SN/T 3989-2014
基本信息
标准号： SN/T 3989-2014
中文名称：蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 3989-2014.Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees.
1范围
SN/T 3989规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察、RT-PCR方法、荧光RT-PCR方法。
SN/T 3989适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T18088出人境动物检疫采样
3现场检疫
3.1蜂群检查
对待检的所有蜂群进行箱外观察观察蜂群的行为是否异常箱外是否有不正常的虫尸和有残翅的幼蜂爬行等,从中把可疑有病的蜂群挑出来,进-步进行箱内检查。
3.2箱内检查
提脾观察,主要查看箱内有无异常的拖弃物，蜜蜂是否有行为、形态等方面的异常。封盖是否异常，巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有死幼虫幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等。
3.3 个体检查
抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死峰，拉出中肠检查是否有病变症状,若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似惠蜜蜂急性麻痹病，及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离场,并采样送实验室进一步确诊。
1范围
SN/T 3989规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察、RT-PCR方法、荧光RT-PCR方法。
SN/T 3989适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T18088出人境动物检疫采样
3现场检疫
3.1蜂群检查
对待检的所有蜂群进行箱外观察观察蜂群的行为是否异常箱外是否有不正常的虫尸和有残翅的幼蜂爬行等,从中把可疑有病的蜂群挑出来,进-步进行箱内检查。
3.2箱内检查
提脾观察,主要查看箱内有无异常的拖弃物，蜜蜂是否有行为、形态等方面的异常。封盖是否异常，巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有死幼虫幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等。
3.3 个体检查
抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死峰，拉出中肠检查是否有病变症状,若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似惠蜜蜂急性麻痹病，及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离场,并采样送实验室进一步确诊。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T3989-2014
蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范
Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3989—2014
本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林大学、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：宋战昀、冯新、王振国、郑腾、刘金华、孟日增、魏春艳、孟庆峰、肖成蕊、王伟利。1
1范围
蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范
SN/T3989—2014
本标准规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察、RT-PCR方法、荧光RT-PCR方法。
本标准适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样bzxZ.net
3现场检疫
3.1蜂群检查
观察蜂群的行为是否异常、箱外是否有不正常的虫户和有残翅的对待检的所有蜂群进行箱外观察幼蜂爬行等，从中把可疑有病的蜂群挑出来，进一步进行箱内检查
箱内检查
的拖弃物，蜜蜂
是否有行为、形态等方面的异常。封盖是否异常，提脾观察，主要查看箱内有无异常，幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等。巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有列死幼虫
3.3个体检查
抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死蜂，拉出中肠检查是否有病变症状，若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似患蜜蜂急性麻痹病、及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离场，并采样送实验室进一步确诊。4实验室诊断
