SN/T 3447-2012
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出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3447-2012.Detection and identification of strawberry multiplier phytoplasma.
1范围
SN/T 3447规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法。
SN/T 3447适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1聚合酶链式反应polymerase chain reaction
在聚合酶的作用下，以DNA为模板、dNTPs为底物、两条反向的引物对为起点,根据碱基配对原则,按照DNA的核苷酸顺序,合成与模板互补的DNA链的过程。PCR是一种体外基因扩增技术。
3.2SYBRGreen实时荧光PCR
SYBR Green realtime PCR
SYBR Green试剂中含有一种荧光染料,这种荧光染料可以与双链DNA结合而产生荧光,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过-一个循环，收集一个荧光强度信号,就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。在整个PCR反应完成后，会生成一条熔解曲线,峰值的高低可以确定PCR产物的量,单峰表示PCR扩增的强特异性。SYBR Green 实时荧光PCR跟普通PCR引物一样,而不需要另外设计探针。
1范围
SN/T 3447规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法。
SN/T 3447适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1193基因检验实验室技术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3. 1聚合酶链式反应polymerase chain reaction
在聚合酶的作用下，以DNA为模板、dNTPs为底物、两条反向的引物对为起点,根据碱基配对原则,按照DNA的核苷酸顺序,合成与模板互补的DNA链的过程。PCR是一种体外基因扩增技术。
3.2SYBRGreen实时荧光PCR
SYBR Green realtime PCR
SYBR Green试剂中含有一种荧光染料,这种荧光染料可以与双链DNA结合而产生荧光,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。随着PCR反应的进行,PCR反应产物不断累计,荧光信号强度也等比例增加。每经过-一个循环，收集一个荧光强度信号,就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化,从而得到一条荧光扩增曲线图。在整个PCR反应完成后，会生成一条熔解曲线,峰值的高低可以确定PCR产物的量,单峰表示PCR扩增的强特异性。SYBR Green 实时荧光PCR跟普通PCR引物一样,而不需要另外设计探针。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3447—2012
草莓簇生植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of strawberry multiplier phytoplasma2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3447—2012
本标准起草单位：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：栗智平、耿金培、张京宣、牟海青、鲁闽、栾晶、王颖。1范围
草莓簇生植原体检疫鉴定方法
本标准规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法。本标准适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。SN/T3447—2012
注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
聚合酶链式反应polymerasechainreactionNTPs为底物、两条反向的引物对为起点，根据碱基配对原在聚合酶的作用下，以DNA为模板、dN则，按照DNA的核苷酸顺序，合成与模板互补的DNA链的过程。PCR是一种体外基因扩增技术。3.2
SYBRGreen实时荧光PCR
SYBRGreen试剂中含有一种荧光
光信号积累实时监测整个PCR进
Green realtime
料，这种荧光染
料可以
人与双链DNA结合而产生荧光，利用荧着PCR反应的进行，
也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度化，从而得到一条荧光扩增曲线图在整个PCR反
定PCR产物的量，单峰表示PCR扩增的强特异性样，而不需要另外设计探针。
4方法原理
分类地位
PCR反应产物不断累计，荧光信号强度号，就可以通过荧光强度变化监测产物量的变完成后
会生成
条熔解曲线，峰值的高低可以确实时荧光PCR跟普通PCR引物一
