中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3447—2012 草莓簇生植原体检疫鉴定方法 Detection and identification of strawberry multiplier phytoplasma 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：栗智平、耿金培、张京宣、牟海青、鲁闽、栾晶、王颖。 1 范围 本标准规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法。 本标准适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR） 以DNA为模板、dNTPs为底物、两条反向引物对为起点，根据碱基配对原则，在聚合酶作用下，按照DNA的核苷酸顺序合成与模板互补的DNA链的过程。PCR是一种体外基因扩增技术。 3.2 SYBR Green实时荧光PCR（SYBR Green realtime PCR） SYBR Green试剂中含有一种荧光染料，该荧光染料可与双链DNA结合而产生荧光。随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，即可通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图。整个PCR反应完成后会生成一条熔解曲线，通过峰值高低可确定PCR产物的量，单峰表示PCR扩增具有较强特异性。实时荧光PCR与普通PCR相比，不需要另外设计探针。 4 方法原理 4.1 分类地位 草莓簇生植原体（Strawberry multiplier phytoplasma）属于植原体16SrI-K亚组。其他信息参见附录A。 4.2 检测原理 本标准检测的主要依据是植原体的基因序列信息。首先，利用植原体16S rRNA基因的通用引物进行PCR扩增，以确定检疫对象是否为植原体；然后利用两对草莓簇生植原体特异性引物，通过SYBR Green实时荧光PCR及电泳检测进行结果判定，确定检疫对象是否为草莓簇生植原体。 5 仪器设备、用具及试剂 5.1 主要仪器设备 高速冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、常规PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、天平（感量：0.001 g）、冷藏冷冻冰箱、旋涡振荡器、高温干燥箱、生物安全柜、水浴锅等。 5.2 主要用具 研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）、各种吸头（10 μL、200 μL、1000 μL）、离心管（0.2 mL、0.5 mL、1.5 mL、2.0 mL）等。 5.3 主要试剂 DNA提取试剂详见附录B；PCR试剂详见附录C；SYBR Green实时荧光PCR试剂详见附录D。 6 检测与鉴定 6.1 引物设计 根据草莓簇生植原体16S rRNA基因的保守序列，采用了一对植原体通用引物P1，并设计了两对草莓簇生植原体特异性引物P2和P3。具体序列及对应的基因片段长度如下： P1F：5'-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3' P1R：5'-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3' P1F/P1R对应的PCR产物长度为1.24 kb。 P2F：5'-CGGCGCGCCTAATACATG-3' P2R：5'-TCCAGTCTTAGCAGTCATTTCCAAC-3' P2F/P2R对应的PCR产物长度为131 bp。 P3F：5'-AGACTATGATGTGTAGCCGGACTG-3' P3R：5'-ACGTACCGAAATACTTCATCATTCAC-3' P3F/P3R对应的PCR产物长度为156 bp。 6.2 DNA的提取 试剂及具体步骤详见附录B。 6.3 通用引物的PCR扩增及电泳 试剂及操作详见附录C。 6.4 SYBR Green实时荧光PCR及电泳检测 若6.3中通用引物扩增出1.24 kb左右的PCR产物，则需要进行进一步的特异性PCR试验。试剂及具体操作详见附录D。