SN/T 3439-2012
基本信息
标准号： SN/T 3439-2012
中文名称：小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3439-2012.Detection and identification of zucchini green mottle mosaic virus.
1范围
SN/T 3439规定了小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。
SN/T 3439适用于可能携带小西葫芦绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物种子和种苗的检疫。
2原理
2.1分类地位
学名:zucchini green mottle mosaic virus
缩写:ZGMMV
分类:烟草花叶病毒属(Tobamovirus)
2.2检疫鉴定依 据
抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的依据。生物学特性和基因组特征参见附录A。
3仪器、设施及试剂
3.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平(感量0.0001g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器(2,5uL、10 μL、20μL、100μL、200μL、1000μL) ;酶联板、研钵等;防虫温室。
3.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂C现附录C)。
4检测样品的制备
4.1 种子样品制备
挑取畸形不成熟的种子播于灭菌土中,置于防虫温室,待长出3~4片真叶后将表现症状的植株编号单独检测,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号,采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联免疫测定和分子检测。
1范围
SN/T 3439规定了小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。
SN/T 3439适用于可能携带小西葫芦绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物种子和种苗的检疫。
2原理
2.1分类地位
学名:zucchini green mottle mosaic virus
缩写:ZGMMV
分类:烟草花叶病毒属(Tobamovirus)
2.2检疫鉴定依 据
抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的依据。生物学特性和基因组特征参见附录A。
3仪器、设施及试剂
3.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平(感量0.0001g)、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机等;微量移液器(2,5uL、10 μL、20μL、100μL、200μL、1000μL) ;酶联板、研钵等;防虫温室。
3.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂(见附录B)、RT-PCR检测试剂C现附录C)。
4检测样品的制备
4.1 种子样品制备
挑取畸形不成熟的种子播于灭菌土中,置于防虫温室,待长出3~4片真叶后将表现症状的植株编号单独检测,未表现症状的植株分组(10株为1组)并编号,采集的叶片分成2份,根据需要分别用于酶联免疫测定和分子检测。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3439—2012
小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of zucchini green mottle mosaic virus2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3439—2012
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：陈青、陈红运、陈岩、廖富荣、李曼、林石明1
1范围
小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法SN/T3439—2012
本标准规定了小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。本标准适用于可能携带小西葫芦绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物种子和种苗的检疫。2原理
2.1分类地位
学名：zucchinigreenmottlemosaicvirus缩写：ZGMMV
分类：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）2.2检疫鉴定依据
抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的依据。生物学特性和基因组特征参见附录A。仪器、设施及试剂
3.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平（感量
1g）、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、uL,20
#L，100uL，200μL，1000μL）；联板、低温冰箱、普通冰箱、离心机等；微量移液器（2.5μL,10研钵等；防虫温室。
3.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂（见附录B)、RT-PCR检测试剂C见附录C)。4检测样品的制备
