SN/T 3423-2012
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标准简介
SN/T 3423-2012.Detection and identification of Phomo psis sclerotioides van K esteren.
1范围
SN/T 3423规定了黄瓜黑色根腐病菌( Phomopsis sclerotioides van Kesteren)的检疫鉴定方法。
SN/T 3423适用于黄瓜黑色根腐病菌寄主植物的植株、种子上黄瓜黑色根腐病菌的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1假子座pseudostroma
由菌组织和寄主植物组织结合而形成的子座。
3.2假菌核pseudosclerotium
由菌组织和寄主组织结合在一起形成的菌核。
4黄瓜黑色根腐病菌基本信息
学名:Phomopsis sclerotioides van Kesteren
异名:Phomopsis sclerotioides Kest. spec. nov.
中文名称:黄瓜黑色根腐病菌
英文名:Cucumber Black Root Rot
分类地位:黄瓜黑色根腐病菌属真菌界(Fungi)、半知菌亚门( Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaeropsidaceae)、拟茎点霉属(Phomopsis)。
传播途径:该病菌是一种土传病害,通过空气、水或土壤/介质传播。在不利情况下,病菌形成的菌核可以在土壤中存活多年。
黄瓜黑色根腐病菌的其他信息参见附录A。
1范围
SN/T 3423规定了黄瓜黑色根腐病菌( Phomopsis sclerotioides van Kesteren)的检疫鉴定方法。
SN/T 3423适用于黄瓜黑色根腐病菌寄主植物的植株、种子上黄瓜黑色根腐病菌的检疫鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1假子座pseudostroma
由菌组织和寄主植物组织结合而形成的子座。
3.2假菌核pseudosclerotium
由菌组织和寄主组织结合在一起形成的菌核。
4黄瓜黑色根腐病菌基本信息
学名:Phomopsis sclerotioides van Kesteren
异名:Phomopsis sclerotioides Kest. spec. nov.
中文名称:黄瓜黑色根腐病菌
英文名:Cucumber Black Root Rot
分类地位:黄瓜黑色根腐病菌属真菌界(Fungi)、半知菌亚门( Deuteromycotina)、腔孢纲(Coelomycetes)、球壳孢目(Sphaeropsidales)、球壳孢科(Sphaeropsidaceae)、拟茎点霉属(Phomopsis)。
传播途径:该病菌是一种土传病害,通过空气、水或土壤/介质传播。在不利情况下,病菌形成的菌核可以在土壤中存活多年。
黄瓜黑色根腐病菌的其他信息参见附录A。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3423—2012
黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification ofPhomopsis sclerotioides vanKesteren2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3423—2012
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国计量学院。本标准主要起草人：张慧丽、张建成、陈先锋、徐瑛、杨红霞、商晗武、郑炜。1
1范围
黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法SN/T3423—2012
本标准规定了黄瓜黑色根腐病菌（PhomopsissclerotioidesvanKesteren）的检疫鉴定方法。本标准适用于黄瓜黑色根腐病菌寄主植物的植株、种子上黄瓜黑色根腐病菌的检疫鉴定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122
2进出境植物及植物产品检疫抽样3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
假子座
pseudostroma