4.1透射电子显微镜观察
4.1.1设备
透射电子显微镜（放大倍数：30万倍）、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）、水浴锅。4.1.2材料和试剂
4.1.2.1PBS。
SN/T3989-2014
三氯甲烷。
3%磷钨酸溶液。
滤纸。
洁净玻璃。
铜网。
4.1.3样品采集
4.1.3.1月
成蜂样品的采集和保存
依据GB/T18088，现场检疫对有临床症状的蜂群，用灭菌后的镊子挑取蜂箱内巢脾上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20～30只，分别装人无菌的容器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。无临床症状的蜂群，随机挑取箱内蜜蜂20～30只，分别装入无菌的容器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。4.1.3.2幼虫样品的采集和保存
依据GB/T18088，有临床症状的蜂群，无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾（不小于20cm\），或无菌挑取单个病虫或死虫若干只装入无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存供检测用。无临床症状的蜂群，随机无菌挑取幼虫若干只分别装人无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存，供检测用。4.1.4样品处理
患病蜜蜂或幼虫3～5只，与2mL的PBSpH7.6)混匀，充分研磨，再加人等量的三氯甲烷，匀浆10min，然后5000r/min离心10min，取上清加人等体积的三氯甲烷，在37℃40℃水浴中振摇10min，5000r/min离心10min，上清继续用此法处理2～4次。取上清，15000r/min离心30min，取上清，35000r/min离心1h，弃去上清，用适量PBS重悬沉淀即为病毒悬液。4.1.5透射电镜观察
4.1.5.1取病毒悬液，滴一小滴于腊盘上。取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置3min～5min，取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，稍晾干。4.1.5.2取2%醋酸铀溶液，滴一小滴于腊盘上。吸附有样品的铜网放置于染液表面（样品与染液接触），静置3min～5min。取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，白炽灯下晾干。4.1.5.3置于透射电子显微镜下观察，观察条件一般为加速电压：80kV～100kV，放大倍数：20万～30万倍，观察和记录病毒粒子形态、结构、长度和直径，并拍摄病毒粒子照片。4.1.6结果判定
蜜蜂急性麻痹病病毒粒子电镜照片参见附录A。若发现均一的直径为28nm～30nm，呈球型二十面体的病毒粒子，可初步判断为急性麻痹病病毒。若发现长短不一的椭圆形不等轴病毒粒子，长30nm～65nm，宽22nm，可初步判断为慢性麻痹病病毒。病毒的进一步确诊，须结合待检样品的现场检疫、生物学特性或分子生物学检测结果进行鉴定。4.2RT-PCR方法
4.2.1设备
梯度PCR扩增仪、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100uL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）、电泳系统、凝胶成像仪系统、电子天平（感量0.01g）。2
4.2.2材料和试剂
4.2.2.1引物：
上游引物F1:5'-TGAGAACACCTGTAATGTGG-3”下游引物R1:5-ACCAGAGGGTTGACTGTGTG-3”扩增的目的片段为蜜蜂急性麻痹病病毒的VP3基因，扩增片段452bp。4.2.2.2阳性对照：蜜蜂急性麻痹病病毒阳性核酸，由指定单位提供。4.2.2.3RNA提取试剂。
SN/T3989—2014
4.2.2.4其他试剂：DEPC水、AMV反转录酶（5U/μL）、AMVRT5X缓冲液、TaqDNA聚合酶(5U/μL）、10×缓冲液（含Mg2+）、dNTPs(每种浓度均为10mmol/L)、RNasin（40U/μL）、琼脂糖（电泳纯）、溴化乙锭（10mg/mL）、分子量标准（100bp~1000bp）、电泳缓冲液、加样缓冲液、无水乙醇。4.2.3样品采集
具体参见4.1.3。
4.2.4RNA提取
4.2.4.1RNA提取按QIAGEN\公司的RNA抽提试剂盒（RneasyMiniKit）进行，选取不超过30mg待检样品，置于DEPC处理过的研钵中，加入液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase的1.5mL离心管中。
4.2.4.2加人600μL缓冲液RLT，颠倒混匀，高速涡旋振荡30s，12000r/min离心3min，取上清液，转移到另一个1.5mL离心管。
