中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T3439—2012 小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of zucchini green mottle mosaic virus 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国云南出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：陈青、陈红运、陈岩、廖富荣、李曼、林石明。 1 范围 本标准规定了小西葫芦绿斑驳花叶病毒检疫鉴定的血清学和分子生物学检测方法。 本标准适用于可能携带小西葫芦绿斑驳花叶病毒的葫芦科作物种子和种苗的检疫。 2 原理 2.1 分类地位 学名：zucchini green mottle mosaic virus 缩写：ZGMMV 分类：烟草花叶病毒属（Tobamovirus） 2.2 检疫鉴定依据 抗原特性和基因组特征是检疫鉴定的依据。生物学特性和基因组特征参见附录A。 3 仪器、设施及试剂 3.1 仪器与设施 酶联检测仪、电子天平（感量0.0001 g）、定性PCR仪、电泳仪、电泳槽、凝胶成像系统、恒温水浴、低温冰箱、普通冰箱、离心机、微量移液器（2.5 μL、10 μL、20 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）、酶联板、研钵等；防虫温室。 3.2 试剂 酶联免疫吸附测定试剂（见附录B）、RT-PCR检测试剂（见附录C）。 4 检测样品的制备 4.1 种子样品制备 挑取畸形、不成熟的种子播于灭菌土中，置于防虫温室。待长出3～4片真叶后，将表现症状的植株编号单独检测；未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成2份，根据需要分别用于酶联免疫测定和分子检测。 4.2 种苗样品制备 有症状（如叶片畸形、花叶、斑驳等）的苗木编号单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同4.1。 4.3 检测 4.3.1 酶联免疫吸附测定 把制备好的样品上清液加入已包被ZGMMV抗体的96孔酶联板中，进行DAS-ELISA检测。每个样品平行加入两个孔中。健康植物组织作阴性对照，感染ZGMMV的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照。其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。不同的检测试剂或试剂盒根据其说明进行操作。具体操作见附录B。 4.3.2 RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后进行PCR扩增。健康植物组织作阴性对照，感染ZGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照。具体操作见附录C。 5 结果判定与记录 5.1 结果判定 酶联测定结果为阴性且RT-PCR检测结果为阴性时，判定未检出ZGMMV。 酶联测定结果为阳性且RT-PCR检测结果为阳性时，判定检出ZGMMV。 直接进行RT-PCR检测时，检测结果呈阳性并经序列测定验证后，判定检出ZGMMV。 5.2 结果记录 记录内容包括样品来源、种类、取样人员、原始记录和检测结果等。酶联测定应有酶联板反应的原始数据，RT-PCR检测应有电泳结果图片。 6 样品保存 经检验确定携带ZGMMV的样品应在合适条件下保存。种子保存在4℃条件下，病叶在-20℃或者-80℃冰箱中保存，并做好标记和登记工作。 附录A （资料性附录） ZGMMV生物学和基因组特性 A.1 生物学特性 ZGMMV的寄主包括西葫芦（Cucurbita pepo）、西瓜（Citrullus vulgaris）、甜瓜（Cucumis melo）、黄瓜（Cucumis sativus）、南瓜（Cucurbita moschata）、葫芦（Lagenaria siceraria）。 ZGMMV侵染后可引起褪绿斑、花叶、斑驳、畸形等症状。ZGMMV主要通过葫芦科种子传播。 A.2 基因组特性 ZGMMV基因组为正单链RNA，全长约6.4 kb，编码4个蛋白；病毒基因组5'端和3'端分别含有一段非编码区。 A.3 抗原特性 ZGMMV抗原性强，容易制备高滴度的特异抗体。 A.4 PCR产物序列（486 bp） ATGCCTTACTCTACCAGCGGTATTCGTTCGCTTCCTGCTTTTTCTAAGTCTTTTTTCCCTTATTTGGAGTTGTATAATTTATTAATAACAAATCAAGGGGGCGGCTCTGCAGAC