中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3393—2012 国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法 多重引物悬浮芯片法 Rapid simultaneous screen method of five bio-terrorism bacteria at frontier port—Gene suspension array with multiple primers on genus level 2012-12-12发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2013-07-01实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：韩辉、杨宇、杨永莉、王静、文海燕、赵婷婷、王旺。 1 范围 本标准规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌基因悬浮芯片的检测方法。本标准适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种重要生物恐怖相关细菌的多重检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1552 国境口岸生物因子信息事件监测规程 WS 233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 生物恐怖病原菌 (bio-terrorism bacteria)：可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低、毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；其在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。 3.2 基因悬浮芯片 (gene suspension array)：也称液相基因芯片，是利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸等生物分子进行大规模测定的一种生物芯片技术。 4 生物安全防护要求 4.1 排查前做好个人防护。防护方法和标准见 SN/T 1552。 4.2 实验室应遵循 GB 19489 和 WS 233 对生物安全Ⅱ级（BSL-2）实验室的生物安全要求。 4.3 使用过的实验用品应遵照 GB 19489 的要求，对废弃物应进行无害化处理。 5 主要设备与试剂 5.1 主要设备 悬浮芯片系统（Bio-Plex）、显微镜（10X～100X）、离心机、PCR仪、生物安全柜、移液器（0.5μL～1000μL）、核酸蛋白检测仪、真空泵、抽滤装置、旋涡混合仪、恒温振荡器、细胞计数器。 5.2 主要试剂 羧基化编码微球、氯化四甲铵（TMAC）、2-(N-吗啉乙基)磺酸（2-(N-Morpholinoethanesulfonic acid), MES）、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐 [N-(3-Dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide, EDC]、碳化二亚胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、N-月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl）、链亲和素-藻红蛋白（SA-PE）、蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、NaCl、无水乙醇、70%乙醇、Tris饱和酚溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、三氯甲烷、异戊醇、Tween-20、DNA提取试剂盒。相关缓冲溶液配制见附录A。 6 检测方法 6.1 样品采集 依 SN/T 1552 执行。 6.2 细菌DNA提取 6.2.1 取0.1g可疑粉末状样品加500μL PBS，10000g离心3min；取上清液于一新的离心管中12000g离心1min，弃去上清液，沉淀用PBS洗涤3次后，向每管样本中加入500μL TE，用吸管反复吸打混匀，使沉淀重悬，加入30μL 10%SDS和4μL（20mg/mL）蛋白酶K，混匀于37℃温育2h。 6.2.2 加入100μL 5mol/L NaCl，充分混匀，加入80μL CTAB/NaCl（5%质量浓度）混匀于65℃温育10min。 6.2.3 加入700μL Tris饱和酚，混匀，12000g离心8min，将上清液转入一个新离心管中。 6.2.4 在上清液中加入700μL Tris饱和酚，混匀，12000g离心8min。