由菌组织和寄主植物组织结合而形成的子座。3.2
核pseudosclerotium
假菌核
由菌组织和寄主组织结合在一起形成的菌核。4黄瓜黑色根腐病菌基本信息
学名：Phomopsis sclerotioidesvanKesteren异名：PhomopsissclerotioidesKest.spec.nov.中文名称：黄瓜黑色根腐病菌
英文名：CucumberBlackRootRot分类地位：黄瓜黑色根腐病菌属真菌界（Fungi）、半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球壳孢科（Sphaeropsidaceae）、拟茎点霉属（Phomopsis）。传播途径：该病菌是一种土传病害，通过空气、水或土壤/介质传播。在不利情况下，病菌形成的菌核可以在土壤中存活多年。
黄瓜黑色根腐病菌的其他信息参见附录A。5方法原理
根据黄瓜黑色根腐病菌在寄主植物上的症状、病原菌的形态特征、生物学特性和PCR特异性反应对病菌进行鉴定(参见附录B、附录C)。1
SN/T3423—2012
6仪器设备和试验用具
显微镜、解部镜、超净工作台、培养箱、冰箱、高压灭菌器、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温光照培养箱、微量可调加样器（10μL、100μL、200μL、1000μL）、载玻片、盖玻片、滴管、培养血、镊子、解部刀、酒精灯、医用手术剪等。7试剂和培养基
7.1试剂
无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、盐酸、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钠、TBE缓冲液、无水乙醇、溴化乙锭三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TE缓冲液（pH8.0）、PCR试剂（包括TagDNA聚合酶、dNTP、缓冲液）、次氯酸钠、葡萄糖、五氯硝基苯（PCNB）、硫酸链霉素20%乳酸、除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为无菌双蒸水。
7.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)和PCNB酸性马铃署葡萄糖选择性培养基，配制方法见附录D。8现场检疫
在光线充足的场所，借助放大镜重点检查植株的根部，根部的症状是产生灰黑色病斑，病斑边缘有明显的黑色线或带。抽取可疑的植株或种子送实验室做进一步检验2122。
取样方法和步骤参照SN/T
实验室检疫
9.1取样
挑取植株菱，根部变色的可疑植株，镜检种子类样品，选取干癌、皱缩、霉变等非正常的种子，同时挑取夹带的植株残体，进行病原菌的分离和培养。
9.2镜检
将植物的根在自来水下洗干净，清洗时要注意不要把细根弄断。根部有变黑症状的样品，在解剖镜下观察延着根纵轴方向上是否有浅灰色或棕黑色假子座（参见图B.1），在根的皮层细胞中是否有假菌核（参见图B.2）。没有明显症状的根冲洗干净后，装人塑料袋内，在室温下保湿培养3d～7d后观察。9.3病原菌的分离和培养
选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位组织（大小约5mmX5mm），1.0%次氯酸钠溶液中表面消毒5min（根据分离组织的腐败程度可适当增加或缩短表面消毒时间），灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后，置于PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基平板上，25℃黑暗培养。解剖镜下发现有灰色菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转人PDA平板纯化，保存备用。非正常种子上病原菌的分离方法同上。
分子生物学鉴定
如未观察到假子座和假菌核还需进行PCR鉴定，PCR鉴定方法见附录C。黄瓜黑色根腐病菌的特异性引物CPs-1和CPs-2的序列见表1。表1特异性引物序列及产物（ShishidoM,2010)引物
鉴定特征
病原菌特征
序列5'-3”
GCCTCGGCGCAGGCCGGCCTCACC
GGGGCCTTCCAGAACGAAATATAATTT
假子座和假菌核
黄瓜黑色根腐病典型的特征为：在根纵轴方向SN/T3423—2012
