SN/T 4050-2014.Quarantine Protocol for infection with abalone herpesvirus.
1范围
SN/T 4050规定了鲍鱼疱疹病毒感染的临床诊断、病理组织学方法和分子生物学方法。
SN/T 4050适用于鲍鱼疱疹病毒感染的诊断和监测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18088出入境动物检疫采样
GB 19489实验室生物安全通用要求
SN/T 1193基因检验实验室技术要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AbHV :鲍鱼疱疹病毒( Abalone herpesvirus)
BCIP :5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐( 5 Bromo-4 Chloro-3-IndolylPhosphate)
Ct值:荧光信号达到设定的阈值所经历的打增循环次数(Cycle threshold value)
EDTA:乙二胺四乙酸( Ethylene Diamine Tetraacetic Acid)
NBT:氯化硝基四氮唑蓝(Nitrotetrazolium Blue chloride)
PCR:聚合酶链式反应( Polymerase chain reacnion)
SDS:十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate)

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4050—2014
鲍鱼疱疹病毒感染检疫技术规范Quarantine Protocol for infection with abalone herpesvirus2014-11-19发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4050—2014
本标准起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局、中华人民共和国烟台出人境检验检疫局、中华人民共和国深圳出人境检验检疫局。本标准主要起草人：赵玉然、尹伟力、蒋玉婷、郑晓聪、孙明君、郑小龙、何俊强、于力、王津津、岳志芹。
1范围
鲍鱼疱疹病毒感染检疫技术规范SN/T4050—2014
本标准规定了鲍鱼疱疹病毒感染的临床诊断、病理组织学方法和分子生物学方法。本标准适用于鲍鱼疱疹病毒感染的诊断和监测2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注目期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18088出人境动物检疫采样
GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1193
3缩略语
基因检验实验室技术要求
下列缩略语适用于本文件
AbHV：鲍鱼疱疹病毒（Aba
aloneherpesvirus)
BCIP:5-漠-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐loro-3-IndolylPhosphate)
-Bromo-4-Ch
经历的扩增循环次数
Ct值：荧光信号达到设定的阅值所级(Cyclethreshold value)）
aceticAcid）
EDTA：乙二胺四乙酸（EthyleneNBT：氯化硝基四氮唑蓝
Diamine Tetraa
(Nitrotetrazolium Blu
chloride
PCR：聚合酶链式反应（Poly
ymerasechainreaction)
SDS：十二烷基硫酸钠
试剂和材料
(Sodium dodecyl sulfate)
4.1水：符合GB/T6682中三级水的规格。4.2苏木精。
4.3伊红。
引物：见表1。
表1引物序列
AbHVORF66F1
AbHVORF66R1
AbHV66Prbl
