SN/T 4009-2014
基本信息
标准号： SN/T 4009-2014
中文名称：国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：5709433
相关标签： 国境 口岸 携带 吞噬细胞 形体 PCR 检测 方法
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4009-2014.Detection of Ana plasma phagocytophilum by PCR in ticks at frontier ports.
1范围
SN/T 4009规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象，生物安全要求、样品采集及保存运输、检测方法和结果判断。
SN/T 4009适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室 生物安 全通用要求
SN/T 1293国境口岸 蜱类监测规程
SN/T1432人出境列车医学媒介生物监测规程
SN/T1553人出境航空器医学媒介生物监测规程
SN/T1560人出境船舶医学媒介生物监测规程
SN/T1596人出境车辆医学媒介生物监测规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义，
下列术语和定义适用于本文件。
3.1蜱tick
属蜱螨亚纲的寄螨目(Parasitiformes)、蜱总科(Ixodidea)。成虫在躯体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱(hardtick),属硬蜱科(Ixodidae);背面无盾板者,统称为软蜱(softtick),属软蜱科(Argasi-dae)。
3.2嗜吞噬细胞无形体Ana plasma phagocytophilum
嗜吞噬细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌,属立克次体目、无形体科,主要通过硬蜱叮咬传播,可引起人粒细胞无形体病。
1范围
SN/T 4009规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象，生物安全要求、样品采集及保存运输、检测方法和结果判断。
SN/T 4009适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室 生物安 全通用要求
SN/T 1293国境口岸 蜱类监测规程
SN/T1432人出境列车医学媒介生物监测规程
SN/T1553人出境航空器医学媒介生物监测规程
SN/T1560人出境船舶医学媒介生物监测规程
SN/T1596人出境车辆医学媒介生物监测规程
WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义，
下列术语和定义适用于本文件。
3.1蜱tick
属蜱螨亚纲的寄螨目(Parasitiformes)、蜱总科(Ixodidea)。成虫在躯体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱(hardtick),属硬蜱科(Ixodidae);背面无盾板者,统称为软蜱(softtick),属软蜱科(Argasi-dae)。
3.2嗜吞噬细胞无形体Ana plasma phagocytophilum
嗜吞噬细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌,属立克次体目、无形体科,主要通过硬蜱叮咬传播,可引起人粒细胞无形体病。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4009—2014
国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法
Detection of Anaplasma phagocytophilum by PCR in ticksatfrontierports
2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4009—2014
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局。本标准主要起草人：高玉峰、赵亮、邓华、陈肖潇、程晓兰、姜陆、宋锋林I
1范围
国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法
本标准规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象输、检测方法和结果判断。
本标准适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。2规范性引用文件
SN/T4009—2014
生物安全要求、样品采集及保存运下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求国境口岸蜱类监测规程
SN/T1293
SN/T1432
SN/T1553
SN/T1560
人出境列车医学媒介
个生物监测规程
人出境航空器医学媒介生物监测规程人出境船舶医学媒介生物监测规程人出境车辆医学媒介生物监测规程SN/T1596免费标准bzxz.net
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则WS233
