SN/T 3424-2012.Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. lachr ymans.
1范围
SN/T 3424规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备、检测方法、结果判定及菌株保藏等。
SN/T 3424适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、苗木及其产品的检疫鉴定。
2基本信息
学名:Pseudomonas syringae pv. lachrymans
异名:Pseudomonas lachrymans (Smith & Bryan) Carsner 1918, Bacillus lachrymans (Smith &
Bryan) Holland 1920 , Bacterium burgeri ( Potebnya) Burgvits 1935, Bacterium lachrymans Smith &.Bryan 1915, Chlorobacter lachrymans ( Smith &. Bryan) Patel &. Kulkarni 1951， Phytomonas lachrymans (Smith & Bryan) Bergey et al. 1923, Pseudomonas lachrymans f. cucumis Gorlenko 1961 , Pseudomonas burgeri ( Potebnya) Korobko &. Nikiforuk 1972
分类地位:细菌界(bacteria) ,变形菌门(Proteobacteria) ,r变形菌纲(Gammaproteobacteria),假单胞菌目(Pseudomonadales) ,假单胞菌科( Pseudomonadaceae) ,假单胞菌属( Pseudomonas)。
3方法原理
根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应,对黄瓜种子或产品进行ELISA检测;根据该病菌DNA序列的多态性进行PCR特异性检测,通过电泳条带大小进行结果判定。
4仪器设备和主要试剂
4.1仪器设备
酶标检测仪、生物显微镜、生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统等。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3424—2012
黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法Detection and identification of Pseudomonas syringae pv.lachrymans2012-12-12发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2013-07-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草SN/T3424—2012
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出人境检验检疫局本标准主要起草人：赵文军、陈青、田茜、牟海青、陈红运、鲁洁、李玲、王哲。1范围
黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法SN/T3424—2012
本标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备、检测方法、结果判定及菌株保藏等本标准适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、苗木及其产品的检疫鉴定。2基本信息
学名：Pseudomonassyringaepv.lachrymans异名：Pseudomonaslachrymans（Smith&.Bryan）Carsner1918，Bacilluslachrymans（Smith&Bryan)Holland1920,Bacteriumburgeri（Potebnya)Burgvits1935,Bacterium lachrymansSmith&Bryan1915，Chlorobacterlachrymans（Smith&Bryan）Patel&Kulkarni195l，Phytomonaslachrymans（Smith&Bryan)Bergeyetal.1923,Pseudomonaslachrymansf.cucumisGorlenko1961,Pseudomonasburgeri（Potebnya）Korobko&.Nikiforuk1972分类地位：细菌界（bacteria），变形菌门（Proteobacteria），-变形菌纲（Gammaproteobacteria），假单胞菌目（Pseudomonadales），假单胞菌科（Pseudomonadaceae），假单胞菌属（Pseudomonas）传播途径：带菌种子是远距离传播的主要方式，病菌由气孔、伤口、水孔侵人寄主，通过灌水、风雨、气流、昆虫及农事作业在田间传播蔓延。黄瓜细菌性角斑病菌的其他信息参见附录A。3方法原理
