SN/T 4087-2014.Quarantine protocol for rabies.
1范围
SN/T 4087规定了狂犬病病毒分离鉴定,血清学检测及核酸检测的技术方法。
SN/T 4087适用于狂犬病的检验检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安全通用要求
3缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CNS:中枢神经系统(Central nervous system)
cDNA:互补DNA(Complementary DNA)
DEPC:焦碳酸二乙酯(Diethyl pyrocarbonate)
DMEM:杜氏改良培养基( Dulbecco's modified Eagle's medium)
DMEM-5:含5%灭活胎牛血清的杜氏改良培养基( Dulbecco's modified Eagle's medium supple-mented with 5% fetal bovine serum)
DMEM-2:含2%灭活胎牛血清的杜氏改良培养基(Dulbecco'smodifiedEagle'smediumsupple-mented with 2% fetal bovine serum)

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4087—2014
狂犬病检疫技术规范
Quarantineprotocolforrabies
2014-11-19发布
新涂层盗真伪
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-05-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4087—2014
本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国兽医药品监察所、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局。本标准主要起草人：高志强、李宁、高峰、张伟、张鹤晓、吴晓薇、刘环、马贵平、朱事康、谷强、蒲静乔彩霞、张利峰、汪琳、凌凤俊、尹羿。I
1范围
狂犬病检疫技术规范
本标准规定了狂犬病病毒分离鉴定，血清学检测及核酸检测的技术方法本标准适用于狂犬病的检验检疫2规范性引用文件
SN/T4087-—2014
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求缩略语
下列缩略语适用于本文件。
CNS：中枢神经系统（Centralnervoussystem）cDNA：互补DNA（ComplementaryDNA)DEPC：焦碳酸二乙酯（Diethylpyrocarbonate）DMEM：杜氏改良培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smedium）DMEM-5：含5%灭活胎牛血清的杜氏改良培养基（Dulbecco'smodifiedEaglesmediumsupplemented with5%fetalbovine serum)DMEM-2：含2%灭活胎牛血清的杜氏改良培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smediumsupplementedwith2%fetalbovineserum)DMEM-10：含10%灭活胎牛血清的杜氏改良培养基（Dulbecco'smodifiedEagle'smediumsupplemented with 10% fetal bovine serum)dNTP：脱氧核苷三磷酸（Deoxyribonucleosidetriphate）FAT：荧光抗体试验（Fluorescentantibodytest）M-MLV：莫洛尼鼠类白血病病毒（Moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸盐缓冲盐水（Phosphatebufferedsaline）RT-PCR：反转录-聚合酶链反应（Reversetranscription-polymerasechainreaction）SPF：无特定病原体（Specificpathogenfree）VN：病毒中和试验（Virusneutralisation）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）4
