SN/T3424—2012 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 黄瓜细菌性角斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Pseudomonas syringae pv. lachrymans 2012-12-12发布 2013-07-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 请注意，本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：赵文军、陈青、田茜、牟海青、陈红运、鲁洁、李玲、王哲。 1 范围 本标准规定了黄瓜细菌性角斑病菌的样品制备、检测方法、结果判定及菌株保藏等。 本标准适用于可能携带黄瓜细菌性角斑病菌的黄瓜种子、苗木及其产品的检疫鉴定。 2 基本信息 学名：Pseudomonas syringae pv. lachrymans 异名： Pseudomonas lachrymans（Smith & Bryan）Carsner 1918； Bacillus lachrymans（Smith & Bryan）Holland 1920； Bacterium burgeri（Potebnya）Burgvits 1935； Bacterium lachrymans Smith & Bryan 1915； Chlorobacter lachrymans（Smith & Bryan）Patel & Kulkarni 1951； Phytomonas lachrymans（Smith & Bryan）Bergey et al. 1923； Pseudomonas lachrymans f. cucumis Gorlenko 1961； Pseudomonas burgeri（Potebnya）Korobko & Nikiforuk 1972。 分类地位： 细菌界（Bacteria），变形菌门（Proteobacteria），γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria），假单胞菌目（Pseudomonadales），假单胞菌科（Pseudomonadaceae），假单胞菌属（Pseudomonas）。 传播途径： 带菌种子是远距离传播的主要方式。病菌由气孔、伤口、水孔侵入寄主，通过灌水、风雨、气流、昆虫及农事作业在田间传播蔓延。 黄瓜细菌性角斑病菌的其他信息参见附录A。 3 方法原理 根据黄瓜细菌性角斑病菌与抗体之间的特异性反应，对黄瓜种子或产品进行ELISA检测；根据该病菌DNA序列的多态性进行PCR特异性检测，通过电泳条带大小进行结果判定。 4 仪器设备和主要试剂 4.1 仪器设备 酶标检测仪、生物显微镜、生物安全柜、高压灭菌锅、生化培养箱、离心机、PCR仪、电泳设备、凝胶成像系统等。 4.2 主要试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯。PCR Premix、牛肉膏蛋白胨、胰蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、琼脂等。ELISA检测试剂见附录B。 5 检疫鉴定方法 5.1 检测步骤 对叶片、幼苗等可直接进行5.3 ELISA或5.4 PCR检测；对种子可进行5.2种植观察或直接进行5.3 ELISA或5.4 PCR检测。 若结果为阳性，进行5.5检测；对可疑菌株再进行5.3 ELISA及5.4 PCR检测确认。若仍为阳性，最后进行5.6生物学接种。 5.2 种植观察 取2000粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，在18℃～26℃、相对湿度75%以上条件下培养。待长出3～4片叶后观察。 若种植期间有发病幼苗，且表现出黄瓜角斑病苗期典型症状（参见附录A），则可采集可疑病株进行5.3 ELISA或5.4 PCR检测。 若该批次种植苗未表现症状，则采集无症状植株叶片分组，进行5.3 ELISA或5.4 PCR检测。 5.3 ELISA检测 将种子、叶片或幼苗等进行ELISA检测，每个样品平行加入两个孔中。 健康植物组织作阴性对照，感染黄瓜细菌性角斑病菌的植物组织作阳性对照，样品提取缓冲液作空白对照。其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片）应尽量与检测样品一致。 具体操作见附录B。 5.4 PCR检测 以菌株、叶片或种子的DNA为模板，采用特异性引物PSL-F、PSL-R对样品进行PCR检测。 用黄瓜细菌性角斑病菌株作阳性对照，用非黄瓜细菌性角斑病菌的植物病原细菌作阴性对照，用无菌水作空白对照。 扩增产物进行电泳分析。在阳性对照扩增片段大小为179 bp单带，阴性及空白对照无条带，样品扩增结果与阳性对照一致，可判定PCR检测结果为阳性。 具体操作步骤和试剂配制见附录。