SN/T 3989—2014 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范 Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees 发布：2014-11-19 实施：2015-05-01 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国吉林出入境检验检疫局、吉林大学、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：宋战昀、冯新、王振国、郑腾、刘金华、孟日增、魏春艳、孟庆峰、肖成蕊、王伟利。 1 范围 本标准规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测方法，包括透射电子显微镜观察、RT-PCR方法及荧光RT-PCR方法。 本标准适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫工作。 2 规范性引用文件 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括修改单）适用于本文件。 3 现场检疫 3.1 蜂群检查 观察蜂群行为是否异常，箱外是否有不正常蜜蜂或残翅幼蜂，检查蜂群爬行等异常情况，将可疑蜂群挑出进一步检查。 3.2 箱内检查 检查蜂群箱内是否存在异常行为或形态的蜜蜂，观察封盖情况及巢脾情况，查看是否存在死幼虫或寄生物等异常表现。 3.3 个体检查 抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前死蜂，检查中肠是否病变。若出现囊内充满蜜汁、中肠乳白且失去弹性、后肠积黄褐色粪便等症状，可疑为蜜蜂急性麻痹病，应及时隔离并送检。 4 实验室诊断 4.1 透射电子显微镜观察 4.1.1 设备 透射电子显微镜（30万倍）、冷冻高速离心机、可调移液器、水浴锅等。 4.1.2 材料与试剂 PBS缓冲液、三氯甲烷、2%醋酸铀溶液、滤纸、洁净玻璃、铜网等。 4.1.3 样品采集与保存 依据GB/T 18088采样。采集有症状或无症状蜂群的成蜂或幼虫20～30只，置无菌容器中并迅速液氮保存备用。 4.1.4 样品处理 将蜜蜂或幼虫样品与PBS混匀研磨后加入三氯甲烷匀浆处理，反复离心提取上清，经多次纯化后获得病毒悬液备用。 4.1.5 透射电镜观察 将病毒悬液滴加于铜网，经负染处理后在透射电子显微镜下观察，记录病毒粒子形态、结构及大小特征。 4.1.6 结果判定 若观察到均一球形二十面体病毒粒子，直径约28nm～30nm，则可初步判定存在蜜蜂急性麻痹病病毒。