4.1种子样品制备
挑取畸形不成熟的种子播于灭菌土中，置于防虫温室，待长出3～4片真叶后将表现症状的植株编号单独检测，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联免疫测定和分子检测。
4.2种苗样品制备
有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同4.1。
SN/T3439—2012
4.3检测
酶联免疫吸附测定
把制备好的样品上清液加人已包被ZGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染ZGMMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。
4.3.2PT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染ZGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。
5结果判定与记录
结果判定
酶联测定为阴性后，RT-PCR检测结果呈阴性，判定未检出ZGMMV。酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阳性，判定检出ZGMMV。直接进行RT-PCR检测时，检测结果呈阳性并经序列测定验证后，判定检出ZGMMV。5.2结果记录
记录包括：样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳结果图片。6样品保存
经检验确定携带ZGMMV的样品应在合适条件下保存，种子保存在4℃，病叶在一20℃或者80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。2
生物学特性
附录A
（资料性附录）
ZGMMV生物学和基因组特性
SN/T3439—2012
ZGMMV的寄主包括西葫芦（Cucurbitapepo）、西瓜（Citrullusuulgaris）、甜瓜（cucumismelo）、黄瓜（Cucumissativus）、南瓜（Cucurbitamoschata）、葫芦（agenariasiceraria）。ZGMMV侵染后可引起褪绿斑、花叶、斑驳、畸形症状。ZGMMV主要通过葫芦科种子传播。A.2
基因组特性
ZGMMV基因组为正单链RNA，全长约6.4kb，编码4个蛋白；病毒基因组5\和3\端分别含有段非编码区。
3抗原特性
ZGMMV抗原性强，容易制备高滴度的特异抗体。A.4PCR产物序列（486bp）
ATGCCTTACTCTACCAGCGG TATTCGTTCG CTTCCTGCTT TTTCTAAGTC TTTTTTCCCTTATTTGGAGT TGTATAATTTATTAATAACAAATCAAGGGG CGGCTCTGCA GACGCAAAATGGTAAAGACA
TTTTGCGTGAGTCGCTCGTTGGTTTGCTGTCTTCTGTTGCGTCACCCACTAGTCGCGCATTGCTGCTTTG
CTTCCGGTGTGTTTTATGTGTGGTCTCGTGTCACAGTTTC
ATCGATTCTC
TCTAATCCAT
GCCGCTCACA
GATAGAGCGT
TCTTGA
TCTTCGGTGC TTTGGATTCAAGAAATAGGGTTGAAAACCCT
CTATTGAAGT
GCAATGACGA
CGACTGGCGAAGCTTTGAACGCGGTTAAGCACGACATTCC
TCAGATTTTA
CGCGTCTACA
GGGCGTTTTT
TCTGCTCTGA
ATGAAGGTGC
GTCTACCTCG
CTTTTGAATC
CCGCAGGTTC
TGCTTTTGGTCTCGTGTGGA
SN/T3439—2012
B.1试材
酶联板。
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
包被抗体：特异性的ZGMMV抗体
B.1.3酶标抗体：碱性磷酸酯酶标记的ZGMMV抗体底物：对硝基苯磷酸二钠（pNPP)。B.1.4
PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）NacI
Na2HPO
吐温-20
蒸馏水定容至1L。
D.1.6样品抽提缓冲液（pH7.4）Na2SO
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存
包被缓冲液（pH9.6）
Na2cO3
蒸馏水定容至1L，4℃储存
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4）BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L,4℃储存。
B.1.9底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）MgCl2
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L。4℃储存。程序
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100uL/孔，37℃孵育4h，清空孔中溶液，4
PBST洗涤3次。
B.2.2样品制备
SN/T3439—2012
待测样品按1：10（质量：体积）加人样品抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7500g离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行；空白对照为样品抽提缓冲液。Www.bzxZ.net
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔（或48孔）酶联板，包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100洗涤3次。