草莓簇生植原体（Strawberrymultiplierphytoplasma）属于植原体16SrI-K亚组。其他信息参见附录A。
4.2检测原理
本标准检测的主要依据是植原体的基因序列信息。首先，用根据植原体16sRNA基因的通用引物进行PCR扩增，以确定检疫对象是否为植原体；然后，利用两对草莓簇生植原体的特异性引物，通过SYBRGreen实时荧光PCR及电泳检测进行结果判定，确定检疫对象是否为草莓簇生植原体。SN/T3447—2012
5仪器设备、用具及试剂
5.1主要仪器设备
高速冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、常规PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、天平（感量：0.001g）、冷藏冷冻冰箱、旋涡振荡器、高温干燥箱、生物安全柜、水浴锅等。5.2主要用具
研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、各种吸头(10μL，200μL，l000μL）、离心管（0.2mL，0.5mL，l.5mL,2.0mL）等。5.3主要试剂
DNA提取试剂详见附录B；PCR试剂详见附录C;SYBRGreen实时荧光PCR试剂详见附录D。6
检测与鉴定
引物设计
根据草莓簇生植原体16srRNA基因的保守序列，采用了一对植原体通用引物P1，并设计了两对草莓簇生植原体特异性引物P2和P3，具体序列及对应的基因片段长度如下：P1F:5'-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3P1R:5-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3P1F/P1R对应的PCR产物长度为1.24kb。P2F:5'-CGGCGCGCCTAATACATG-3
P2R:5'-TCCAGTCTTAGCAGTCATTTCCAAC-3P2F/P2R对应的PCR产物长度为131bp。P3F:5-AGACTATGATGTGTAGCCGGACTG-3P3R:5-ACGTACCGAAATACTTCATCATTCAC-3P3F/P3R对应的PCR产物长度为156bp。6.2DNA的提取
试剂及具体步骤详见附录B。
6.3通用引物的PCR扩增及电泳
试剂及操作详见附录C。
6.4SYBRGreen实时荧光PCR及电泳检测若6.3中通用引物扩增出1.24kb左右的PCR产物，则需要进行进一步的特异性PCR试验。试剂及具体操作详见附录D。
若SYBRGreen实时荧光PCR检测中结果呈阳性，则需将PCR产物进行进一步电泳观察。试剂及操作详见附录C。
7防污染措施
SN/T3447—2012
草莓簇生植原体检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定。制样用的研钵经过洗涤液清洗后，160℃干热处理2h。
结果判定
判断依据
8.1.1P1引物的PCR产物长度为1.24kb。2P2、P3引物SYBRGreen实时荧光PCR时有标准扩增曲线，且它们的CT极为接近；P2熔解曲8.1.2
线峰值T.=83.5℃（士0.5℃），P3熔解曲线峰值T=87.0℃（士0.5℃）。8.1.3P2引物的PCR产物长度为131bp;P3引物的PCR产物长度为156bp。8.2
结果判定
若检测结果同时满足8.1的三个条件，则判定为阳性；否则判定为阴性。样品保存与复核
样品保存与处理
经鉴定，确定携带草莓簇生植原体的病株样品应在一20℃冰箱保存，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌处理方可丢弃。结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。SYBRGreen实时荧光PCR结果需要有PCR扩增曲线图和熔解曲线图；PCR凝胶电泳需要有电泳结果图。结果记录与资料保存期限至少1年。3
SN/T3447—2012
A.1名称及简介
中文名：草莓簇生植原体
附录A
（资料性附录）
草莓簇生植原体其他相关信息
英文名：StrawberrymultiplierphytoplasmaA.2寄主范围
目前只发现草莓（Strawberry）植物为其自然寄主。寄主在我国的种植和分布范围都很大，容易定殖。
A.3分布地区
该病原物主要分布于美国和加拿大，在我国尚未见发生，是我国新颁布的进境植物检疫性有害生物。
A.4传播方式
主要通过带病的果苗和介体昆虫传播。易通过进口贸易运输传入
A.5经济影响
草莓是我国重要的水果作物而该病由于病菌是由昆虫介体传播且速度相当快，因此一旦该病害传人具有较大的风险性。
B.1主要试剂
B.1.1CTAB抽提液
附录B
（规范性附录）
DNA提取试剂与方法
2%（质量浓度）CTAB（十六烷基三乙基溴化铵100mmol/LTris-C1,pH8.0
20mmol/LEDTA,pH8.0
1.4mol/LNaCl
于室温保存（可在几年内保持稳定）SN/T3447—2012
7mol/LNaCD：在80mLH,O中溶解4.1gNaCl,缓慢加B.1.2CTAB/NaCI溶液（10%CTAB/07入10gCTAB（十六烷基三乙基溴化铵），同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至100mL。
B.1.3CTAB沉淀液
1%（质量浓度）CTAB
50 mmol/LTris-Cl,pH 8.0
10mmol/LEDTApH8.0
于室温保存（可在几年内保持稳定B.1.4TE缓冲液
10mmol/LTris-Cl,pH7.4.7.