浅灰色或棕黑色假子座（即病斑边缘黑褐色的线或带），假子座也常围绕侧根和根毛的连接处（参见图B.1）；在根的皮层细胞中产生棕黑色的假菌核，为大小和形状的不同而变化（参见图B.2）。假菌核的大小和形态随皮层细胞的培养性状
在PDA培养基上，黄瓜黑色根
落由两种菌丝构成：一种为薄壁透明的菌10μm~17.5μm）。载孢体亚球
形到不持
殖层分开，α孢子（7.5μm～10.（参见图B.4)。
10.2与近似种区别
通常会形成薄的、暗灰色当
至灰棕色的菌落（参见图B.3）。菌丝（直
2μm~4.5μm）
厚壁外
另一种为厚壁黑褐色菌丝（直径部棕色或黑色
无明显的孔口，内腔被突起的增tm)透明，椭圆形至卵圆形，顶端稍尖，常有油球拟茎点霉属中引起葫芦科果腐和茎腐的种是cucurbitae它
黄瓜黑色根腐病的区别见表2。
表2黄瓜黑色根腐病菌与近似种的区别特征
α孢子
β孢子
侵染部位
P.cucurbitae
大小（4μm~9μm）×（1.5μm~3μm），绝大多数(5.5μm~7μm）)×（1.5μm~2μm），平均6.2μm×1.9μm，透明，纺锤状，常有油球(14μm~34μm）×（0.5μm~1.8μm），绝大多数(19μm~28μm）×（0.7μm~1.0μm），平均23.8μm×0.9μm，单细胞，透明，线状或钩状，强烈弯曲（参见图B.5)
不产生任何菌核
可以引起叶片、叶柄、果实和茎秆腐烂类
P.sclerotioides
（7.5μm10.5μm）×（2.5μm~4.5μm），透明，椭圆形至卵圆形，顶端稍尖，常有油球无
寄主根部产生假菌核
主要引起根腐
SN/T3423—2012
结果判定
根据黄瓜黑色根腐病菌的鉴定特征对病原菌分离物进行综合判定，如病菌在寄主植物上的症状、形态学特征符合第9章的描述，可判定为黄瓜黑色根腐病菌（P.sclerotioides）。如未观察到假子座和假菌核还需进行PCR鉴定，PCR产物含有392bp特异性片段的确定为黄瓜黑色根腐病菌。12
菌种和DNA样品的保藏
黄瓜黑色根腐病菌（P.sclerotioides)纯分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人，菌株在含20%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d)转管。病菌基因组DNA样品于一20℃下保存。保存期满后，需经灭菌处理。
A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
黄瓜黑色根腐病菌基本信息
欧洲：丹麦、德国、法国、荷兰、挪威、瑞典、瑞士、英国、苏格兰、波兰、意大利。大洋洲：新西兰。
亚洲：马来西亚、西印度群岛、日本。北美洲：加拿大。
A.2寄主
SN/T3423—2012wwW.bzxz.Net
黄瓜黑色根腐病菌主要侵染葫芦科植物，已报道的自然寄主有黄瓜（Cucumissatiuus）、黄瓜变种（Cucumissativusvaranglicus）、南瓜（Cucurbitamoschata）、笋瓜（Cucurbitamarima）、西瓜（Citrulluslanatus）、甜瓜（Cucumismelo）、黑籽南瓜（Cucurbitaficifolia）。Leski等证明通过人工接种黄瓜黑根腐病菌可以侵染更多的植物，如：芸豆，利马豆，大豆，豌豆，黄秋葵，茄子，葵花，lupinussatiuus（羽扇豆属一种），大巢菜，翠菊，红三叶，紫花首。但是只在首和红三叶上产生典型的黑斑。
SN/T3423—2012
说明：
附录B
（资料性附录）
黄瓜黑色根腐病菌危害症状及病原菌形态特征a、b—受P.sclerotioides侵染的黄瓜根部；假子座部分截图。
注：引自H.A.VANKESTEREN1966
图B.1黄瓜黑色根腐病菌在黄瓜上引起的症状6
注：引自H.A.VANKESTEREN1966。图B.2根皮层细胞中的假菌核
说明：
培养2d；
一培养12d。
注：引自門田育生2008。
图B.3黄瓜黑色根腐病菌在PDA平板上的菌落形态SN/T3423—2012
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黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法Detection and identification ofPhomopsis sclerotioides vanKesteren2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3423—2012