根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应，对黄瓜种子或产品进行ELISA检测；根据该病菌DNA序列的多态性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定。仪器设备和主要试剂
仪器设备
酶标检测仪、生物显微镜、生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统等。
2主要试剂
除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCRPremix、牛肉膏蛋白陈、胰蛋白陈、K,HPO,、KH,PO4、MgSO、琼脂，ELISA检测试剂见附录B。5检疫鉴定方法
检测步骤
对叶片、幼苗等可直接进行5.3ELISA或5.4PCR检测，对种子可进行5.2种植观察或直接进行1
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5.3ELISA或5.4PCR检测。若结果为阳性，进行5.5，对可疑菌株再进行5.3ELISA及5.4PCR检测确认，若仍为阳性最后进行5.6生物学接种。5.2种植观察
取2000粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，18℃～26℃，相对湿度75%以上，待长出3～4片叶后观察，若种植期间有发病幼苗，且表现出黄瓜角斑病苗期典型症状（参见附录A)，则可采集可疑病株进行5.3ELISA或5.4PCR检测。若该批次种植苗未表现症状，则采集无症状植株叶片分组，进行5.3ELISA或5.4PCR检测。5.3ELISA检测
将种子、叶片或幼苗等进行ELISA检测，每个样品平行加到两个：孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染黄瓜细菌性角斑病菌的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。具体操作见附录B。
PCR检测
以菌株、叶片或种子的DNA为模板，采用特异性引物PSL-FPSL-R对样品进行PCR检测，用黄瓜细菌性角斑病菌株作阳性对照，用非黄瓜细菌性角斑病菌的植物病厂原细菌作阴性对照，用无菌水作空白对照，扩增产物进行电泳分析。在阳性对照扩增片段大小为179bp单带，阴性及空白对照无条带，样品扩增结果与阳性对照一致，可判定PCR检测结果为阳性。具体操作步骤和试剂配制见附录C。5.5病原菌分离
具体操作步骤见附录D。对纯化的可疑菌落进行5.3ELISA及5.4PCR检测。生物学接种
采用刺伤喷雾接种，接种后塑料袋保湿24h，对照喷无菌水黄瓜：潜育期5d，黄瓜上表现为多角形水浸状病斑。6结果判定
经5.3ELISA方法或5.4PCR方法检测结果为阴性，可判定该样品不携带黄瓜细菌性角斑病菌。若检测结果为阳性，初步判定该样品携带黄瓜细菌性角斑病菌，需进行分离培养后检测确认。样品经5.5病原菌分离培养后可疑菌落进行5.3及5.4检测结果为阳性，并经5.6生物学接种后显示典型症状，即可判定该样品携带黄瓜细菌性角斑病菌。若该部分检测结果为阴性，可判定该样品不携带黄瓜细菌性角斑病菌。
7菌株保藏
分离并最终鉴定为黄瓜细菌性角斑病菌的菌株应转接到试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃低温冰箱中保存，定期（30d～60d)转接，必要时冻干后长期保存。2
A.1英文名
Cucurbit angular leaf spot。A.2分布
附录A
（资料性附录）
黄瓜细菌性角斑病菌其他信息
在世界各地均有分布，主要分布在世界上温暖，潮湿的地区。具体如下：SN/T3424-2012
欧洲：奥地利、白俄罗斯、捷克、斯洛伐克、丹麦、南斯拉夫、法国、德国、英国、希腊、匈牙利、意大利、摩尔多瓦、荷兰、波兰、罗马尼亚、俄罗斯、瑞士、乌克兰亚洲：中国、印度、伊朗、以色列、日本、哈萨克斯坦、朝鲜、韩国、老挝、菲律宾、新加坡、塔吉克斯坦、泰国、土耳其、乌兹别克斯坦。非洲：阿尔及利亚、埃及、加蓬、肯尼亚、南非、津巴布韦中美洲：马提尼克、瓜德罗普岛、尼加拉瓜、波多黎各、特立尼达、多巴哥。北美洲：加拿大、美国。
南美洲：阿根廷、巴西、哥伦比亚、委内瑞拉。大洋洲：澳大利亚、新西兰。
A.3寄主范围