1mmol/LEDTA,pH8.0
pH7.4,7.5,或8.0
B.1.5巯基乙醇。
B.1.6异丙醇。
B.1.770%酒精。
B.2DNA提取步骤
B.2.1取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，取适量液氮研磨成粉状后转移至2.0mL离心管，加入CTAB抽提缓冲液900μL和18μL（2%体积）巯基乙醇，再加人9μL蛋白酶K（20mg/mL），混匀（振荡），在65℃水浴30min～60min。B.2.2加人等体积Tris-苯酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)，12000r/min离心5min。取上清液，加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1)，直至上清液和下层有机溶液分层清晰为止。B.2.3取上清液，加人1/10体积CTAB/NaCI（65℃预热），及等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），12000r/min离心5min，重复直至分层清晰。5
SN/T3447—2012
取上清液，加人等体积CTAB沉淀液，颠倒混匀。B.2.5加人0.65倍体积异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min。B.2.6
去上清液，保留沉淀，用80%乙醇洗涤沉淀物2～3次，在超净工作台中晾干。B.2.7
灭菌双蒸水或TE缓冲液重悬沉淀物，一20℃保存备用。c.1
PCR试剂与方法
PCR试剂
见表c.1。
试剂名称
5×PCR缓冲液（含镁离子）
dNTP(10 mmol/L)
上游引物（15μmol/L）
下游引物（15μmol/L）
Taq酶(5U/μL)
DNA模板
附录C
（规范性附录）
PCR凝胶电泳试剂与方法
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：健康的草莓叶片DNA。阳性对照：草莓簇生植原体DNA。阴性质控：灭菌双蒸水。
PCR反应参数
PCR试剂
加样量Www.bzxZ.net
SN/T3447—2012
补足反应总体积为25.0l
94℃/2min；94℃/1min，60℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃10min。c.2
琼脂糖凝胶电泳试剂及方法
电泳试剂
琼脂糖，50×TAE，6X加样缓冲液，溴化乙锭（EB)，相对分子质量标记物Marker(DL2000）。C.2.2
电泳方法
制备凝胶
将TAE和电泳级琼脂糖按1.0%（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至55℃左右。7
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草莓簇生植原体检疫鉴定方法
Detection and identification of strawberry multiplier phytoplasma2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3447—2012
本标准起草单位：中华人民共和国烟台出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。本标准主要起草人：栗智平、耿金培、张京宣、牟海青、鲁闽、栾晶、王颖。1范围
草莓簇生植原体检疫鉴定方法
本标准规定了草莓簇生植原体检疫鉴定的基本原则和分子生物学检测方法。本标准适用于草莓及草莓苗中草莓簇生植原体的检疫和鉴定。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。SN/T3447—2012
注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1193基因检验实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
聚合酶链式反应polymerasechainreactionNTPs为底物、两条反向的引物对为起点，根据碱基配对原在聚合酶的作用下，以DNA为模板、dN则，按照DNA的核苷酸顺序，合成与模板互补的DNA链的过程。PCR是一种体外基因扩增技术。3.2