本标准起草单位：中华人民共和国宁波出人境检验检疫局、中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中国计量学院。本标准主要起草人：张慧丽、张建成、陈先锋、徐瑛、杨红霞、商晗武、郑炜。1
1范围
黄瓜黑色根腐病菌检疫鉴定方法SN/T3423—2012
本标准规定了黄瓜黑色根腐病菌（PhomopsissclerotioidesvanKesteren）的检疫鉴定方法。本标准适用于黄瓜黑色根腐病菌寄主植物的植株、种子上黄瓜黑色根腐病菌的检疫鉴定。规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T2122
2进出境植物及植物产品检疫抽样3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
假子座
pseudostroma
由菌组织和寄主植物组织结合而形成的子座。3.2
核pseudosclerotium
假菌核
由菌组织和寄主组织结合在一起形成的菌核。4黄瓜黑色根腐病菌基本信息
学名：Phomopsis sclerotioidesvanKesteren异名：PhomopsissclerotioidesKest.spec.nov.中文名称：黄瓜黑色根腐病菌
英文名：CucumberBlackRootRot分类地位：黄瓜黑色根腐病菌属真菌界（Fungi）、半知菌亚门（Deuteromycotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、球壳孢目（Sphaeropsidales）、球壳孢科（Sphaeropsidaceae）、拟茎点霉属（Phomopsis）。传播途径：该病菌是一种土传病害，通过空气、水或土壤/介质传播。在不利情况下，病菌形成的菌核可以在土壤中存活多年。
黄瓜黑色根腐病菌的其他信息参见附录A。5方法原理
根据黄瓜黑色根腐病菌在寄主植物上的症状、病原菌的形态特征、生物学特性和PCR特异性反应对病菌进行鉴定(参见附录B、附录C)。1
SN/T3423—2012
6仪器设备和试验用具
显微镜、解部镜、超净工作台、培养箱、冰箱、高压灭菌器、离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、恒温光照培养箱、微量可调加样器（10μL、100μL、200μL、1000μL）、载玻片、盖玻片、滴管、培养血、镊子、解部刀、酒精灯、医用手术剪等。7试剂和培养基
7.1试剂
无菌双蒸水、液氮、蛋白酶K、盐酸、氢氧化钠、醋酸铵、氯化钠、TBE缓冲液、无水乙醇、溴化乙锭三氯甲烷、异丙醇、异戊醇、TE缓冲液（pH8.0）、PCR试剂（包括TagDNA聚合酶、dNTP、缓冲液）、次氯酸钠、葡萄糖、五氯硝基苯（PCNB）、硫酸链霉素20%乳酸、除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为无菌双蒸水。
7.2培养基
马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA)和PCNB酸性马铃署葡萄糖选择性培养基，配制方法见附录D。8现场检疫
在光线充足的场所，借助放大镜重点检查植株的根部，根部的症状是产生灰黑色病斑，病斑边缘有明显的黑色线或带。抽取可疑的植株或种子送实验室做进一步检验2122。
取样方法和步骤参照SN/T
实验室检疫
9.1取样
挑取植株菱，根部变色的可疑植株，镜检种子类样品，选取干癌、皱缩、霉变等非正常的种子，同时挑取夹带的植株残体，进行病原菌的分离和培养。
9.2镜检
将植物的根在自来水下洗干净，清洗时要注意不要把细根弄断。根部有变黑症状的样品，在解剖镜下观察延着根纵轴方向上是否有浅灰色或棕黑色假子座（参见图B.1），在根的皮层细胞中是否有假菌核（参见图B.2）。没有明显症状的根冲洗干净后，装人塑料袋内，在室温下保湿培养3d～7d后观察。9.3病原菌的分离和培养
选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位组织（大小约5mmX5mm），1.0%次氯酸钠溶液中表面消毒5min（根据分离组织的腐败程度可适当增加或缩短表面消毒时间），灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸干水分后，置于PCNB酸性马铃薯葡萄糖选择性培养基平板上，25℃黑暗培养。解剖镜下发现有灰色菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转人PDA平板纯化，保存备用。非正常种子上病原菌的分离方法同上。