5'-TCC-CGG-ACA-CCA-GTA-AGA-AC-3\5*-CAA-GGC-TGC-TAT-GCG-TAT-GA-35-6FAM-TGG-CCG-TCG-AGA-TGT-CCA-TG-TAMRA-31
SN/T4050—2014
AbHVORF77F1
AbHVORF77R1
AbHV77Prbl
18SPrb
AbHV-16
AbHV-17
AbHVORF66f1
AbHVORF66r2
EDTA。
蛋白酶K见附录A。
表1（续）
5'-CAA-CCA-CTT-GTT-CGG-GTT-CT-3\5'-CAG-GGT-GAT-TAA-TGC-GGA-GT-3'5'-6FAM-TCC-GTA-CGC-GGG-ATC-TTC-GT-TAMRA-35'-CGG-CTA-CCA-CAT-CCA-AGG-AA-35'-GCT-GGA-ATT-ACC-GCG-GCT-3'5'-6VIC-TGC-TGG-CAC-CAG-ACT-TGC-CCT-C-TAMRA-3\5°-GGC-TCG-TTC-GGT-CGT-AGA-ATG-3\5'-TCA-GCG-TGT-ACA-GAT-CCA-TGT-C-3'5′-TCC-CGG-ACA-CCA-GTA-AGA-AC-3'5'-GCC-GGT-CTT-TGA-AGG-ATC-TA-3*TaqManFastUniversalPCRMasterMix实时PCR反应液预混液（含热启动DNA聚合酶，buff+er，UNG酶）。
Taq聚合酶预混液（含Taq酶，Mg2+，dNTP，缓冲液）。地高辛标记试剂盒。
仪器设备与检测环境要求
切片机。
显微镜。
PCR扩增仪。
水平电泳仪。
实时PCR仪。
检测实验室符合GB19489的要求。样品采集
参照GB/T18088规定进行，样品采集出现疑似临床症状的样品或死的样品。>
检测方法
临床症状观察
患病个体的临床症状主要表现为鲍鱼活力很低，无食欲，怕光，生长速度变慢，粘液增多，足变黑变硬，口部肿胀和突出，踏板肌肉活力下降，足边缘向内卷曲，导致暴露出清洁光亮的壳，死亡的鲍显示肝胰腺和消化道肿大（参考附录B)。2
7.2显微镜观察
7.2.1取样
用灭菌剪刀活体解部取脑和神经节等神经组织。7.2.2固定
SN/T4050—2014
迅速将组织切成厚度不超过3mm的组织块，用Davidson's固定液（见A.1）固定2h以上。根据组织块大小，固定时间可适当调整，或放置过夜，期间按需要更换一次固定液。临床样品也可用10%甲醛固定，长期保存。
7.2.3切片
固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）→85%乙醇（60min）-→95%乙醇（60min）→无水乙醇（2次，30min/次）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1）（30min）→二甲苯浸泡（2次，30min/次）-→二甲苯十石蜡（体积比1：1）（15min）→石蜡（15min）两次一→石蜡包埋一切片（根据组织块大小和种类，各步时间作适当调整）。切片厚度最好不超过6μm。7.2.4染色
二甲苯（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1）（3min）-无水乙醇（3min）→95%乙醇（3min）→85%乙醇（3min）-→70%乙醇（3min）-蒸馅水（5min）-苏木精（60min）-伊红（5min）蒸馏水（5min）-→85%乙醇（5min）→95%乙醇（5min）→无水乙醇浸泡（2次，5min/次）→二甲苯+无水乙醇（体积比1：1）（5min）-→二甲苯浸泡（2次，5min/次）-→中性树脂封片。7.2.5结果判定
器官中结缔组织以及脑神经节和周围神经中的神经组织坏死性病变可初步判定AbHV阳性（参见附录C)。
7.3以聚合酶链式反应为基础的检测方法7.3.1取样
取脑和神经节等神经组织，用95%的乙醇保存。7.3.2提取核酸
