SN/T 3393-2012
基本信息
标准号： SN/T 3393-2012
中文名称：国境口岸五种生物恐怖病原菌快速筛查方法多重引物悬浮芯片法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：3053346
相关标签： 国境 口岸 五种 生物 病原菌 快速 筛查 方法 多重 悬浮 芯片
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3393-2012.Rapid simultaneous screen method of five bio-terrorism bacteria at frontier port-Gene suspension array with multiple primers on genus level.
1范围
SN/T 3393规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌基因悬浮芯片的检测方法
SN/T 3393适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌.布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种重要生物恐怖相关细菌的多重检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1552国境 口岸生物因子恐怖事件监测规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1生物恐怖病原菌bio-terrorism bacteria
可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌,主要包括炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高;传染性强,可通过不同途径感染人体;其在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。
1范围
SN/T 3393规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌基因悬浮芯片的检测方法
SN/T 3393适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌.布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种重要生物恐怖相关细菌的多重检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注8期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1552国境 口岸生物因子恐怖事件监测规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1生物恐怖病原菌bio-terrorism bacteria
可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌,主要包括炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高;传染性强,可通过不同途径感染人体;其在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3393—2012
国境口岸五种生物恐怖病原菌
快速筛查方法
多重引物悬浮芯片法
Rapid simultaneous screen method of five bio-terrorism bacteria at frontier port-Gene suspension array with multiple primers on genus level2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3393—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局。本标准主要起草人：韩辉、杨宇、杨永莉、王静、文海燕、赵婷婷、王旺。I
1范围
国境口岸五种生物恐怖病原菌
快速筛查方法
多重引物悬浮芯片法
SN/T3393—2012
本标准规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌基因悬浮芯片的检测方法。本标准适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种重要生物恐怖相关细菌的多重检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1552国境口岸生物因子忍饰事件监测规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
生物恐怖病原菌bio-terrorismbacteria可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低、毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；其在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。