4.2.4.3加入600L70%的乙醇，立即吹打混匀。4.2.4.4将吸附柱置于收集管中，将4.2.4.3中混匀的混合物吸人吸附柱中，10000r/min离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。4.2.4.5加人700μL缓冲液RW1到吸附柱中，10000r/min离心15，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4.2.4.6加人500μL缓冲液RPE到吸附柱中，10000r/min离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4.2.4.7加人500μL缓冲液RPE到吸附柱中，10000r/min离心2min，取出吸附柱。4.2.4.8将吸附柱中置于新的收集管中，12000r/min离心1min，以去除残留的BufferRPE。4.2.4.9将吸附柱中置于1.5mL离心管中，加人30μL～50μLDEPC水，10000r/min离心1min，离心所得溶液中即含有RNA。含有RNA的溶液应在2h内进行RT-PCR扩增，否则应在一70℃的条件下保存。
4.2.4.10RNA提取可选用等效的商品化试剂盒或等效的提取方法。4.2.5RT-PCR
4.2.5.1反转录合成cDNA
反应体系：AMVRT5×缓冲液4μL、dNTPs(2.5mmol/L)2.5μL、RNasin(40U/μL)1μL、AMV反转录酶（5U/μL)1μL、随机引物1μL、模板RNA5μL，加DEPC水至20μL。盖紧管盖，500r/min离心30S。
使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐QIAGEN的产品，标准的1)
使用者可以使用其他公司的同类产品。3
SN/T3989—2014
反应条件：42℃60min，95℃5min，冰浴5min。4.2.5.2PCR扩增
反应体系：10×缓冲液（含Mg2+）2.5μL、dNTPs（2.5mmol/L）2.5μL、引物F1和R1（20μmol/L）各1μL、TagDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL、模板cDNA1μL、加DEPC水至25μL，盖紧管盖，500r/min离心30S。
反应条件：94℃5min，94℃30s、58℃30s、72℃45s、30个循环72℃10min，4℃保温。4.2.5.3琼脂糖凝胶电泳
用TBE电泳缓冲液（见B.1)配制1%的琼脂糖凝胶平板，其中含有1μg/mLEB(见B.2）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6uLPCR产物和2uL上样缓冲液（见B.3）混勾后加人样品孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。
4.2.5.4测序
使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小452bp的DNA片段，应对其进行测序，参考序列见C.14.2.6结果判定
经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条452bp的DNA片段而阴性对照和空白对照没有核酸条带。待检样品经核酸扩增电泳后，在相应452bpDNA位置上有条带者并经测序验证者为阳性。无条带或条带的大小不是452bp的为阴性4.3荧光RT-PCR方法
4.3.1设备
高速离心机、微量可调移液器（100μL~1000μL、20μL~200μL、荧光定量PCR扩增仪、台式冷冻
平（感量0.01g）。
2~200.5~10电子天
材料和试剂
引物和探针
上游引物F2：5-TCCTATATCGACGACGAAAGACAA-3”
下游引物R2:5'-ATGACCATGCGCTTGATA-3探针
P1:5-FAM-TTTCCCCGGACTTGAC-TAMRA-3阳性对照：蜜蜂急性麻痹病病毒阳性核酸。4.3.2.2
RNA提取试剂盒。
一步法荧光RT-PCR试剂盒。
其他试剂：DEPC水、无水乙醇。4.3.3
样品采集
具体参见4.1.3。
4.3.4RNA提取
具体参见4.2.4。
4.3.5荧光RT-PCR检测
4.3.5.1扩增试剂配制
SN/T3989—2014
采用一步法荧光RT-PCR扩增可选用等效的商品化试剂盒，下面以TIANGEN2\公司的一步法荧光RT-PCR扩增试剂盒（QuantonestepqRT-PCRkit）进行扩增。在一个20omLPCR管中加人2XQuantOneStepProbeqRT-PCRMastermix12.5μL、HotmasterTagpolymerase(2.5U/mL)1μL、QuantRTase0.7μL、引物F2和R2终浓度0.25μmol/L、探针P1终浓度0.20μmol/L，补充DEPC水至25μL。盖紧管盖，500r/min离心30s。4.3.5.2荧光RT-PCR检测
离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：a）
第一阶段，反转录50℃
/30min;
第二阶段，预变性92℃73min；
第三阶段，92℃/10s，45℃/30s.55min,5
第四阶段，92℃/10s，55℃/309.68℃/30s收集荧光。
结果判定
结果分析条件设定
循环：
个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
质控标准
4.3.6.2.1
4.3.6.2.2