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
蜱tick
属蜱螨亚纲的寄螨目（Parasitiformes）、蜱总科（Ixodidea）。成虫在驱体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱（hardtick），属硬蜱科（Ixodidae）；背面无盾板者，统称为软蜱（softtick），属软蜱科（Argasi-dae)。
嗜吞噬细胞无形体Anaplasmaphagocytophilum嗜吞噬细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，属立克次体目、无形体科，主要通过硬蜱叮咬传播，可引起人粒细胞无形体病。4检测对象
本标准检测对象包括：
出人境交通工具、集装箱、货物、行季等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱；
口岸地区采集的游离蜱或从口岸地区宿主体表采集的寄生蜱。1
SN/T4009—2014
生物安全要求
实验过程中生物安全要求如下：检测工作中的个人防护参照GB19489；实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求；使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6器材与试剂
6.1器材
本标准使用的主要仪器设备如下：高速冷冻离心机；
高压蒸汽灭菌锅；
-PCR仪；
-生物安全柜；
电泳仪；
凝胶成像系统；
匀浆器等。
本标准使用的主要试剂如下：
引物：外引物OUT-1及OUT-2、内引物IN-1及IN-2；10XPCRBuffer(含Mg2+）；
-dNTPs；
-DNAPolymerase;
琼脂糖；
染色剂GelRed；
基因组DNA提取试剂盒等。
蜱类的采集及保存运输
7.1采集
蜱类采集参照下列标准执行：SN/T1293、SN/T1432、SN/T1553、SN/T1560、SN/T1596。7.2分装
将采集的蜱类现场分栋，按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平血等），加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点（生境）、采集人、宿主等。保存运输
分装完毕的蜱类样品，装入适当的冷冻、冷藏或常温装置，送实验室进行分类鉴定和嗜吞噬细胞无形体检测。
8样品的检测
基因组DNA提取
SN/T4009—2014
使用试剂盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit进行基因组DNA提取，也可使用达同等效果的基因组DNA提取试剂盒，提取方法按照附录A或按相应试剂盒说明书进行。8.2核酸检测（PCR法）
8.2.1引物设计
根据嗜吞噬细胞无形体16SrRNA序列，设计并合成套式PCR的内、外引物。外引物OUT-1和OUT-2扩增的核酸片段长度为653bp；内引物IN-1和IN-2扩增的核酸片段长度为389bp。引物序列如下：
OUT-1:5-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3OUT-2：5'-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3IN-1:5'-GTCGAACGGATTATTCTTTATAGCTTG-3IN-2:5'-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAC-3引物合成后用ddH,O溶解并分装冻存于一20℃冰箱内。4条引物溶解后浓度均为20μmol/L，8.2.2PCR
8.2.2.1对照的设立
在核酸扩增实验中同时按下列所述设阳性对照、阴性对照和空白对照：阳性对照：以构建的嗜吞噬细胞无形体质粒DNA（pMD20-T-OUT)作为阳性对照扩增模板；阴性对照：以实验室养殖、未感染病原体的蜱类基因组DNA作为阴性对照扩增模板空白对照：以ddH2O作为空白对照扩增模板。8.2.2.2PCR第一轮反应
PCR反应总体积25μL。包括DNAPolymerase(1U/μL)0.6μL、10XPCRBuffer2.5μL、dNTPs2.0μL、模板DNA3.0μL、外引物OUT-1（20μmol/L）及OUT-2（20μmol/L）各1.0μL，补充ddHzO使总体积达到25μL。
反应条件为：94℃，5min；94℃，20s，56℃，30s，72℃40s，40循环；72℃，5min。8.2.2.3PCR第二轮反应
PCR反应总体积25μL。包括DNAPolymerase(1U/μL)0.6μL、10×PCRBuffer2.5μL、dNTPs2.0μL、模板1.0μL（第一轮PCR产物）、内引物IN-1（20μmol/L）及IN-2（20μmol/L)1.0μL，补充ddHz0使总体积达到25μL。
反应条件为94℃，5min；94℃，20s，56℃，30s，72℃，40s，40循环；72℃，5min。8.3琼脂糖凝胶电泳检测
扩增结束后，在扩增产物中加人6×DNA上样缓冲液，用含1×GelRed2的1.5%琼脂糖凝胶电泳1）DNA提取试剂盒是由TaKaRa公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。染色剂GelRed是由美国Biotium公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用2）