基因悬浮芯片genesuspensionarray也称液相基因芯片，是利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸等生物分子进行大规模测定的一种生物芯片技术。生物安全防护要求
4.1排查前做好个人防护。防护方法和标准见SN/T1552。4.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全Ⅱ级（BSL-2)实验室的生物安全要求。1
SN/T3393—2012
使用过的实验用品应遵照GB19489的要求，对废弃物应进行无害化处理。5主要设备与试剂
5.1主要设备
悬浮芯片系统（Bio-Plex）1、显微镜（10X～100X）、离心机、PCR仪、生物安全柜、移液器（0.5uL～1000L）、核酸蛋白检测仪、真空泵、抽滤装置、旋涡混合仪、恒温振荡器、细胞计数器。5.2主要试剂
羧基化编码微球、氯化四甲铵（TMAC）、2LN-吗琳|乙磺酸（2N-MorpholinoethanesulfonicacidMES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐［N-（3-Dimethylaminopropyl）-Nethylcarbodiimide，EDC)、碳化二亚胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、N-月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl）、链亲和素-藻红蛋白（SA-PE）、蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、NaCI、无水乙醇、70%乙醇、Tris饱和酚溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、三氯甲烷、异戊醇、Tween-20、DNA提取试剂盒。相关缓冲溶液配制见附录A。
6检测方法
6.1样品采集
依SN/T1552执行。
6.2细菌DNA提取
6.2.1取0.1g可疑粉末状样品加500μLPBS,10000g离心3min；取上清液于一新的离心管中12000g离心1min，弃去上清液，沉淀用PBS洗涤3次后，向每管样本中加入500μLTE用吸管反复吸打混匀，使沉淀重悬，加入30μL10%SDS和4μL（20mg/mL）蛋白酶K，混勾于37℃温育2h。6.2.2加人100μL5mol/LNaCl，充分混匀，加人80μLCTAB/NaCI(5%质量浓度）混匀于65℃温育10min。
6.2.3加人700μLTris饱和酚，混匀12000g离心8min，将上清液转人一个新离心管中。6.2.4在上清液中加人700μLTris饱和酚，混勾12000g离心8min，将上清液转人一个新离心管中。6.2.5在上清液中加人700μL三氯甲烷/异戊醇（24/1，体积比），混匀12000g离心8min，将上清液转人一个新离心管中。
6.2.6重复6.2.5。
6.2.7在上清液中加人1mL无水乙醇，来回颠倒4～5次，置于-20℃静置30min，15600g离心20min，离心后弃上清液。
6.2.8沉淀中加人400uL70%乙醇，颠倒45次，12000g离心1min，弃上清液，将离心管置于灭菌的滤纸上，使乙醇挥发完，
6.2.9最后将沉淀溶于50μLTE中，一20℃保存备用注：本标准推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同提取DNA试剂盒。1）由美国伯乐公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2
6.3PCR扩增
SN/T3393—2012
扩增引物序列见附录B中B.1，下游引物5'端生物素修饰，反应体系见附录B.2为30μL。反应条件为预变性94℃10min，32个循环（94℃30s，58℃30s，72℃40s），延伸72℃10min，4℃保存。同时应设置阳性对照、本底对照以水代替样品模板DNA。注：本文件以takara公司PCR反应体系为例，也可以使用等效的PCR试剂。6.4探针与羧化微球的偶联
6.4.1探针（序列见B.3)的5'端连上20个poly(T)，氨基化修饰，与羧基化微球偶联。将氨基化修饰的寡核苷酸探针重悬于超纯水中使其终浓度为1mmol/L。6.4.2将1mL包装中的小球振荡30s，超声30s，至将小球打散，6.4.3取100μL小球至1.5mL离心管，14000g离心4min，小心吸出上清液。6.4.4微球重悬于50μLpH4.5的0.1mol/LMES中，振荡20s，超声20s。6.4.5用超纯水将6.4.1的寡核苷酸探针10倍稀释，取2μL10倍稀释的探针加于6.4.4的小球悬浮液中，振荡混匀。
6.4.6向6.4.5的离心管中加人2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀。置旋涡混匀仪上，室温（18℃~25℃）避光孵育30min。6.4.7重复6.4.6。
反应结束后，将6.4.7的离心管14000g离心4min，小心吸弃上清液。加人1mL0.02%Tween-20，14000g离心4min，小心吸弃上清液。6.4.10