SYBRGreen实时荧光PCR
SYBRGreen试剂中含有一种荧光
光信号积累实时监测整个PCR进
Green realtime
料，这种荧光染
料可以
人与双链DNA结合而产生荧光，利用荧着PCR反应的进行，
也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度化，从而得到一条荧光扩增曲线图在整个PCR反
定PCR产物的量，单峰表示PCR扩增的强特异性样，而不需要另外设计探针。
4方法原理
分类地位
PCR反应产物不断累计，荧光信号强度号，就可以通过荧光强度变化监测产物量的变完成后
会生成
条熔解曲线，峰值的高低可以确实时荧光PCR跟普通PCR引物一
草莓簇生植原体（Strawberrymultiplierphytoplasma）属于植原体16SrI-K亚组。其他信息参见附录A。
4.2检测原理
本标准检测的主要依据是植原体的基因序列信息。首先，用根据植原体16sRNA基因的通用引物进行PCR扩增，以确定检疫对象是否为植原体；然后，利用两对草莓簇生植原体的特异性引物，通过SYBRGreen实时荧光PCR及电泳检测进行结果判定，确定检疫对象是否为草莓簇生植原体。SN/T3447—2012
5仪器设备、用具及试剂
5.1主要仪器设备
高速冷冻离心机、核酸蛋白分析仪、常规PCR仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、天平（感量：0.001g）、冷藏冷冻冰箱、旋涡振荡器、高温干燥箱、生物安全柜、水浴锅等。5.2主要用具
研钵和研棒、各种量程的可调移液器（2μL，10μL，20μL，100μL，200μL，1000μL）、各种吸头(10μL，200μL，l000μL）、离心管（0.2mL，0.5mL，l.5mL,2.0mL）等。5.3主要试剂
DNA提取试剂详见附录B；PCR试剂详见附录C;SYBRGreen实时荧光PCR试剂详见附录D。6
检测与鉴定
引物设计
根据草莓簇生植原体16srRNA基因的保守序列，采用了一对植原体通用引物P1，并设计了两对草莓簇生植原体特异性引物P2和P3，具体序列及对应的基因片段长度如下：P1F:5'-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3P1R:5-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3P1F/P1R对应的PCR产物长度为1.24kb。P2F:5'-CGGCGCGCCTAATACATG-3
P2R:5'-TCCAGTCTTAGCAGTCATTTCCAAC-3P2F/P2R对应的PCR产物长度为131bp。P3F:5-AGACTATGATGTGTAGCCGGACTG-3P3R:5-ACGTACCGAAATACTTCATCATTCAC-3P3F/P3R对应的PCR产物长度为156bp。6.2DNA的提取
试剂及具体步骤详见附录B。
6.3通用引物的PCR扩增及电泳
试剂及操作详见附录C。
6.4SYBRGreen实时荧光PCR及电泳检测若6.3中通用引物扩增出1.24kb左右的PCR产物，则需要进行进一步的特异性PCR试验。试剂及具体操作详见附录D。
若SYBRGreen实时荧光PCR检测中结果呈阳性，则需将PCR产物进行进一步电泳观察。试剂及操作详见附录C。
7防污染措施
SN/T3447—2012
草莓簇生植原体检测过程的防污染措施应符合SN/T1193的规定。制样用的研钵经过洗涤液清洗后，160℃干热处理2h。
结果判定
判断依据
8.1.1P1引物的PCR产物长度为1.24kb。2P2、P3引物SYBRGreen实时荧光PCR时有标准扩增曲线，且它们的CT极为接近；P2熔解曲8.1.2
线峰值T.=83.5℃（士0.5℃），P3熔解曲线峰值T=87.0℃（士0.5℃）。8.1.3P2引物的PCR产物长度为131bp;P3引物的PCR产物长度为156bp。8.2
结果判定
若检测结果同时满足8.1的三个条件，则判定为阳性；否则判定为阴性。样品保存与复核
样品保存与处理
经鉴定，确定携带草莓簇生植原体的病株样品应在一20℃冰箱保存，以备复核。该类样品保存期满后应经高压灭菌处理方可丢弃。结果记录与资料保存