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应
结果描述及判定
4.3.6.3.1
4.3.6.3.2
4.3.6.3.3
，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。28.0
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无蜜蜂急性用麻痹病病毒。
阳性：Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在蜜蜂急性麻痹病病毒。有效原则：Ct>30.0的样本建议重做。重做结果
t值者为阴性，否则为阳性。必要时，可对扩增片段进行，测序结果与附录B.2参考序列同源性较高为阳性。5综合判定
经过现场检疫及透射电子显微镜观察，疑似蜜蜂急性麻痹病的样品须经RT-PCR方法或荧光RTPCR方法确认阳性后，方可判为蜜蜂急性麻痹病阳性。蜜蜂急性麻痹病参见附录D。
2）使用TIANGEN公司的一步法荧光RT-PCR试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐TIANGEN的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。5
SN/T3989—2014
附录A
（资料性附录）
蜜蜂急性麻痹病病毒粒子和蜜蜂慢性麻痹病病毒粒子透射电镜照片注：引自ColinHawthornDenholmB.Sc.1999图A.1
蜜蜂急性麻痹病病毒粒子透射电镜照片（80KV，30万倍）注：引自AuroreChevin.2012。
蜜蜂慢性麻痹病病毒粒子透射电镜照片（80KV，30万倍）图A.2
TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
加水至
1000mL
5mol/L的盐酸调pH到8.0。
EB（核酸染色剂）
附录B
（规范性附录）
试剂配制
用水配制成10mg/mL的浓缩液，使用时每100mL电泳液或琼脂中加5μL。B.3
上样缓冲液
每100mL溶液中含：溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。SN/T3989—2014
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蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范
Quarantine protocol for acute bee paralysis of honey bees2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T3989—2014
本标准起草单位：中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、吉林大学、中华人民共和国福建出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：宋战昀、冯新、王振国、郑腾、刘金华、孟日增、魏春艳、孟庆峰、肖成蕊、王伟利。1
1范围
蜜蜂急性麻痹病检疫技术规范
SN/T3989—2014
本标准规定了蜜蜂急性麻痹病的病原检测，包括病原透射电子显微镜观察、RT-PCR方法、荧光RT-PCR方法。
本标准适用于蜜蜂急性麻痹病的检疫2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18088出人境动物检疫采样bzxZ.net
3现场检疫
3.1蜂群检查
观察蜂群的行为是否异常、箱外是否有不正常的虫户和有残翅的对待检的所有蜂群进行箱外观察幼蜂爬行等，从中把可疑有病的蜂群挑出来，进一步进行箱内检查
箱内检查
的拖弃物，蜜蜂
是否有行为、形态等方面的异常。封盖是否异常，提脾观察，主要查看箱内有无异常，幼虫或成年蜂身上是否携带有寄生物等。巢脾上幼虫是否有病态表现及是否有列死幼虫
3.3个体检查
抽检蜂箱内蜜蜂及巢门前的死蜂，拉出中肠检查是否有病变症状，若囊内充满蜜汁、中肠呈乳白色并失去弹性、后肠积蓄黄褐色粪便则为疑似患蜜蜂急性麻痹病、及时把患病或疑似患病的蜂群撤离隔离场，并采样送实验室进一步确诊。4实验室诊断
4.1透射电子显微镜观察
4.1.1设备
透射电子显微镜（放大倍数：30万倍）、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100μL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）、水浴锅。4.1.2材料和试剂
4.1.2.1PBS。
SN/T3989-2014
三氯甲烷。
3%磷钨酸溶液。
滤纸。
洁净玻璃。
铜网。
4.1.3样品采集
4.1.3.1月
成蜂样品的采集和保存
依据GB/T18088，现场检疫对有临床症状的蜂群，用灭菌后的镊子挑取蜂箱内巢脾上或蜂箱底部带有典型病状的蜜蜂，以及在蜂箱前爬行的垂死蜜蜂和死亡蜜蜂20～30只，分别装人无菌的容器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。无临床症状的蜂群，随机挑取箱内蜜蜂20～30只，分别装入无菌的容器中，尽快转移到液氮中保存，供检测用。4.1.3.2幼虫样品的采集和保存
