中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3985—2014 水生动物链球菌感染检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with streptococcus in aquatic animals 2014-11-19发布 2015-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福建出入境检验检疫局、中华人民共和国宁波出入境检验检疫局、福建医科大学附属第一医院。 本标准主要起草人：王武军、白泉阳、张吉红、高丽钦、郑腾、张体银、于师宇、张志灯、林素洁。 1 范围 本标准规定了鱼类链球菌的临床诊断、病原分离、生化鉴定和聚合酶链式反应的检测方法。 本标准适用于鱼类链球菌感染的临床诊断、病原鉴定与检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.28 食品卫生微生物学检验 染色法、培养基和试剂 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 GB 19489 实验室生物安全通用要求 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 概述 鱼类链球菌感染简介参见附录A。 4 临床诊断 4.1 临床症状 病鱼呈急性嗜神经组织病症，行为异常，如螺旋状或旋转式游泳，在水面作头向上或者尾向上的转圈游动，身体呈C形或逗号样弯曲。眼眶周围和眼球内出血，眼球浑浊，眼球突出。鳃盖内侧发红、充血或强烈出血。病鱼腹部体表具点状或斑块出血或溃疡，肛门发红。 在高温季节，病鱼呈急性感染时，可能未表现明显临床症状即已死亡。可根据眼球突出、鳃盖内侧出血和异常神经性运动等典型症状作初步诊断。 4.2 病理变化 病鱼心外膜肥厚，腹腔明显出血，肝脏和腹腔脂肪出血。肝脏、胆囊、脾脏肿大、出血，严重时发生糜烂性肠炎，肠道内有积水或黄色黏液，肛门突出。 5 实验室诊断 5.1 设备、材料和试剂 5.1.1 主要设备 5.1.1.1 天平：读数精度0.1 g。 5.1.1.2 冰箱。 5.1.1.3 培养箱。 5.1.1.4 恒温水浴锅。 5.1.1.5 生物显微镜。 5.1.1.6 II级生物安全柜。 5.1.1.7 红外加热器。 5.1.1.8 台式冷冻高速离心机。 5.1.1.9 PCR仪。 5.1.1.10 电泳仪。 5.1.1.11 凝胶成像仪。 5.1.1.12 灭菌试管。 5.1.1.13 灭菌吸管。 5.1.1.14 单道可调微量移液器（2 μL～20 μL、20 μL～200 μL、100 μL～1000 μL）及其配套吸头。 5.1.2 材料和试剂 5.1.2.1 水：符合GB/T 6682中三级水的规格要求。 5.1.2.2 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。 5.1.2.3 普通琼脂绵羊血平板培养基、脑心浸液（BHI）培养基。 5.1.2.4 革兰染色液。 5.1.2.5 过氧化氢酶试剂。 5.1.2.6 细菌生化鉴定管或商品化生化鉴定系统。 5.1.2.7 细菌基因组DNA提取试剂盒。 5.1.2.8 商品化DNA扩增试剂盒。 5.1.2.9 扩增海豚链球菌16S rRNA的297 bp片段引物序列如下： Sin-F：5'-CTAGAGTACACATCGTACTTAAG-3' Sin-R：5'-GGATTTTCCACTCCCATTAC-3' 扩增无乳链球菌CAMP因子cfb基因468 bp片段的引物序列如下： Sag-F：5'-AAGCGTGTATTCCTCCAGATTTCCT-3' Sag-R：5'-CAGTAATCAAGCCCAGCAA-3' 5.1.2.10 其他试剂：无水乙醇、琼脂糖（电泳纯）、分子量标准（100 bp～1000 bp）。 5.1.2.11 电泳缓冲液、电泳加样缓冲液、溴化乙锭（EB）染色液，配制方法见附录B。 5.1.2.12 商品化DNA纯化回收试剂盒。 5.1.2.13 海豚链球菌、无乳链球菌标准菌株，由相关菌种保藏机构提供。 5.2 样品采集 对病鱼，急性病例可无菌采集肝、头肾、脾脏等组织；慢性病例可无菌采集病变组织用于检测。