B.2.4加酶标抗体
冰箱孵育过夜，酶联板用PBST
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加人到酶联板中，100uL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。
B.2.5加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。
注：实际检测时，孵育温度、PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3结果判定
B.3.1对照孔的OD405值（空白对照孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：阴性对照孔的OD405值<0.15；
阳性对照OD405值/阴性对照ODao值>2；同一样品的OD405值应基本
一致。
B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判定如下样品OD4os值/阴性对照OD4os值>2，判为阳性；样品OD4os值/阴性对照OD405值接近阅值，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证；样品OD4os值/阴性对照OD405值<2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。注：质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。SN/T3439—2012
c.1试剂
TrizoL裂解液。
三氯甲烷。
异丙醇。
75%乙醇。
去离子水（DEPC处理）。
50XTAE
冰醋酸
NazEDTA·2H2037.2g
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1×TAE。.2
实验步骤
总RNA提取
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀后室温保持5min;4℃，12000g离心10min，取上清液；加人0.2mL三氯甲烷并剧烈振荡混匀；4℃，12000g离心10min，取上清液；加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温保持5min；4℃，12000g离心10min，弃上清液；加75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心2min，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30μL去离子水（DEPC处理)中，一20℃保存备用。也可采用等效的试剂盒提取总RNA。
2RT-PCR反应
RT-PCR检测引物见表C.1。cDNA合成体系20μL：在0.2mL反应管中加人总RNA6μL，1μL下游引物（20μmol/L），去离子水4μL，10mmol/LdNTPs1μL，65℃水浴5min，取出后立即放在冰上，加人5×FirstStrand缓冲液4μL，40U/uLRNaseBlockRibonucleaseInhibitor1μL，o.1mol/LDTT2uL，42℃水浴2min，然后再加人200U/uLReverseTranscriptase1μL，混匀后42℃水浴50min，70℃水浴15min，合成cDNA。FirstStrand缓冲液和ReverseTranscriptase的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。RT-PCR检测的引物
检测基因
外壳蛋白
上游引物
下游引物
引物序列（5\-3\）
ATgCCTTACTCTACCAgCg
CAAgACgAggTAgACgAAC
SN/T3439-—2012
PCR反应体系见表C.2。反应参数：94℃5min94℃30s，62℃45s，72℃45s35个循环；72℃7min。
10X×PCR缓冲液（MgCl2plus）
dNTP(10 mmol/L)
上游引物（20μmol/L）
下游引物（20μmol/L）
Taq酶(5U/μL)
cDNA模板
去离子水
C.2.3电泳
制备凝胶
PCR反应体系
补足反应总体积为25μL
配制1.5%（质量浓度）的琼脂糖凝胶。溴化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中（浓度为0.5μg/mL），也可在电泳完成后使用溴化乙锭染色。C.2.3.2电泳
用1μL6X加样缓冲液与5μL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。3结果判定
C.3.1阳性对照在486bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。2阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确，待测样品在486bp处无扩增条带，判定结果为阴性。C.3.2
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小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法Detection and identification of zucchini green mottle mosaic virus2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3439—2012
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：陈青、陈红运、陈岩、廖富荣、李曼、林石明1
1范围
小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法SN/T3439—2012