依据GB/T18088，有临床症状的蜂群，无菌割取一小块带有病虫或死虫的巢脾（不小于20cm\），或无菌挑取单个病虫或死虫若干只装入无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存供检测用。无临床症状的蜂群，随机无菌挑取幼虫若干只分别装人无菌的小试管内，尽快转移到液氮中保存，供检测用。4.1.4样品处理
患病蜜蜂或幼虫3～5只，与2mL的PBSpH7.6)混匀，充分研磨，再加人等量的三氯甲烷，匀浆10min，然后5000r/min离心10min，取上清加人等体积的三氯甲烷，在37℃40℃水浴中振摇10min，5000r/min离心10min，上清继续用此法处理2～4次。取上清，15000r/min离心30min，取上清，35000r/min离心1h，弃去上清，用适量PBS重悬沉淀即为病毒悬液。4.1.5透射电镜观察
4.1.5.1取病毒悬液，滴一小滴于腊盘上。取铜网使有支持膜的表面与样品液表面接触，静置3min～5min，取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，稍晾干。4.1.5.2取2%醋酸铀溶液，滴一小滴于腊盘上。吸附有样品的铜网放置于染液表面（样品与染液接触），静置3min～5min。取出铜网，用滤纸吸去多余的液滴，白炽灯下晾干。4.1.5.3置于透射电子显微镜下观察，观察条件一般为加速电压：80kV～100kV，放大倍数：20万～30万倍，观察和记录病毒粒子形态、结构、长度和直径，并拍摄病毒粒子照片。4.1.6结果判定
蜜蜂急性麻痹病病毒粒子电镜照片参见附录A。若发现均一的直径为28nm～30nm，呈球型二十面体的病毒粒子，可初步判断为急性麻痹病病毒。若发现长短不一的椭圆形不等轴病毒粒子，长30nm～65nm，宽22nm，可初步判断为慢性麻痹病病毒。病毒的进一步确诊，须结合待检样品的现场检疫、生物学特性或分子生物学检测结果进行鉴定。4.2RT-PCR方法
4.2.1设备
梯度PCR扩增仪、台式冷冻高速离心机、微量可调移液器（100uL～1000μL、20μL～200μL、2μL～20μL、0.5μL～10μL）、电泳系统、凝胶成像仪系统、电子天平（感量0.01g）。2
4.2.2材料和试剂
4.2.2.1引物：
上游引物F1:5'-TGAGAACACCTGTAATGTGG-3”下游引物R1:5-ACCAGAGGGTTGACTGTGTG-3”扩增的目的片段为蜜蜂急性麻痹病病毒的VP3基因，扩增片段452bp。4.2.2.2阳性对照：蜜蜂急性麻痹病病毒阳性核酸，由指定单位提供。4.2.2.3RNA提取试剂。
SN/T3989—2014
4.2.2.4其他试剂：DEPC水、AMV反转录酶（5U/μL）、AMVRT5X缓冲液、TaqDNA聚合酶(5U/μL）、10×缓冲液（含Mg2+）、dNTPs(每种浓度均为10mmol/L)、RNasin（40U/μL）、琼脂糖（电泳纯）、溴化乙锭（10mg/mL）、分子量标准（100bp~1000bp）、电泳缓冲液、加样缓冲液、无水乙醇。4.2.3样品采集
具体参见4.1.3。
4.2.4RNA提取
4.2.4.1RNA提取按QIAGEN\公司的RNA抽提试剂盒（RneasyMiniKit）进行，选取不超过30mg待检样品，置于DEPC处理过的研钵中，加入液氮进行研磨，将研磨得到的粉末，快速转移至无RNase的1.5mL离心管中。
4.2.4.2加人600μL缓冲液RLT，颠倒混匀，高速涡旋振荡30s，12000r/min离心3min，取上清液，转移到另一个1.5mL离心管。
4.2.4.3加入600L70%的乙醇，立即吹打混匀。4.2.4.4将吸附柱置于收集管中，将4.2.4.3中混匀的混合物吸人吸附柱中，10000r/min离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。4.2.4.5加人700μL缓冲液RW1到吸附柱中，10000r/min离心15，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4.2.4.6加人500μL缓冲液RPE到吸附柱中，10000r/min离心15s，倒掉废液，将吸附柱重新放回收集管中。
4.2.4.7加人500μL缓冲液RPE到吸附柱中，10000r/min离心2min，取出吸附柱。4.2.4.8将吸附柱中置于新的收集管中，12000r/min离心1min，以去除残留的BufferRPE。4.2.4.9将吸附柱中置于1.5mL离心管中，加人30μL～50μLDEPC水，10000r/min离心1min，离心所得溶液中即含有RNA。含有RNA的溶液应在2h内进行RT-PCR扩增，否则应在一70℃的条件下保存。
4.2.4.10RNA提取可选用等效的商品化试剂盒或等效的提取方法。4.2.5RT-PCR
4.2.5.1反转录合成cDNA
反应体系：AMVRT5×缓冲液4μL、dNTPs(2.5mmol/L)2.5μL、RNasin(40U/μL)1μL、AMV反转录酶（5U/μL)1μL、随机引物1μL、模板RNA5μL，加DEPC水至20μL。盖紧管盖，500r/min离心30S。
使用QIAGEN公司的RNA提取试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐QIAGEN的产品，标准的1)
使用者可以使用其他公司的同类产品。3
SN/T3989—2014
反应条件：42℃60min，95℃5min，冰浴5min。4.2.5.2PCR扩增