加人1mL0.1%SDS，14000g离心4min，吸弃上清液。加人100μLpH8.0TE缓冲溶液，振荡10s，超声10s，使微球重悬。用细胞计数器计数后4℃保存备用。6.5偶联微球的质控
合成与探针互补的寡核苷酸链，寡核苷酸链5”端生物素标记。6.5.1
用旋涡混合仪充分振荡已经偶联好的编码微球6.5.2bzxZ.net
吸取适量微球，用1.5×TMAC缓冲溶液稀释至3500个/33μL，置于0.2mL离心管中。稀释与探针互补的寡核苷酸链至0.1μmol/L。向各管中加人1μL上述寡核苷酸溶液以及16μLTE溶液使其终体积为50μL，吹打混匀。95℃变性10min。
55℃杂交15min。
转移至滤板抽滤去掉未结合的核苷酸链。再向各孔加75μL含4ngSA-PE的1×TMAC缓冲溶液，室温（18℃~25℃）避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE。再向各孔加人75μLXTMAC缓冲溶液，振荡使微球重悬。6.5.10
反应结束后上机检测。
结果判定：偶联的微球的MFI值大于2000则说明包被成功，可用于以下实验。6.6杂交
6.6.1取偶联探针的微球各3500个混于33μL1.5×TMAC缓冲溶液中，置于0.2μL离心管中。6.6.2向各管中加5μL~17μL检测样品模板的PCR产物使其终体积为50μL，吹打混匀6.6.3
95℃变性10min，55℃杂交15min，转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物及其液体。3
SN/T3393—2012
6.6.4向各孔加75μL4ng/μLSA-PE的1×TMAC缓冲溶液，室温避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE及其液体。
5向各孔加人75μL1×TMAC缓冲溶液，振荡使微球重悬。6.6.5
6.7检测
按操作说明上机检测，同时以PCR本底对照进行杂交检测做为检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值（MedianFluorescenceIntensity，MFI)，亦即读取的这种编号的微球群（100个或以上）的每个微球信号强度的统计平均值。通过悬浮芯片系统读取各孔荧光值（MFI）以及本底对照荧光值（Backgroun6.8结果判定
分研处理效据
待检样品荧光值大于本底对照荧光值3倍时，结果判为阳性即检测出有相应细菌。6.8.1
2待检样品荧光值小于本底对照荧光值3倍时，结果判为阴性，即没有检测出相应细菌。6.8.2
A.1PCR反应液
附录A
（规范性附录）
培养基、溶液配制
TagHS，dNTPMixture，oPCR缓冲液，Mg+。A.21.5×TMAC缓冲溶液
4.5mol/LTMAC0.15%Sarko
A.31×TMAC缓冲溶液
3mol/LTMAC,o.1%Sarkosyl.50mmol/LA.4PBS(pH7.4)
SN/T3393—2012
ris-HCIpH8.0.6mmol/LEDTApH8.0。ris-HCLpH8.0.4mmol/LEDTApH8.0。NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L;NazHPO410mmol/L,KHzPO,2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl,0.2gKCl1.44gNaHPO和0.24gKH.PO.用HCI调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在121℃高压灭菌20min，或过滤除菌·保存于室温TE缓冲液
LEDTAPH8.0。
10mmol/LTris-ClpH7.5,1mmol/
A.6CTAB/NaCI溶液（5%质量浓度2.5gCTAB溶于50mL0.5mol/LNaCI溶液中，加热到65℃使之溶解，然后至室温保存。5
SN/T3393—2012
附录B
（规范性附录）
引物及探针
B.1五种生物恐怖细菌检测体系多重PCR引物序列炭疽芽胞杆菌（Bacillusanthracis）、鼠疫耶尔森菌（Yersiniapestis）、布鲁菌（Brucellaspp.）、土拉弗朗西斯菌（Francisellatularensis）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei）五种细菌检测体系多重PCR引物序列见B.1。表B.1
炭疽芽胞杆菌
布鲁菌
土拉弗朗西斯菌
鼠疫耶尔森菌
类鼻疽伯克霍尔
Ba-1-F
Ba-1-R
Ba-2-F
Ba-2-R
五种生物恐细菌检测体系多重PCR引物序列序列（5\-3\）
TGGACGCATACGAGACATAAT
TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG
TTTCATAATCATGGATTTCCCG
TTACCCAACATCATCTTCGCA
TGGCTCGGTTGCCAATATCAA
GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG
GGGCAAATCTAGCAGGTCAAG
GCTGTAGTCGCACCATTATCCT
ACTCAATGTTGTGACGAGGATG
TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC
CGATCTCGTCAAGGTGTCGG
CCCCAGTTCATCTGATACTTGC
注：各下游引物5'端进行生物素修饰B.2
多重PCR体系
多重PCR体系见表B.2。
体系组成
10×PCR缓冲液
Ba-1-F,Ba-1-R
多重PCR体系
加人量
靶基因
质粒pOx2
染色体
BUSP31
染色体
染色体
引物长度
终浓度
200μmol/L
1.5mmol/L
100nmol/L
产物大小(bp)
体系组成
Ba-2-F,Ba-2-R
Yp-F,Yp-R
Ft-F.Ft-R
Bp-F,Bp-R
Bru-F,Bru-R
模板DNA
五因子多重检测体系探针序列
表B.2（续）
加人量
Upto30μL
检测五种细菌的多重检测体系探针序列见表B.3。表B.3
探针名称
五因子多重检测体系探针序列
探针位置
bp415-437 of Bacillus anthracis str.A2012 plasmidpX02capB
bp742-764 of Bacillus anthracis str.'Ames AncestorAE017334
bp181-205 of Yersinia pestis CO92 YPO2091bp842-864ofB.abortusBCSP31
bp989-1012 of Francisella tularensis ferredoxin (fdx)bp209-231of Burkholderia pseudomallei 1106achromosomeII
SN/T3393—2012
终浓度
100nmol/L
100nmol/L
80nmol/L
80nmol/L
120nmol/L
探针序列（5*-3\）
GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT
CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC
AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA
TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT
TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG
AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT
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国境口岸五种生物恐怖病原菌
快速筛查方法
多重引物悬浮芯片法
Rapid simultaneous screen method of five bio-terrorism bacteria at frontier port-Gene suspension array with multiple primers on genus level2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3393—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局。本标准主要起草人：韩辉、杨宇、杨永莉、王静、文海燕、赵婷婷、王旺。I
1范围
国境口岸五种生物恐怖病原菌
快速筛查方法
多重引物悬浮芯片法
SN/T3393—2012
本标准规定了国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌基因悬浮芯片的检测方法。本标准适用于国境口岸可疑粉末状样品中炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌五种重要生物恐怖相关细菌的多重检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1552国境口岸生物因子忍饰事件监测规程WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
生物恐怖病原菌bio-terrorismbacteria可用于生物恐怖袭击的危害人体健康的病原细菌，主要包括炭疽芽胞杆菌、鼠疫耶尔森菌、布鲁菌、土拉弗朗西斯菌和类鼻疽伯克霍尔德菌等，其特点是感染剂量低、毒性高、致病性强，感染后潜伏期短、发病率高；传染性强，可通过不同途径感染人体；其在外环境中稳定性好，易于生产、保存、包装、运输和释放。
基因悬浮芯片genesuspensionarray也称液相基因芯片，是利用带编码的微球体作为载体，流式细胞仪作为检测平台，对核酸等生物分子进行大规模测定的一种生物芯片技术。生物安全防护要求
4.1排查前做好个人防护。防护方法和标准见SN/T1552。4.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全Ⅱ级（BSL-2)实验室的生物安全要求。1
SN/T3393—2012
使用过的实验用品应遵照GB19489的要求，对废弃物应进行无害化处理。5主要设备与试剂
5.1主要设备
悬浮芯片系统（Bio-Plex）1、显微镜（10X～100X）、离心机、PCR仪、生物安全柜、移液器（0.5uL～1000L）、核酸蛋白检测仪、真空泵、抽滤装置、旋涡混合仪、恒温振荡器、细胞计数器。5.2主要试剂