临床诊断
4.1流行病学
几乎所有的温血动物都对狂犬病病毒易感，但在自然界中，易感动物主要是犬科、猫科及融科动物。野生动物也是狂犬病病毒的自然贮存宿主。其中如狐狸、狼、豹类、熊、臭鼬、鼠、猫、鼬等多以健康带毒，1
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动物感染狂犬病病毒后，均可成为传染源；猪、牛、马等家畜也可感染狂犬病病毒（多无临床症状，但血检呈阳性）。在发达国家，人的狂犬病主要来源于犬狂犬病，有80%～90%的人狂犬病是由疯犬咬伤所引起，而少数病例来自野生动物，野生动物在感染狂犬病病毒后多数动物发病后死亡，部分动物病后恢复转为病毒携带者。中国人兽狂犬病的传染源中，犬占85%～95%，猫占4%左右，狼与其他野生动物和家畜也可造成狂犬病的传播。
狂犬病病毒的传染主要通过破损皮肤和黏膜。在已感染动物的睡液腺中，病毒含量极高，唾液中的病毒通过动物啃咬和甜进人机体，有些情况下，即使未发现的伤口也可成为病毒侵人的途径。人感染狂犬病最常见的方式是通过感染狂犬病的犬、猫、野生动物以及吸血蝠的咬伤、抓、舔甜皮肤或粘膜，从而使狂犬病病毒侵人人体，之后经神经末梢上行进人中枢神经系统。发病时，人首先感到不安，头汗、流涎、多泪、瞳孔放大，吞咽时痛，发热，侵人部位有刺痛感，继而出现神经兴奋性增强，脉速增加，出咽喉肌肉发生李，见水或其他轻微刺激可引起发作。最后转人麻痹、昏迷、呼吸及循环衰竭而死亡，病程大约5d～7d。此外，病毒还可以通过呼吸道传染或通过气溶胶传播4.2临床症状
本病的潜伏期从数天、数月到数年不等。潜伏期的长度与咬伤位置、创伤严重性、病毒毒力以及宿主抵抗力相关，伤口在头部和神经丰富的部位，潜伏期通常较短。一般来说，临床症状可划分为三个阶段：前驱期，兴奋期和麻痹期。然而，这三个阶段有时并不明显。例如，对于某些犬，兴奋期相当明显，但另外一些犬，其兴奋期或许根本不明显。对于犬、猫和其他一些宠物，前驱期的表现通常为行为改变，野生动物也可出现这种表现，放任其自然本性，对人表现出恐惧。其他动物狂犬病临床症状通常较不明显。但一般来说，本病的特征为进行性神经紊乱。然而，本病的临床症状容易与其他一些传染病混淆（如脑脊髓炎或有神经症状的疾病），也可能与一些表现神经症状的中毒反应混淆4.3病理变化
4.3.1眼观病变
狂犬病病毒引起的脑炎可导致广泛的神经病变，但主要局限于神经细胞的病变。肉眼病变表现为一定程度的脑水肿。
组织学病变
无特定的组织学病理改变。有时血管周可出现套管现象或炎性反应，脑组织可出现炎性细胞浸润。有时狂犬病感染组织中可观察到嗜曙红细胞内的胞浆内包涵体，此类包涵体被命名为内基氏体。5实验室诊断
5.1病原鉴定方法
5.1.1总则
狂犬病固定毒的培养操作应在生物安全2级以上实验室条件下进行，涉及狂犬病街毒的分离培养应在具有生物安全3级条件的实验室中进行，实验室条件符合GB19489的规定。5.1.2设备
高速台式冷冻离心机（离心速度12000r/min以上），台式离心机（离心速度3000r/min），漩涡振荡器，冰箱（2℃～8℃和一20℃两种），微量可调移液器（10μL、100μL、1000μL），荧光显微镜。2
5.1.3采样、送检和处理
5.1.3.1试验材料
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5.1.3.1.1
棉拭子、剪刀、镊子、注射器、1.5mL离心管、研钵。采样工具应经121℃，15min高压灭菌并烘干。
5.1.3.1.2pH7.2,0.01mol/LPBS，配制方法见附录A.1。5.1.3.1.3抗生素：青霉素、链霉素。5.1.3.2脑组织、睡液腺以及皮肤等组织样品5.0mLPBS混匀，然后将组织
用无菌的剪刀和镊子剪取待检样品1.0g于研钵中充分研磨，再加悬液转人无菌1.5mL离心管中，编号备用3睡液、脑脊髓液
直接吸取至无菌1.5mL离心管中，编号备用。5.1.3.4存放与运送