将组织匀浆。取25mg～50mg，加人500μL裂解缓冲液（见第A.2章）、蛋白酶K（见第A.3章）至终浓度100μg/mL，上下颠倒混匀，混合液置于55℃水浴，孵育1h～3h：向匀浆液中按1：1比例加入酚/三氯甲烷/异戊醇（25：24：1）混合液，上下颠倒混勾，12000g离心5min；转移上层水相，加人等体积三氯甲烷/异戊醇（24：1）混合液，上下颠倒混匀，12000g离心5min；转移上层水相，加人两倍体积的无水乙醇，一20℃放置至少30min；14000g离心15min，沉淀DNA，倾去上清液；于沉淀中加入75%乙醇溶液500μL，轻轻混勾后14000g离心15min，倾去上清液，室温晾干。用30μL水溶解DNA沉淀，冰上保存备用。若需长期保存应放置在一20℃保存备用。组织DNA提取也可采用等效的商品化DNA提取试剂盒，按照说明书进行操作。3
SN/T4050—2014
3实时PCR检测
7.3.3.1反应体系与反应条件
实时PCR反应体系为TaqManFastUniversalPCRMasterMix12.5μL，上下游引物各1μL（10μmol/L），探针0.5μL（10umol/L），模板2μL，补水至25μL终体积。反应条件为95℃59s后95℃3s，62℃30s反应45个循环。若采用其他实时PCR检测试剂盒，反应体系需参照说明书修改。反应过程中应设立阳性对照、阴性对照。阴、阳性对照由指定单位提供。ORF66引物组和ORF77引物组均可用于AbHV的检测，18S探针和引物是用来检测核酸提取效率和实时PCR过程中有无抑制剂成分。
7.3.3.2结果判定
在18s内参扩增正常的情况下，检测样品的Ct值大于或等于40时，即判定阴性；检测样品的Ct值小于或等于35时，即判定阳性；检测样品的Ct值大于35而小于40时，判为可疑，应重新进行检测，重新检测Ct值大于或等于40时，即判定阴性：Ct值小于40时，即判定阳性。7.3.4PCR检测
7.3.4.1反应体系与反应条件
PCR方法反应体系为上/下游引物AbHV-16/17(10umol/L）各uL，模板2uL，Taq?酶反应预
25L，或参照商业化试剂盒规定适当修改反应体系。反应条件为混液12.5uL，加水补足至总体积95℃15min，而后94℃30s，52℃30s，74℃45s反应40个循环，而后72℃延伸7min。PCR反应条件可根据商业化酶的最适反应条件进行适当调整。反应过程中应设立阳性对照、阴性对照。阴、阳性对照由指定单位提供。
2结果判定
反应结果通过琼脂糖凝胶电泳检测，扩增片段大小根据病毒变异株不同而有所差异，大小为522bp~588bp。
7.4原位杂交法
7.4.1杂交探针的制备
首先用PCR方法扩增AbHVDNA，在25μL反应体系中，加人10×PCRBuffer2.5μL，5U/μL的TaqDNA聚合酶0.25μL，10μmol/L的引物ORF66f1和ORF66r2各1μL，10mmol/L的dNTPs1μL，50ng/μL的AbHVDNA1μL，补充水至25μL。PCR反应程序为：94℃预热5min；之后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。用PCR产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化，再利用地高辛标记试剂盒进行标记，得到地高辛标记的DNA探针。
设立对照
阳性对照：用感染了AbHV的鲍鱼作为阳性对照。7.4.2.1
阴性对照：要设两个阴性对照，原位杂交过程中不加人探针；用非感染的鲍鱼进行原位杂交7.4.3
样品处理
取脑神经组织用Davidson's固定液固定，常规石蜡包埋，切片厚4μm～6μm，粘附于涂有粘SN/T4050—2014
附剂氨基烷基硅烷（aminoalkylsilane)粘附剂的载玻片上，40℃过夜，使切片更紧贴玻片。7.4.3.2组织切片（包括阳性对照和阴性对照）依次通过二甲苯（3次，5min/次）→无水乙醇（2次，1min/次）→95%乙醇（2次，1min/次）→85%乙醇（2次，1min/次）→50%乙醇（约1min）→水冲洗6次（勿让切片干燥）
7.4.3.3组织切片平放在湿盒中，吸500mL蛋白酶K工作液于每张组织切片上，37℃下温浴15min。7.4.3.4把组织切片上的蛋白酶K工作液吸干，然后将其放人0.4%的冷甲醛溶液（见附录A.4)中室温浸洗5min。
7.4.3.5室温下，用2×SSC（见附录A.5）浸洗组织切片5min。7.4.4杂交
7.4.4.1将上述组织切片平放在湿盒中，加入500mL杂交缓冲液（见附录A.6)于每张组织切片上，42℃孵育30min。