本标准规定了小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。本标准适用于可能携带小西葫芦绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物种子和种苗的检疫。2原理
2.1分类地位
学名：zucchinigreenmottlemosaicvirus缩写：ZGMMV
分类：烟草花叶病毒属（Tobamovirus）2.2检疫鉴定依据
抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的依据。生物学特性和基因组特征参见附录A。仪器、设施及试剂
3.1仪器与设施
酶联检测仪、电子天平（感量
1g）、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、uL,20
#L，100uL，200μL，1000μL）；联板、低温冰箱、普通冰箱、离心机等；微量移液器（2.5μL,10研钵等；防虫温室。
3.2试剂
酶联免疫吸附测定试剂（见附录B)、RT-PCR检测试剂C见附录C)。4检测样品的制备
4.1种子样品制备
挑取畸形不成熟的种子播于灭菌土中，置于防虫温室，待长出3～4片真叶后将表现症状的植株编号单独检测，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号，采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联免疫测定和分子检测。
4.2种苗样品制备
有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同4.1。
SN/T3439—2012
4.3检测
酶联免疫吸附测定
把制备好的样品上清液加人已包被ZGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染ZGMMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如：种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据试剂或试剂盒的说明操作。具体操作见附录B。
4.3.2PT-PCR检测
分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对照，感染ZGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。
5结果判定与记录
结果判定
酶联测定为阴性后，RT-PCR检测结果呈阴性，判定未检出ZGMMV。酶联测定为阳性后，RT-PCR检测结果呈阳性，判定检出ZGMMV。直接进行RT-PCR检测时，检测结果呈阳性并经序列测定验证后，判定检出ZGMMV。5.2结果记录
记录包括：样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳结果图片。6样品保存
经检验确定携带ZGMMV的样品应在合适条件下保存，种子保存在4℃，病叶在一20℃或者80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。2
生物学特性
附录A
（资料性附录）
ZGMMV生物学和基因组特性
SN/T3439—2012
ZGMMV的寄主包括西葫芦（Cucurbitapepo）、西瓜（Citrullusuulgaris）、甜瓜（cucumismelo）、黄瓜（Cucumissativus）、南瓜（Cucurbitamoschata）、葫芦（agenariasiceraria）。ZGMMV侵染后可引起褪绿斑、花叶、斑驳、畸形症状。ZGMMV主要通过葫芦科种子传播。A.2
基因组特性
ZGMMV基因组为正单链RNA，全长约6.4kb，编码4个蛋白；病毒基因组5\和3\端分别含有段非编码区。
3抗原特性
ZGMMV抗原性强，容易制备高滴度的特异抗体。A.4PCR产物序列（486bp）
ATGCCTTACTCTACCAGCGG TATTCGTTCG CTTCCTGCTT TTTCTAAGTC TTTTTTCCCTTATTTGGAGT TGTATAATTTATTAATAACAAATCAAGGGG CGGCTCTGCA GACGCAAAATGGTAAAGACA
TTTTGCGTGAGTCGCTCGTTGGTTTGCTGTCTTCTGTTGCGTCACCCACTAGTCGCGCATTGCTGCTTTG
CTTCCGGTGTGTTTTATGTGTGGTCTCGTGTCACAGTTTC
ATCGATTCTC
TCTAATCCAT
GCCGCTCACA
GATAGAGCGT
TCTTGA
TCTTCGGTGC TTTGGATTCAAGAAATAGGGTTGAAAACCCT
CTATTGAAGT
GCAATGACGA
CGACTGGCGAAGCTTTGAACGCGGTTAAGCACGACATTCC
TCAGATTTTA
CGCGTCTACA
GGGCGTTTTT
TCTGCTCTGA
ATGAAGGTGC
GTCTACCTCG
CTTTTGAATC
CCGCAGGTTC
TGCTTTTGGTCTCGTGTGGA
SN/T3439—2012
B.1试材
酶联板。
附录B
（规范性附录）
双抗体夹心酶联免疫吸附测定
包被抗体：特异性的ZGMMV抗体
B.1.3酶标抗体：碱性磷酸酯酶标记的ZGMMV抗体底物：对硝基苯磷酸二钠（pNPP)。B.1.4
PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）NacI
Na2HPO
吐温-20
蒸馏水定容至1L。
D.1.6样品抽提缓冲液（pH7.4）Na2SO
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L，4℃储存
包被缓冲液（pH9.6）
Na2cO3
蒸馏水定容至1L，4℃储存
B.1.8酶标抗体稀释缓冲液(pH7.4）BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉
PVP(MW24000~40000)
PBST定容至1L,4℃储存。
B.1.9底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）MgCl2
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L。4℃储存。程序
包被抗体
用包被缓冲液将抗体按说明稀释，加人酶联板的孔中，100uL/孔，37℃孵育4h，清空孔中溶液，4
PBST洗涤3次。
B.2.2样品制备
SN/T3439—2012
待测样品按1：10（质量：体积）加人样品抽提缓冲液，用研钵研磨成浆，7500g离心10min，上清液即为制备好的检测样品。阴性对照、阳性对照作相应的处理或按照说明书进行；空白对照为样品抽提缓冲液。Www.bzxZ.net
B.2.3加样
根据检测需要设计96孔（或48孔）酶联板，包括2个阴性对照孔、2个阳性对照孔、2个空白对照孔和多个待测样品孔。加样量为100洗涤3次。
B.2.4加酶标抗体
冰箱孵育过夜，酶联板用PBST
用酶标抗体稀释缓冲液按说明将酶标抗体稀释至工作浓度，并加人到酶联板中，100uL/孔，37℃孵育1h，PBST洗涤3次。
B.2.5加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL(现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
B.2.6读数
用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。
注：实际检测时，孵育温度、PBST洗涤次数和显色读数时间需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。B.3结果判定
B.3.1对照孔的OD405值（空白对照孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：阴性对照孔的OD405值<0.15；
阳性对照OD405值/阴性对照ODao值>2；同一样品的OD405值应基本
一致。
B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判定如下样品OD4os值/阴性对照OD4os值>2，判为阳性；样品OD4os值/阴性对照OD405值接近阅值，判为可疑样品，需重做一次或用其他方法验证；样品OD4os值/阴性对照OD405值<2，判为阴性。B.3.3若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。注：质量控制标准和结果判定需按照检测抗体或试剂盒中说明书的规定执行。SN/T3439—2012
c.1试剂
TrizoL裂解液。
三氯甲烷。
异丙醇。
75%乙醇。
去离子水（DEPC处理）。
50XTAE
冰醋酸
NazEDTA·2H2037.2g
附录C
（规范性附录）
RT-PCR检测
加去离子水定容至1L。用时加水稀释至1×TAE。.2
实验步骤
总RNA提取
称取0.1g植物组织加液氮研磨成粉末状，迅速将其移入灭菌的1.5mL离心管中，加人1mL的TrizoL试剂，剧烈振荡摇匀后室温保持5min;4℃，12000g离心10min，取上清液；加人0.2mL三氯甲烷并剧烈振荡混匀；4℃，12000g离心10min，取上清液；加0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温保持5min；4℃，12000g离心10min，弃上清液；加75%的乙醇洗涤沉淀，4℃，7500g离心2min，弃乙醇；沉淀于室温下充分干燥后，溶于30μL去离子水（DEPC处理)中，一20℃保存备用。也可采用等效的试剂盒提取总RNA。
2RT-PCR反应
RT-PCR检测引物见表C.1。cDNA合成体系20μL：在0.2mL反应管中加人总RNA6μL，1μL下游引物（20μmol/L），去离子水4μL，10mmol/LdNTPs1μL，65℃水浴5min，取出后立即放在冰上，加人5×FirstStrand缓冲液4μL，40U/uLRNaseBlockRibonucleaseInhibitor1μL，o.1mol/LDTT2uL，42℃水浴2min，然后再加人200U/uLReverseTranscriptase1μL，混匀后42℃水浴50min，70℃水浴15min，合成cDNA。FirstStrand缓冲液和ReverseTranscriptase的用量需要依据反转录酶的品牌进行调整。也可采用一步法RT-PCR试剂盒进行扩增。RT-PCR检测的引物
检测基因
外壳蛋白
上游引物
下游引物
引物序列（5\-3\）
ATgCCTTACTCTACCAgCg
CAAgACgAggTAgACgAAC
SN/T3439-—2012
PCR反应体系见表C.2。反应参数：94℃5min94℃30s，62℃45s，72℃45s35个循环；72℃7min。
10X×PCR缓冲液（MgCl2plus）
dNTP(10 mmol/L)
上游引物（20μmol/L）
下游引物（20μmol/L）
Taq酶(5U/μL)
cDNA模板
去离子水
C.2.3电泳
制备凝胶
PCR反应体系
补足反应总体积为25μL
配制1.5%（质量浓度）的琼脂糖凝胶。溴化乙锭可直接加人琼脂糖凝胶中（浓度为0.5μg/mL），也可在电泳完成后使用溴化乙锭染色。C.2.3.2电泳
用1μL6X加样缓冲液与5μL样品混合，然后将其和适合的DNA相对分子质量标准物分别加入到样品孔中。电泳结束后将琼脂糖凝胶置于紫外透射仪上观察，拍照并保留结果。3结果判定
C.3.1阳性对照在486bp处有扩增片段，阴性对照和空白对照无特异性扩增，待测样品出现与阳性对照一致的扩增条带，可判定为阳性。2阳性对照、阴性对照和空白对照结果正确，待测样品在486bp处无扩增条带，判定结果为阴性。C.3.2
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