者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T4009—2014
检测扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录结果。9
结果判断
质量控制
有效实验应同时满足如下条件：阳性对照在预期位置（653bp，389bp）出现特异性扩增条带：阴性对照和空白对照未出现特异性扩增条带。9.2
结果分析
阳性结果
在实验结果有效的情况下，待检样品套式PCR第二轮反应产物在预期位置（389bp）出现特异性扩增条带，可初步判断待检样品嗜吞噬细胞无形体PCR检测结果阳性。初步判断为阳性结果的样品可通过核酸序列测定、序列比对进一步确认。9.2.2
阴性结果
在实验结果有效的情况下，待检样品套式PCR第一轮和第二轮反应产物均未出现特异性扩增条带，可判断为待检样品嗜吞噬细胞无形体PCR检测结果阴性。S
附录A
（规范性附录）
基因组DNA提取方法
A.1取蜱类个体放人离心管内，充分研磨。SN/T4009—2014
A.2加人180μL的缓冲液GL、20μLProteinaseK和10μLRNaseA（10mg/mL），于56℃水浴至组织完全裂解。
A.3向裂解液中加人200μL的缓冲液GB和200μL的100%乙醇，充分吸打混匀。A.4将SpinColumn安置于CollectionTube上，将A.3中溶液转移至SpinColumn中，12o00r/min离心2min，弃滤液。
A.5将500μL缓冲液WA加人至SpinColumn中，12000r/min离心1min，弃滤液。A.6将700μL缓冲液WB加人至SpinColumn中，12000r/min离心1min，弃滤液。重复操作此步骤。
A.7将SpinColumn安置于CollectionTube上，12000r/min离心2min。A.8将SpinColumn置于新的1.5mL离心管上，加人50μL~100μL的ddHO或ElutionBuffer，室温静置5min。
A.912000r/min离心2min，洗脱DNA，置于冰上待用或一20℃冰箱保存。S
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。
国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法
Detection of Anaplasma phagocytophilum by PCR in ticksatfrontierports
2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4009—2014
本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检疫局、中华人民共和国四川出人境检验检疫局。本标准主要起草人：高玉峰、赵亮、邓华、陈肖潇、程晓兰、姜陆、宋锋林I
1范围
国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的PCR检测方法
本标准规定了国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测对象输、检测方法和结果判断。
本标准适用于国境口岸蜱类携带嗜吞噬细胞无形体的检测。2规范性引用文件
SN/T4009—2014
生物安全要求、样品采集及保存运下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求国境口岸蜱类监测规程
SN/T1293
SN/T1432
SN/T1553
SN/T1560
人出境列车医学媒介
个生物监测规程
人出境航空器医学媒介生物监测规程人出境船舶医学媒介生物监测规程人出境车辆医学媒介生物监测规程SN/T1596免费标准bzxz.net
微生物和生物医学实验室生物安全通用准则WS233
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
蜱tick
属蜱螨亚纲的寄螨目（Parasitiformes）、蜱总科（Ixodidea）。成虫在驱体背面有壳质化较强的盾板，统称为硬蜱（hardtick），属硬蜱科（Ixodidae）；背面无盾板者，统称为软蜱（softtick），属软蜱科（Argasi-dae)。
嗜吞噬细胞无形体Anaplasmaphagocytophilum嗜吞噬细胞无形体是专性细胞内寄生的革兰氏阴性菌，属立克次体目、无形体科，主要通过硬蜱叮咬传播，可引起人粒细胞无形体病。4检测对象
本标准检测对象包括：
出人境交通工具、集装箱、货物、行季等场所采集的游离蜱或从上述场所宿主体表采集的寄生蜱；
口岸地区采集的游离蜱或从口岸地区宿主体表采集的寄生蜱。1
SN/T4009—2014
生物安全要求
实验过程中生物安全要求如下：检测工作中的个人防护参照GB19489；实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全2级（BSL-2)实验室的生物安全要求；使用过的实验用品应遵循GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。6器材与试剂
6.1器材
本标准使用的主要仪器设备如下：高速冷冻离心机；
高压蒸汽灭菌锅；
-PCR仪；
-生物安全柜；
电泳仪；
凝胶成像系统；
匀浆器等。
本标准使用的主要试剂如下：
引物：外引物OUT-1及OUT-2、内引物IN-1及IN-2；10XPCRBuffer(含Mg2+）；
-dNTPs；
-DNAPolymerase;
琼脂糖；
染色剂GelRed；
基因组DNA提取试剂盒等。
蜱类的采集及保存运输