分子生物学鉴定
如未观察到假子座和假菌核还需进行PCR鉴定，PCR鉴定方法见附录C。黄瓜黑色根腐病菌的特异性引物CPs-1和CPs-2的序列见表1。表1特异性引物序列及产物（ShishidoM,2010)引物
鉴定特征
病原菌特征
序列5'-3”
GCCTCGGCGCAGGCCGGCCTCACC
GGGGCCTTCCAGAACGAAATATAATTT
假子座和假菌核
黄瓜黑色根腐病典型的特征为：在根纵轴方向SN/T3423—2012
浅灰色或棕黑色假子座（即病斑边缘黑褐色的线或带），假子座也常围绕侧根和根毛的连接处（参见图B.1）；在根的皮层细胞中产生棕黑色的假菌核，为大小和形状的不同而变化（参见图B.2）。假菌核的大小和形态随皮层细胞的培养性状
在PDA培养基上，黄瓜黑色根
落由两种菌丝构成：一种为薄壁透明的菌10μm~17.5μm）。载孢体亚球
形到不持
殖层分开，α孢子（7.5μm～10.（参见图B.4)。
10.2与近似种区别
通常会形成薄的、暗灰色当
至灰棕色的菌落（参见图B.3）。菌丝（直
2μm~4.5μm）
厚壁外
另一种为厚壁黑褐色菌丝（直径部棕色或黑色
无明显的孔口，内腔被突起的增tm)透明，椭圆形至卵圆形，顶端稍尖，常有油球拟茎点霉属中引起葫芦科果腐和茎腐的种是cucurbitae它
黄瓜黑色根腐病的区别见表2。
表2黄瓜黑色根腐病菌与近似种的区别特征
α孢子
β孢子
侵染部位
P.cucurbitae
大小（4μm~9μm）×（1.5μm~3μm），绝大多数(5.5μm~7μm）)×（1.5μm~2μm），平均6.2μm×1.9μm，透明，纺锤状，常有油球(14μm~34μm）×（0.5μm~1.8μm），绝大多数(19μm~28μm）×（0.7μm~1.0μm），平均23.8μm×0.9μm，单细胞，透明，线状或钩状，强烈弯曲（参见图B.5)
不产生任何菌核
可以引起叶片、叶柄、果实和茎秆腐烂类
P.sclerotioides
（7.5μm10.5μm）×（2.5μm~4.5μm），透明，椭圆形至卵圆形，顶端稍尖，常有油球无
寄主根部产生假菌核
主要引起根腐
SN/T3423—2012
结果判定
根据黄瓜黑色根腐病菌的鉴定特征对病原菌分离物进行综合判定，如病菌在寄主植物上的症状、形态学特征符合第9章的描述，可判定为黄瓜黑色根腐病菌（P.sclerotioides）。如未观察到假子座和假菌核还需进行PCR鉴定，PCR产物含有392bp特异性片段的确定为黄瓜黑色根腐病菌。12
菌种和DNA样品的保藏
黄瓜黑色根腐病菌（P.sclerotioides)纯分离物要标注菌株来源、寄主、分离时间、鉴定人，菌株在含20%甘油的冻存管中于一80℃保存，或将菌株转接在PDA斜面上培养，待菌丝体长满斜面后，置于4℃下保存，并定期（180d)转管。病菌基因组DNA样品于一20℃下保存。保存期满后，需经灭菌处理。
A.1地理分布
附录A
（资料性附录）
黄瓜黑色根腐病菌基本信息
欧洲：丹麦、德国、法国、荷兰、挪威、瑞典、瑞士、英国、苏格兰、波兰、意大利。大洋洲：新西兰。
亚洲：马来西亚、西印度群岛、日本。北美洲：加拿大。
A.2寄主
SN/T3423—2012wwW.bzxz.Net
黄瓜黑色根腐病菌主要侵染葫芦科植物，已报道的自然寄主有黄瓜（Cucumissatiuus）、黄瓜变种（Cucumissativusvaranglicus）、南瓜（Cucurbitamoschata）、笋瓜（Cucurbitamarima）、西瓜（Citrulluslanatus）、甜瓜（Cucumismelo）、黑籽南瓜（Cucurbitaficifolia）。Leski等证明通过人工接种黄瓜黑根腐病菌可以侵染更多的植物，如：芸豆，利马豆，大豆，豌豆，黄秋葵，茄子，葵花，lupinussatiuus（羽扇豆属一种），大巢菜，翠菊，红三叶，紫花首。但是只在首和红三叶上产生典型的黑斑。
SN/T3423—2012
说明：
附录B
（资料性附录）
黄瓜黑色根腐病菌危害症状及病原菌形态特征a、b—受P.sclerotioides侵染的黄瓜根部；假子座部分截图。
注：引自H.A.VANKESTEREN1966
图B.1黄瓜黑色根腐病菌在黄瓜上引起的症状6
注：引自H.A.VANKESTEREN1966。图B.2根皮层细胞中的假菌核
说明：
培养2d；
一培养12d。
注：引自門田育生2008。
图B.3黄瓜黑色根腐病菌在PDA平板上的菌落形态SN/T3423—2012
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。