SN/T 4009—2014 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法 Detection of Anaplasma phagocytophilum by PCR in ticks at frontier ports 2014-11-19发布 2015-05-01实施 国家质量监督检验检疫总局 发布 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位包括中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、内蒙古出入境检验检疫局、四川出入境检验检疫局。 本标准主要起草人包括高玉峰、赵亮、邓华、陈肖潇、程晓兰、姜陆、宋锋林等。 1 范围 本标准规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象、检测方法及结果判断。 本标准适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期版本适用；凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有修改单）适用。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1293 国境口岸蜱类监测规程 SN/T 1432 出入境列车医学媒介生物监测规程 SN/T 1553 出入境航空器医学媒介生物监测规程 SN/T 1560 出入境船舶医学媒介生物监测规程 SN/T 1596 出入境车辆医学媒介生物监测规程 WS 233 微生物和生物医学实验室生物安全通用准则 3 术语和定义 3.1 蜱（tick） 蜱属蜱螨亚纲寄螨目（Parasitiformes）、蜱总科（Ixodidea）。成虫背面具有壳质化盾板的为硬蜱（Ixodidae），无盾板的为软蜱（Argasidae）。 3.2 嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum） 嗜吞噬细胞无形体为专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，属立克次体目无形体科，主要通过硬蜱叮咬传播，可引起人粒细胞无形体病。 4 检测对象 本标准检测对象包括： （1）出入境交通工具、集装箱、货物、行李等场所采集的游离蜱或宿主体表寄生蜱； （2）口岸地区采集的游离蜱或宿主体表寄生蜱。 5 生物安全要求 检测工作个人防护参照GB 19489执行。 实验室应符合GB 19489及WS 233对生物安全二级（BSL-2）实验室要求。 使用过的实验用品应按照GB 19489进行无害化处理。 6 器材与试剂 6.1 器材 高速冷冻离心机、高压蒸汽灭菌锅、PCR仪、生物安全柜、电泳仪、凝胶成像系统、匀浆器等。 6.2 试剂 外引物OUT-1、OUT-2，内引物IN-1、IN-2；10×PCR Buffer（含Mg2+）；dNTPs；DNA Polymerase；琼脂糖；染色剂GelRed；ddH2O；基因组DNA提取试剂盒等。 7 蜱类的采集及保存运输 7.1 采集 蜱类采集参照SN/T 1293、SN/T 1432、SN/T 1553、SN/T 1560、SN/T 1596执行。 7.2 分装 采集的蜱类应按类别分装入冻存管、离心管或塑料平皿等容器，并标注编号、种类、采集时间、采集地点、采集人及宿主等信息。 7.3 保存运输 样品应采用冷冻、冷藏或常温方式运输至实验室进行鉴定及检测。 8 样品的检测 8.1 基因组DNA提取 使用TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit提取基因组DNA，也可使用同等效能试剂盒，按说明书或附录A操作。 8.2 核酸检测（PCR法） 8.2.1 引物设计 根据嗜吞噬细胞无形体16S rRNA序列设计套式PCR引物。外引物扩增片段长度为653 bp，内引物扩增片段长度为389 bp。外引物序列为OUT-1和OUT-2，内引物序列为IN-1和IN-2。