完整的实验记录包括：样品的来源、种类、时间，实验的时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和实验人员的签字。SYBRGreen实时荧光PCR结果需要有PCR扩增曲线图和熔解曲线图；PCR凝胶电泳需要有电泳结果图。结果记录与资料保存期限至少1年。3
SN/T3447—2012
A.1名称及简介
中文名：草莓簇生植原体
附录A
（资料性附录）
草莓簇生植原体其他相关信息
英文名：StrawberrymultiplierphytoplasmaA.2寄主范围
目前只发现草莓（Strawberry）植物为其自然寄主。寄主在我国的种植和分布范围都很大，容易定殖。
A.3分布地区
该病原物主要分布于美国和加拿大，在我国尚未见发生，是我国新颁布的进境植物检疫性有害生物。
A.4传播方式
主要通过带病的果苗和介体昆虫传播。易通过进口贸易运输传入
A.5经济影响
草莓是我国重要的水果作物而该病由于病菌是由昆虫介体传播且速度相当快，因此一旦该病害传人具有较大的风险性。
B.1主要试剂
B.1.1CTAB抽提液
附录B
（规范性附录）
DNA提取试剂与方法
2%（质量浓度）CTAB（十六烷基三乙基溴化铵100mmol/LTris-C1,pH8.0
20mmol/LEDTA,pH8.0
1.4mol/LNaCl
于室温保存（可在几年内保持稳定）SN/T3447—2012
7mol/LNaCD：在80mLH,O中溶解4.1gNaCl,缓慢加B.1.2CTAB/NaCI溶液（10%CTAB/07入10gCTAB（十六烷基三乙基溴化铵），同时加热并搅拌。如果需要，可加热至65℃溶解。定容终体积至100mL。
B.1.3CTAB沉淀液
1%（质量浓度）CTAB
50 mmol/LTris-Cl,pH 8.0
10mmol/LEDTApH8.0
于室温保存（可在几年内保持稳定B.1.4TE缓冲液
10mmol/LTris-Cl,pH7.4.7.
1mmol/LEDTA,pH8.0
pH7.4,7.5,或8.0
B.1.5巯基乙醇。
B.1.6异丙醇。
B.1.770%酒精。
B.2DNA提取步骤
B.2.1取所选新鲜材料的韧皮部及叶中脉0.3g，取适量液氮研磨成粉状后转移至2.0mL离心管，加入CTAB抽提缓冲液900μL和18μL（2%体积）巯基乙醇，再加人9μL蛋白酶K（20mg/mL），混匀（振荡），在65℃水浴30min～60min。B.2.2加人等体积Tris-苯酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1)，12000r/min离心5min。取上清液，加人等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1)，直至上清液和下层有机溶液分层清晰为止。B.2.3取上清液，加人1/10体积CTAB/NaCI（65℃预热），及等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1），12000r/min离心5min，重复直至分层清晰。5
SN/T3447—2012
取上清液，加人等体积CTAB沉淀液，颠倒混匀。B.2.5加人0.65倍体积异丙醇，混匀后，12000r/min离心10min。B.2.6
去上清液，保留沉淀，用80%乙醇洗涤沉淀物2～3次，在超净工作台中晾干。B.2.7
灭菌双蒸水或TE缓冲液重悬沉淀物，一20℃保存备用。c.1
PCR试剂与方法
PCR试剂
见表c.1。
试剂名称
5×PCR缓冲液（含镁离子）
dNTP(10 mmol/L)
上游引物（15μmol/L）
下游引物（15μmol/L）
Taq酶(5U/μL)
DNA模板
附录C
（规范性附录）
PCR凝胶电泳试剂与方法
阴性对照、阳性对照和空白对照的设置阴性对照：健康的草莓叶片DNA。阳性对照：草莓簇生植原体DNA。阴性质控：灭菌双蒸水。
PCR反应参数
PCR试剂
加样量Www.bzxZ.net
SN/T3447—2012
补足反应总体积为25.0l
94℃/2min；94℃/1min，60℃/30s，72℃/1min，35个循环；72℃10min。c.2
琼脂糖凝胶电泳试剂及方法
电泳试剂
琼脂糖，50×TAE，6X加样缓冲液，溴化乙锭（EB)，相对分子质量标记物Marker(DL2000）。C.2.2
电泳方法
制备凝胶
将TAE和电泳级琼脂糖按1.0%（质量浓度）配好，在微波炉中熔化混匀，冷却至55℃左右。7
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。