黄瓜（Cucumissativus）、冬瓜（Benincasahispida）、西瓜（Citrulluslanatus）、西印度黄瓜（Cucumisauguria）、甜瓜（Cucumismelo）、南瓜（Cucurbitamoschata）、丝瓜（Luffaacutangula）、佛手瓜(Sechiumedule）等。
A.4危害症状
主要危害叶片、叶柄、卷须和果实，苗期至成株期均可受害。幼苗期子叶染病，开始产生近圆形水浸状凹陷斑，以后变褐色干枯。成株期叶片上初生针头大小水浸状斑点，病斑扩大受叶脉限制呈多角形，黄褐色，湿度大时，叶背面病斑上产生乳白色粘液，干后形成一层白色膜，或白色粉末状物，病斑后期质脆，易穿孔。茎、叶柄及幼瓜条上病斑水浸状，近圆形至椭圆形，后呈淡灰色，病斑常开裂，潮湿时瓜条上病部溢出菌脓，病斑向瓜条内部扩展，沿维管束的果肉变色，一直延伸到种子，引起种子带菌。病瓜后期腐烂，有臭味，幼瓜被害后常腐烂、早落A.5菌体形态及培养特性
菌体短杆状相互连接呈链状，端生1～5根鞭毛，大小（0.7μm～0.9μm）×（1.4μm～2μm）有荚3
SN/T3424—2012
膜，无芽孢，革兰氏染色阴性。在金氏B平板培养基上，菌落白色，近圆或略呈不规则形，扁平，中央凸起，污白色，不透明，具同心环纹，边缘一圈薄且透明，菌落直径5mm7mm，外缘有放射状细毛状物，具黄绿色荧光。该菌属好气性，不耐酸性环境。生长适温24℃～28℃，范围4℃～39℃，48℃～50℃经10min致死。
酶标抗体
附录B
（规范性附录）
PTA-ELISA检测
碱性磷酸酯酶标记的黄瓜细菌性角斑病菌抗体B.1.2
对硝基苯磷酸二钠(pNPP)。
PBST缓冲液（洗涤缓冲液pH7.4）NaCl
Na2HPO
吐温-20
SN/T3424—2012
加人900mL蒸馏水溶解，用NaOH或HCI调节pH值到7.4，蒸馏水定容至1L。每升PBS中加人0.5mL的吐温-20。样品抽提缓冲液（pH7.4）
Na2SO3
PVP（MW24000~40000）
用NaOH或HCI调节pH值到7.4。4℃储存。B.1.5
包被缓冲液（pH9.6）
NazcO3
加人900mL蒸馏水溶解，用HCI调节pH值到9.6，蒸馏定容至1L。4℃储存。B.1.6
封闭缓冲液
脱脂干奶粉
酶标抗体稀释缓冲液（pH7.4）
SN/T3424—2012
BSA(牛血清白蛋白)或脱脂奶粉
用NaOH或HCI调节pH值到7.4。4℃储存。B.1.8底物（pNPP)缓冲液（pH9.8）MgCl2
二乙醇胺
溶于800mL蒸馏水中，用HCI调pH值至9.8，蒸馏水定容至1L。4℃储存。B.2程序
包被样品
待测样品按1：4（质量：体积）加人包被缓冲液，用研钵研磨成浆，轻微离心后上清液即为制备好的检测样品。健康的植物组织作阴性对照，感染黄瓜细菌性角斑病菌的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照，酶联板中加入制备好的检测样品、空白对照、阴性对照、阳性对照，100μL/孔，加盖，4℃冰箱孵育过夜，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4～6次。B.2.2封闭
在每一个检测孔中加入200L封闭缓冲液，将酶联板密封，在37℃下孵育1h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4～6次。
B.2.3加检测抗体
用酶标抗体稀释缓冲液稀释探针抗体，在每个检测孔中加人100uL，将酶联板密封，在37℃下孵育2h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤4～6次加酶标抗体
用酶标缓冲液稀释酶标抗体，在每个检测孔中加人100μL，将酶联板密封，在37℃下孵育1h，清空酶联板孔中溶液，PBST洗涤
4~6次。
加底物
将底物pNPP加人到底物缓冲液中使终浓度为1mg/mL（现配现用），按100μL/孔，加人到酶联板中，室温避光孵育。
用酶标仪在30min、1h和2h于405nm处读OD值。B.3结果判定
B.3.1对照孔的OD405值（缓冲液孔、阴性对照及阳性对照孔），应该在质量控制范围内，即：空白对照孔和阴性对照孔的ODas值<0.15，当阴性对照孔的ODao5值<0.05时，按0.05计算。阳性对照有明显的颜色反应，阳性对照OD4o5值/阴性对照OD05值>2,孔的重复性基本一致。B.3.2在满足了B.3.1质量要求后，结果原则上可判定如下：6
样品OD405值/阴性对照OD405值明显>2，判定为阳性。SN/T3424—2012
样品OD4os值/阴性对照ODaos值在阈值附近，判定为可疑样品，需重复一次，或用其他方法加以验证。
样品OD405值/阴性对照OD0s值明显<2，判定为阴性。若满足不了B.3.1质量要求，则不能进行结果判定。
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