7.1采集
蜱类采集参照下列标准执行：SN/T1293、SN/T1432、SN/T1553、SN/T1560、SN/T1596。7.2分装
将采集的蜱类现场分栋，按类别装入适当的容器（如：冻存管、离心管、塑料平血等），加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点（生境）、采集人、宿主等。保存运输
分装完毕的蜱类样品，装入适当的冷冻、冷藏或常温装置，送实验室进行分类鉴定和嗜吞噬细胞无形体检测。
8样品的检测
基因组DNA提取
SN/T4009—2014
使用试剂盒TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKit进行基因组DNA提取，也可使用达同等效果的基因组DNA提取试剂盒，提取方法按照附录A或按相应试剂盒说明书进行。8.2核酸检测（PCR法）
8.2.1引物设计
根据嗜吞噬细胞无形体16SrRNA序列，设计并合成套式PCR的内、外引物。外引物OUT-1和OUT-2扩增的核酸片段长度为653bp；内引物IN-1和IN-2扩增的核酸片段长度为389bp。引物序列如下：
OUT-1:5-TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG-3OUT-2：5'-CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC-3IN-1:5'-GTCGAACGGATTATTCTTTATAGCTTG-3IN-2:5'-TATAGGTACCGTCATTATCTTCCCTAC-3引物合成后用ddH,O溶解并分装冻存于一20℃冰箱内。4条引物溶解后浓度均为20μmol/L，8.2.2PCR
8.2.2.1对照的设立
在核酸扩增实验中同时按下列所述设阳性对照、阴性对照和空白对照：阳性对照：以构建的嗜吞噬细胞无形体质粒DNA（pMD20-T-OUT)作为阳性对照扩增模板；阴性对照：以实验室养殖、未感染病原体的蜱类基因组DNA作为阴性对照扩增模板空白对照：以ddH2O作为空白对照扩增模板。8.2.2.2PCR第一轮反应
PCR反应总体积25μL。包括DNAPolymerase(1U/μL)0.6μL、10XPCRBuffer2.5μL、dNTPs2.0μL、模板DNA3.0μL、外引物OUT-1（20μmol/L）及OUT-2（20μmol/L）各1.0μL，补充ddHzO使总体积达到25μL。
反应条件为：94℃，5min；94℃，20s，56℃，30s，72℃40s，40循环；72℃，5min。8.2.2.3PCR第二轮反应
PCR反应总体积25μL。包括DNAPolymerase(1U/μL)0.6μL、10×PCRBuffer2.5μL、dNTPs2.0μL、模板1.0μL（第一轮PCR产物）、内引物IN-1（20μmol/L）及IN-2（20μmol/L)1.0μL，补充ddHz0使总体积达到25μL。
反应条件为94℃，5min；94℃，20s，56℃，30s，72℃，40s，40循环；72℃，5min。8.3琼脂糖凝胶电泳检测
扩增结束后，在扩增产物中加人6×DNA上样缓冲液，用含1×GelRed2的1.5%琼脂糖凝胶电泳1）DNA提取试剂盒是由TaKaRa公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。染色剂GelRed是由美国Biotium公司提供，是适合市售产品的实例。给出这一信息是为了方便标准的使用2）
者，并不表示对该产品的认可，如果其他等效产品具有同样的效果，则可使用这些等效产品。3
SN/T4009—2014
检测扩增产物，用凝胶成像系统拍照记录结果。9
结果判断
质量控制
有效实验应同时满足如下条件：阳性对照在预期位置（653bp，389bp）出现特异性扩增条带：阴性对照和空白对照未出现特异性扩增条带。9.2
结果分析
阳性结果
在实验结果有效的情况下，待检样品套式PCR第二轮反应产物在预期位置（389bp）出现特异性扩增条带，可初步判断待检样品嗜吞噬细胞无形体PCR检测结果阳性。初步判断为阳性结果的样品可通过核酸序列测定、序列比对进一步确认。9.2.2
阴性结果
在实验结果有效的情况下，待检样品套式PCR第一轮和第二轮反应产物均未出现特异性扩增条带，可判断为待检样品嗜吞噬细胞无形体PCR检测结果阴性。S
附录A
（规范性附录）
基因组DNA提取方法
A.1取蜱类个体放人离心管内，充分研磨。SN/T4009—2014
A.2加人180μL的缓冲液GL、20μLProteinaseK和10μLRNaseA（10mg/mL），于56℃水浴至组织完全裂解。
A.3向裂解液中加人200μL的缓冲液GB和200μL的100%乙醇，充分吸打混匀。A.4将SpinColumn安置于CollectionTube上，将A.3中溶液转移至SpinColumn中，12o00r/min离心2min，弃滤液。
A.5将500μL缓冲液WA加人至SpinColumn中，12000r/min离心1min，弃滤液。A.6将700μL缓冲液WB加人至SpinColumn中，12000r/min离心1min，弃滤液。重复操作此步骤。
A.7将SpinColumn安置于CollectionTube上，12000r/min离心2min。A.8将SpinColumn置于新的1.5mL离心管上，加人50μL~100μL的ddHO或ElutionBuffer，室温静置5min。
A.912000r/min离心2min，洗脱DNA，置于冰上待用或一20℃冰箱保存。S
小提示：此标准内容仅展示完整标准里的部分截取内容，若需要完整标准请到上方自行免费下载完整标准文档。