和国天津出入境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、正元盛邦（天津）生物科技有限公司。本部分主要起草人：左锋、柴宏森、李国鹏、杨春江、刘涛、祁军、谭绪良。 1 范围 SN/T3306.3—2012 国境口岸环介导恒温扩增（LAMP）检测方法 第3部分：志贺氏菌 SN/T3306的本部分规定了国境口岸检测疑似传染病的粪便样品中志贺氏菌的环介导恒温核酸扩增（LAMP）法。本部分适用于国境口岸志贺氏菌的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室生物安全通用要求 WS/T 230—2002 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 WS 287-2008 细菌性和阿米巴性痢疾诊断标准 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 Bst酶：Bst DNA polymerase (large fragment)，Bst DNA 聚合酶（大片段）。 DNA：deoxyribonucleic acid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonucleoside triphosphate，脱氧核苷三磷酸。 LAMP：loop-mediated isothermal amplification，环介导恒温扩增。 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由通过生物安全培训并具备资质的工作人员检测志贺氏菌，所有培养物和废弃物应参照GB 19489中的有关规定执行。 5 防污染措施 防止污染措施应符合WS/T 230的规定。 6 技术概要 根据志贺氏菌的特异性序列基因设计特异性内引物、外引物各一对，或再增加环状引物一对，特异性识别靶序列上的独立区域，利用Bst酶启动循环链置换反应，在特异性基因序列启动互补链合成，在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物；从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物（焦磷酸镁）形成乳白色沉淀，加入显色液，即可通过颜色变化观察判定结果。 7 试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求。 7.1 引物：根据志贺氏菌属特有的靶序列基因设计一套特异性引物，包括外引物1，外引物2，内引物1，内引物2和环状引物1，环状引物2。 外引物1 (F3, 5'-3'): GTTCCTTGACCGCCTTTCC 外引物2 (B3, 5'-3'): GAGGGTTTTCCGGAGATTGT 内引物1 (FIP, 5'-3'): TTT CCAGCCATGCAG CGA CCGATACCGTCT CTGCACGC 内引物2 (BIP, 5'-3'): CTCTGCGGAGCTTCGACAGCTCCCACAGCTCTCAGTGG 环状引物1 (LF, 5'-3'): CACCTGACTGCTTTATTTCA 环状引物2 (LB, 5'-3'): AACTCAGACGGGATTTGTTAGG 7.2 Bst酶：8 U/μL。 7.3 dNTP：10 mmol/L。 7.4 10X ThermoPol缓冲液：含200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)、100 mmol/L (NH4)2SO4、100 mmol/L KCl、20 mmol/L MgSO4、1% Triton X-100。 7.5 MgCl2：25 mmol/L。 7.6 甜菜碱：5 mol/L。 7.7 显色液：浓度为 1000X SYBR Green I。 7.8 阳性对照：可溯源的标准菌株，或含目的片段的DNA亦可。 8 仪器和设备 8.1 移液器：