羧基化编码微球、氯化四甲铵（TMAC）、2LN-吗琳|乙磺酸（2N-MorpholinoethanesulfonicacidMES）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐［N-（3-Dimethylaminopropyl）-Nethylcarbodiimide，EDC)、碳化二亚胺、十二烷基硫酸钠（SDS）、N-月桂酰肌氨酸钠（Sarkosyl）、链亲和素-藻红蛋白（SA-PE）、蛋白酶K、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、NaCI、无水乙醇、70%乙醇、Tris饱和酚溴代十六烷基三甲胺（CTAB）、三氯甲烷、异戊醇、Tween-20、DNA提取试剂盒。相关缓冲溶液配制见附录A。
6检测方法
6.1样品采集
依SN/T1552执行。
6.2细菌DNA提取
6.2.1取0.1g可疑粉末状样品加500μLPBS,10000g离心3min；取上清液于一新的离心管中12000g离心1min，弃去上清液，沉淀用PBS洗涤3次后，向每管样本中加入500μLTE用吸管反复吸打混匀，使沉淀重悬，加入30μL10%SDS和4μL（20mg/mL）蛋白酶K，混勾于37℃温育2h。6.2.2加人100μL5mol/LNaCl，充分混匀，加人80μLCTAB/NaCI(5%质量浓度）混匀于65℃温育10min。
6.2.3加人700μLTris饱和酚，混匀12000g离心8min，将上清液转人一个新离心管中。6.2.4在上清液中加人700μLTris饱和酚，混勾12000g离心8min，将上清液转人一个新离心管中。6.2.5在上清液中加人700μL三氯甲烷/异戊醇（24/1，体积比），混匀12000g离心8min，将上清液转人一个新离心管中。
6.2.6重复6.2.5。
6.2.7在上清液中加人1mL无水乙醇，来回颠倒4～5次，置于-20℃静置30min，15600g离心20min，离心后弃上清液。
6.2.8沉淀中加人400uL70%乙醇，颠倒45次，12000g离心1min，弃上清液，将离心管置于灭菌的滤纸上，使乙醇挥发完，
6.2.9最后将沉淀溶于50μLTE中，一20℃保存备用注：本标准推荐上述核酸提取方法，也可以使用其他效果相同提取DNA试剂盒。1）由美国伯乐公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2
6.3PCR扩增
SN/T3393—2012
扩增引物序列见附录B中B.1，下游引物5'端生物素修饰，反应体系见附录B.2为30μL。反应条件为预变性94℃10min，32个循环（94℃30s，58℃30s，72℃40s），延伸72℃10min，4℃保存。同时应设置阳性对照、本底对照以水代替样品模板DNA。注：本文件以takara公司PCR反应体系为例，也可以使用等效的PCR试剂。6.4探针与羧化微球的偶联
6.4.1探针（序列见B.3)的5'端连上20个poly(T)，氨基化修饰，与羧基化微球偶联。将氨基化修饰的寡核苷酸探针重悬于超纯水中使其终浓度为1mmol/L。6.4.2将1mL包装中的小球振荡30s，超声30s，至将小球打散，6.4.3取100μL小球至1.5mL离心管，14000g离心4min，小心吸出上清液。6.4.4微球重悬于50μLpH4.5的0.1mol/LMES中，振荡20s，超声20s。6.4.5用超纯水将6.4.1的寡核苷酸探针10倍稀释，取2μL10倍稀释的探针加于6.4.4的小球悬浮液中，振荡混匀。
6.4.6向6.4.5的离心管中加人2.5μL新鲜配制的10mg/mL的EDC溶液，振荡混匀。置旋涡混匀仪上，室温（18℃~25℃）避光孵育30min。6.4.7重复6.4.6。
反应结束后，将6.4.7的离心管14000g离心4min，小心吸弃上清液。加人1mL0.02%Tween-20，14000g离心4min，小心吸弃上清液。6.4.10
加人1mL0.1%SDS，14000g离心4min，吸弃上清液。加人100μLpH8.0TE缓冲溶液，振荡10s，超声10s，使微球重悬。用细胞计数器计数后4℃保存备用。6.5偶联微球的质控
合成与探针互补的寡核苷酸链，寡核苷酸链5”端生物素标记。6.5.1
用旋涡混合仪充分振荡已经偶联好的编码微球6.5.2bzxZ.net
吸取适量微球，用1.5×TMAC缓冲溶液稀释至3500个/33μL，置于0.2mL离心管中。稀释与探针互补的寡核苷酸链至0.1μmol/L。向各管中加人1μL上述寡核苷酸溶液以及16μLTE溶液使其终体积为50μL，吹打混匀。95℃变性10min。
55℃杂交15min。
转移至滤板抽滤去掉未结合的核苷酸链。再向各孔加75μL含4ngSA-PE的1×TMAC缓冲溶液，室温（18℃~25℃）避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE。再向各孔加人75μLXTMAC缓冲溶液，振荡使微球重悬。6.5.10
反应结束后上机检测。
结果判定：偶联的微球的MFI值大于2000则说明包被成功，可用于以下实验。6.6杂交
6.6.1取偶联探针的微球各3500个混于33μL1.5×TMAC缓冲溶液中，置于0.2μL离心管中。6.6.2向各管中加5μL~17μL检测样品模板的PCR产物使其终体积为50μL，吹打混匀6.6.3
95℃变性10min，55℃杂交15min，转移至滤板抽滤去掉未结合的PCR产物及其液体。3
SN/T3393—2012
