SN/T3423—2012 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Phomopsis sclerotioides van Kesteren 2012-12-12发布 2013-07-01实施 发布单位：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草，由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中国计量学院。 主要起草人：张慧丽、张建成、陈先锋、徐瑛、杨红霞、商晗武、郑炜。 1 范围 本标准规定了黄瓜黑色根腐病菌（Phomopsis sclerotioides van Kesteren）的检疫鉴定方法，适用于黄瓜及其寄主植物的植株和种子上的检疫鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本标准的应用是必不可少的，注日期的引用文件仅适用于注日期版本，未注日期文件适用最新版本，包括所有修改单。 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 术语和定义 3.1 假子座（pseudostroma） 由菌组织和寄主植物组织结合形成的子座。 3.2 假菌核（pseudosclerotium） 由菌组织和寄主组织结合形成的菌核。 4 黄瓜黑色根腐病菌基本信息 学名：Phomopsis sclerotioides van Kesteren 异名：Phomopsis sclerotioides Kest. spec. nov. 中文名称：黄瓜黑色根腐病菌 英文名称：Cucumber Black Root Rot 分类地位：真菌界（Fungi）、半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球壳孢科（Sphaeropsidaceae）、拟茎点霉属（Phomopsis）。 传播途径：土传病害，通过空气、水或土壤/介质传播，在不利条件下菌核可在土壤中存活多年。 其他信息参见附录A。 5 方法原理 根据黄瓜黑色根腐病菌在寄主植物上的症状、病原菌形态特征、生物学特性及PCR特异性反应进行鉴定（参见附录B、附录C）。 6 仪器设备和试验用具 显微镜、解剖镜、超净工作台、培养箱、冰箱、高压灭菌器、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温光照培养箱、微量可调加样器（10μL、100μL、200μL、1000μL）、载玻片、盖玻片、滴管、培养皿、镊子、解剖刀、酒精灯、医用手术剪等。 7 试剂和培养基 7.1 试剂：无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、盐酸、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钠、TBE缓冲液、无水乙醇、溴化乙锭、三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TE缓冲液（pH 8.0）、PCR试剂（包括Taq DNA聚合酶、dNTP、缓冲液）、次氯酸钠、葡萄糖、五氯硝基苯（PCNB）、硫酸链霉素20%、乳酸等，除另有规定外均为分析纯，所有用水为无菌双蒸水。 7.2 培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）和PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基，配制方法见附录D。 8 现场检疫 在光线充足的场所，使用放大镜重点检查植株根部，观察是否有灰黑色病斑，病斑边缘有明显黑色线或带。抽取可疑植株或种子送实验室进一步检验，取样方法参照SN/T2122。 9 实验室检疫 9.1 取样：挑取根部变色的可疑植株，镜检种子样品，选取干瘪、皱缩、霉变等异常种子，同时采集夹带的植株残体进行病原菌分离和培养。 9.2 镜检：清洗根部样品时注意不折断细根，在解剖镜下观察根纵轴方向是否有浅灰色或棕黑色假子座及假菌核。对无明显症状的样品，冲洗干净后装入塑料袋，在室温下保湿培养3至7天后观察。 9.3 病原菌的分离和培养：选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位（约5mm×5mm），在1.0%次氯酸钠溶液中表面消毒5分钟（可根据组织腐败程度适当调整），用灭菌水冲洗3次并吸干水分，置于PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基平板上，25℃黑暗培养。发现灰色菌丝后，挑取菌落边缘菌丝，转入PDA平板进行进一步培养和鉴定。