7.4.4.2按每张切片需要25ng核酸探针计算，取出总核酸探针需用量，置于一只微量离心管中，100℃煮沸10min，再快速置于冰水中。7.4.4.3取核酸探针与相应量（每张切片需500mL）的杂交缓冲液充分混合，吸500mL溶有核酸探针的杂交缓冲液，滴加于每张组织切片上，然后将组织切片置于85℃切片烘片机上孵育6min～7min，使组织DNA变性。
7.4.4.4将组织切片放在冰上快速冷却5min后，在湿盒内42℃孵育过夜（16h～18h）。7.4.5杂交后漂洗
7.4.5.1吸去组织切片上多余的杂交缓冲液，然后在染色缸中依次用2×SSC(15min，室温）-→>1×SSC（5min，室温）-→0.5×SSC（2次，15min/组织切片。
42℃)-
缓冲液I（见附录A.7）（1次，15min，室温）浸洗A.8）封闭组织，37℃温浴30min。7.4.5.2吸取500mL/片缓冲液Ⅱ见附录7.4.5.3吸去组织切片上的缓冲液Ⅱ，用缓冲液Ⅱ按1：11000(1mL/mL）稀释碱性磷酸酶标记的DIG抗体（anti-DIG-AP），把组织切片平放在湿盒中，每片组织切片上加250mL稀释的Anti-DIG-AP，37℃下孵育30min。
7.4.5.4吸去组织切片上的缓冲液Ⅱ，在染色缸中，依次用1×缓冲液I（2次，10min/次，室温）和缓冲液Ⅲ（见附录A.9)（5min，室温）浸洗组织切片。7.4.6显色
7.4.6.1每片组织切片上加500mL显色液（见附录A.10），室温避光温浴1h～3h。在显色过程中，可短时间取出组织切片在显微镜下观察，当阳性对照明显显色时可终止反应。7.4.6.2吸去组织切片上多余的显色液，室温下把组织切片置于1×缓冲液IV（见附录A.11)中5min，以终止反应。Www.bzxZ.net
7.4.6.3在染色缸中，组织切片依次通过蒸馏水（1min）→0.5%俾斯麦棕-Y（见附录A.12）（2min~～5min）→95%乙醇（3次，1min/次）→无水乙醇（3次，1min/次）→二甲苯（4次，1min/次）。7.4.6.4用中性树胶封片。
7.4.6.5在明视野下，用显微镜观察有无蓝黑色或黑色细胞沉淀物并拍照。7.4.7
结果判定
阳性对照组织切片在显微镜下观察有紫黑色的杂交信号，阴性对照无紫黑色的杂交信号。在7.4.7.1
阳性对照、阴性对照成立的条件下，检测样品通过探针杂交染色后有紫黑色信号的切片被认为阳性5
SN/T4050—2014
结果。
2若阳性对照样品不出现紫黑色沉淀物，或阳性和阴性对照样品均出现显色反应相当的明显非7.4.7.2
特异性反应，判断检测结果无效，应重新取样检测8
综合判定
当存在下列情况之一时可判断为鲍鱼疱疹病毒感染可疑：在养殖温度为18℃左右，鲍鱼出现高死亡率（大于90%）并且出现临床症状：一显微镜观察到鲍鱼脑神经组织病变；实时PCR或者PCR检测结果阳性。2在样品可疑的情况下，若存在下列情形之一可确诊鲍鱼疱疹病毒感染：8.2
PCR检测结果为阳性，并通过PCR产物的测序分析判定为AbHV阳性，参考核酸序列参见附录D；
原位杂交结果为阳性。
Davidson's固定液
95%乙醇
福尔马林
冰乙酸
蒸馏水
裂解缓冲液
附录A
（规范性附录）
试剂配制
SN/T4050—2014
10mmol/LTris-C1（pH8.0），0.1mol/LEDTA（pH8.0），0.5%（质量浓度）SDS，4℃保存。蛋白酶K（ProteinaseK）工作液（100μg/mL）A.3
1XTNEBuffer
10mg/mL蛋白酶K原液
将100mg蛋白酶K加人10mL双蒸水中溶解，并在一20℃保存备用，使用时再配制成100μg/mL的工作液。
A.40.4%甲醛溶液（Formaldehyde）37%甲醛（Formaldehyde）
双蒸水
4℃保存，可重复使用5次，或保存3个月。A.5
20×SSC
氯化钠
柠檬酸三钠2H0
加双蒸水定容至
1000mL
0.45um滤膜过滤除菌后4℃贮存备用，实际使用时再根据需要浓度稀释。杂交缓冲溶液（HybridizationBuffer）（终体积50mL）A.6
20×SSC
100%甲酰胺（Formamide）
2oXDenhardt'ssolution
10mg/mL鲑鱼精DNA溶液
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