6.6.4向各孔加75μL4ng/μLSA-PE的1×TMAC缓冲溶液，室温避光孵育10min，抽滤去掉未结合的SA-PE及其液体。
5向各孔加人75μL1×TMAC缓冲溶液，振荡使微球重悬。6.6.5
6.7检测
按操作说明上机检测，同时以PCR本底对照进行杂交检测做为检测本底，仪器输出的数据是相应反应体系内一种编号微球群的荧光强度中位值（MedianFluorescenceIntensity，MFI)，亦即读取的这种编号的微球群（100个或以上）的每个微球信号强度的统计平均值。通过悬浮芯片系统读取各孔荧光值（MFI）以及本底对照荧光值（Backgroun6.8结果判定
分研处理效据
待检样品荧光值大于本底对照荧光值3倍时，结果判为阳性即检测出有相应细菌。6.8.1
2待检样品荧光值小于本底对照荧光值3倍时，结果判为阴性，即没有检测出相应细菌。6.8.2
A.1PCR反应液
附录A
（规范性附录）
培养基、溶液配制
TagHS，dNTPMixture，oPCR缓冲液，Mg+。A.21.5×TMAC缓冲溶液
4.5mol/LTMAC0.15%Sarko
A.31×TMAC缓冲溶液
3mol/LTMAC,o.1%Sarkosyl.50mmol/LA.4PBS(pH7.4)
SN/T3393—2012
ris-HCIpH8.0.6mmol/LEDTApH8.0。ris-HCLpH8.0.4mmol/LEDTApH8.0。NaCl137mmol/L,KCl2.7mmol/L;NazHPO410mmol/L,KHzPO,2mmol/L。用800mL蒸馏水溶解8gNaCl,0.2gKCl1.44gNaHPO和0.24gKH.PO.用HCI调节溶液的pH值至7.4，加水至1L。分装后在121℃高压灭菌20min，或过滤除菌·保存于室温TE缓冲液
LEDTAPH8.0。
10mmol/LTris-ClpH7.5,1mmol/
A.6CTAB/NaCI溶液（5%质量浓度2.5gCTAB溶于50mL0.5mol/LNaCI溶液中，加热到65℃使之溶解，然后至室温保存。5
SN/T3393—2012
附录B
（规范性附录）
引物及探针
B.1五种生物恐怖细菌检测体系多重PCR引物序列炭疽芽胞杆菌（Bacillusanthracis）、鼠疫耶尔森菌（Yersiniapestis）、布鲁菌（Brucellaspp.）、土拉弗朗西斯菌（Francisellatularensis）和类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderiapseudomallei）五种细菌检测体系多重PCR引物序列见B.1。表B.1
炭疽芽胞杆菌
布鲁菌
土拉弗朗西斯菌
鼠疫耶尔森菌
类鼻疽伯克霍尔
Ba-1-F
Ba-1-R
Ba-2-F
Ba-2-R
五种生物恐细菌检测体系多重PCR引物序列序列（5\-3\）
TGGACGCATACGAGACATAAT
TGCTTTAGCGGTAGCAGAGG
TTTCATAATCATGGATTTCCCG
TTACCCAACATCATCTTCGCA
TGGCTCGGTTGCCAATATCAA
GCGCTTGCCTTTCAGGTCTG
GGGCAAATCTAGCAGGTCAAG
GCTGTAGTCGCACCATTATCCT
ACTCAATGTTGTGACGAGGATG
TTACTTCTAATGCCATCAGGTAGC
CGATCTCGTCAAGGTGTCGG
CCCCAGTTCATCTGATACTTGC
注：各下游引物5'端进行生物素修饰B.2
多重PCR体系
多重PCR体系见表B.2。
体系组成
10×PCR缓冲液
Ba-1-F,Ba-1-R
多重PCR体系
加人量
靶基因
质粒pOx2
染色体
BUSP31
染色体
染色体
引物长度
终浓度
200μmol/L
1.5mmol/L
100nmol/L
产物大小(bp)
体系组成
Ba-2-F,Ba-2-R
Yp-F,Yp-R
Ft-F.Ft-R
Bp-F,Bp-R
Bru-F,Bru-R
模板DNA
五因子多重检测体系探针序列
表B.2（续）
加人量
Upto30μL
检测五种细菌的多重检测体系探针序列见表B.3。表B.3
探针名称
五因子多重检测体系探针序列
探针位置
bp415-437 of Bacillus anthracis str.A2012 plasmidpX02capB
bp742-764 of Bacillus anthracis str.'Ames AncestorAE017334
bp181-205 of Yersinia pestis CO92 YPO2091bp842-864ofB.abortusBCSP31
bp989-1012 of Francisella tularensis ferredoxin (fdx)bp209-231of Burkholderia pseudomallei 1106achromosomeII
SN/T3393—2012
终浓度
100nmol/L
100nmol/L
80nmol/L
80nmol/L
120nmol/L
探针序列（5*-3\）
GAAGAACGCAGGCTTAGATTGGT
CTCGCTTTCATCGCATTTCTCCC
AACAGTAAGCATCCAGTCGTTCATA
TTACGCAGTCAGACGTTGCCTAT
TGCTGGTTTAACATGGTTCTTTGG
AGGTCAATTTCCCGAACAAGACT
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