反应体系：10×缓冲液（含Mg2+）2.5μL、dNTPs（2.5mmol/L）2.5μL、引物F1和R1（20μmol/L）各1μL、TagDNA聚合酶（5U/μL)0.5μL、模板cDNA1μL、加DEPC水至25μL，盖紧管盖，500r/min离心30S。
反应条件：94℃5min，94℃30s、58℃30s、72℃45s、30个循环72℃10min，4℃保温。4.2.5.3琼脂糖凝胶电泳
用TBE电泳缓冲液（见B.1)配制1%的琼脂糖凝胶平板，其中含有1μg/mLEB(见B.2）。将平板放入水平电泳槽，使电泳缓冲液刚好淹没胶面。将6uLPCR产物和2uL上样缓冲液（见B.3）混勾后加人样品孔中进行电泳。在电泳时设立DNA标准分子量Marker作对照。5V/cm电泳约0.5h，当溴酚蓝到达底部时停止。
4.2.5.4测序
使用凝胶成像分析系统观察核酸条带并判断结果，经核酸扩增电泳后如出现一条大小452bp的DNA片段，应对其进行测序，参考序列见C.14.2.6结果判定
经核酸扩增电泳后阳性对照会出现一条452bp的DNA片段而阴性对照和空白对照没有核酸条带。待检样品经核酸扩增电泳后，在相应452bpDNA位置上有条带者并经测序验证者为阳性。无条带或条带的大小不是452bp的为阴性4.3荧光RT-PCR方法
4.3.1设备
高速离心机、微量可调移液器（100μL~1000μL、20μL~200μL、荧光定量PCR扩增仪、台式冷冻
平（感量0.01g）。
2~200.5~10电子天
材料和试剂
引物和探针
上游引物F2：5-TCCTATATCGACGACGAAAGACAA-3”
下游引物R2:5'-ATGACCATGCGCTTGATA-3探针
P1:5-FAM-TTTCCCCGGACTTGAC-TAMRA-3阳性对照：蜜蜂急性麻痹病病毒阳性核酸。4.3.2.2
RNA提取试剂盒。
一步法荧光RT-PCR试剂盒。
其他试剂：DEPC水、无水乙醇。4.3.3
样品采集
具体参见4.1.3。
4.3.4RNA提取
具体参见4.2.4。
4.3.5荧光RT-PCR检测
4.3.5.1扩增试剂配制
SN/T3989—2014
采用一步法荧光RT-PCR扩增可选用等效的商品化试剂盒，下面以TIANGEN2\公司的一步法荧光RT-PCR扩增试剂盒（QuantonestepqRT-PCRkit）进行扩增。在一个20omLPCR管中加人2XQuantOneStepProbeqRT-PCRMastermix12.5μL、HotmasterTagpolymerase(2.5U/mL)1μL、QuantRTase0.7μL、引物F2和R2终浓度0.25μmol/L、探针P1终浓度0.20μmol/L，补充DEPC水至25μL。盖紧管盖，500r/min离心30s。4.3.5.2荧光RT-PCR检测
离心后的PCR管放人荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。循环条件设置：a）
第一阶段，反转录50℃
/30min;
第二阶段，预变性92℃73min；
第三阶段，92℃/10s，45℃/30s.55min,5
第四阶段，92℃/10s，55℃/309.68℃/30s收集荧光。
结果判定
结果分析条件设定
循环：
个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时直接读取检测结果。阅值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。
质控标准
4.3.6.2.1
4.3.6.2.2
阴性对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应
结果描述及判定
4.3.6.3.1
4.3.6.3.2
4.3.6.3.3
，并出现典型的扩增曲线。否则，此次实验视为无效。28.0
阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无蜜蜂急性用麻痹病病毒。
阳性：Ct值≤30.0，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在蜜蜂急性麻痹病病毒。有效原则：Ct>30.0的样本建议重做。重做结果
t值者为阴性，否则为阳性。必要时，可对扩增片段进行，测序结果与附录B.2参考序列同源性较高为阳性。5综合判定
经过现场检疫及透射电子显微镜观察，疑似蜜蜂急性麻痹病的样品须经RT-PCR方法或荧光RTPCR方法确认阳性后，方可判为蜜蜂急性麻痹病阳性。蜜蜂急性麻痹病参见附录D。
2）使用TIANGEN公司的一步法荧光RT-PCR试剂盒进行描述只是为了叙述方便，并不代表推荐TIANGEN的产品，标准的使用者可以使用其他公司的同类产品。5
SN/T3989—2014
附录A
（资料性附录）
蜜蜂急性麻痹病病毒粒子和蜜蜂慢性麻痹病病毒粒子透射电镜照片注：引自ColinHawthornDenholmB.Sc.1999图A.1
蜜蜂急性麻痹病病毒粒子透射电镜照片（80KV，30万倍）注：引自AuroreChevin.2012。
蜜蜂慢性麻痹病病毒粒子透射电镜照片（80KV，30万倍）图A.2
TBE电泳缓冲液（5倍浓缩液）
加水至
1000mL
5mol/L的盐酸调pH到8.0。
EB（核酸染色剂）
附录B
（规范性附录）
试剂配制
用水配制成10mg/mL的浓缩液，使用时每100mL电泳液或琼脂中加5μL。B.3
上样缓冲液
每100mL溶液中含：溴酚蓝0.25g，蔗糖40g。SN/T3989—2014
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