采集或处理的样本在2℃～8℃条件下保存应不超过24h；若需长期保存，应放置一70℃冰箱，但应避免反复冻融。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，尽快运送到实验室。5.1.4
荧光抗体试验（FAT)
试验材料
5.1.4.1.1适用标本：脑组织，皮肤组织，角膜，唾液和脑脊液。FITC标记的抗狂犬病病毒单克隆抗体5.1.4.1.2
60000稀释的伊文思蓝（PBS稀释），90%甘油5.1.4.1.3常用稀释液：pH7.2，0.01mol/LPBS.16(PBS稀释）。
操作步骤
5.1.4.2.1
液体标本直接涂片，组织标本可进行涂片，压片或冷冻切片。室温干燥数分钟，冷丙酮固定7min~10 min。
5.1.4.2.2将FITC标记的单克隆抗体稀释至工作浓度，滴加于涂片，压片或冷冻切片之上，37℃湿盒温育30min。
5.1.4.2.3PBS洗涤3次，每次5min。5.1.4.2.4将90%甘油（PBS稀释）滴加于涂片，压片或冷冻切片之上，用盖玻片封片，用荧光显微镜进行观察。
5.1.4.3结果判定
细胞内病毒特异性荧光为黄绿色颗粒，分布在感染细胞的胞浆内。根据阳性细胞在细胞总数的比例，可将阳性结果判定为1～4个“+”。阳性细胞数<25%为“+”，25%～50%为“++”，51%～75%为“+++”，>75%为“十十++”；无特异性荧光者为“”。3
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5.1.5细胞培养分离病毒
试验材料
5.1.5.1.1
适用标本：脑组织，皮肤组织，唾液和脑脊液。细胞系：鼠神经瘤细胞系（如ATCCCCL-131),BHK-21，Vero细胞。5.1.5.1.2
5.1.5.1.3
培养基成分：DMEM，胎牛血清，7.5%碳酸氢钠（质量分数），10000IU/mL青霉素及链霉素溶液。
配制DMEM-5和DMEM-2:100mLDMEM-5中含有90mLDMEM培养液，灭活胎牛血清5.1.5.1.4
5mL，10000IU/mL青霉素及链霉素溶液2mL，用7.5%碳酸氢钠（质量分数）调节pH值至7.2~7.4；100mLDMEM-2中含有93mLDMEM培养液，灭活胎牛血清2mL，10000IU/mL青霉素及链霉素溶液2mL，用7.5%碳酸氢钠（质量分数）调节pH值至7.2～7.4。5.1.5.2操作步骤
5.1.5.2.1
用DMEM-5培养单层细胞，长满程度约为80%，培养时可加人适当大小的飞片。弃去培养液，加人0.2mL液体样本或组织悬液，36℃吸附1h。5.1.5.2.2
5.1.5.2.3
补加DMEM-2，置于36℃5%CO，培养箱中进行培养。培养至第4天至第5天，取飞片或刮取细胞涂于载玻片上，用冷丙酮固定后，按免疫荧光法5.1.5.2.4
进行鉴定。
5.1.5.2.5鉴定为阴性者，需要将培养物冻融3次，4℃12000r/min离心10min后取上清液继续按照上述连续传代3次。
5.1.5.3结果判定
细胞传代出现病变，而且荧光抗体法检测病毒抗原为阳性者判定为细胞分离阳性，否则为阴性。5.1.6小鼠接种分离病毒
5.1.6.1试验材料
5.1.6.1.1适用标本：脑组织。
5.1.6.1.2小鼠：5~10只3~4周龄SPF小鼠（12g~14g）或5~10只2日龄SPF小鼠。5.1.6.1.3麻醉剂：1%戊巴比妥溶液。5.1.6.2操作步骤
5.1.6.2.1在无菌条件下制成20%悬液（质量浓度），将小鼠麻醉后，取50μL悬液或液体样本进行脑内接种。
5.1.6.2.2
连续观察28d，4d内死亡的小鼠弃去。对于2日龄小鼠，可于接种后第5天，第7天，第9天和第11天取脑组织进行荧光抗体检测。5.1.6.3结果判定
小鼠脑组织经荧光法检测病毒抗原为阳性者判定为小鼠分离阳性，否则为阴性。5.2血清学检测方法
5.2.1荧光抗体中和试验
5.2.1.1设备
35℃～37℃的5%CO2可加湿培养箱，37℃烘箱，生物安全柜，荧光显微镜。4
5.2.1.2试剂
5.2.1.2.1pH7.2,PBS，配方见A.1，4℃储存备用。5.2.1.2.2
胰酶-EDTA溶液，配方见A.2。
丙酮（生化级）80%（用去离子水稀释），4℃储存备用。5.2.1.2.3
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DMEM-10，100mLDMEM-10中含有90mLDMEM培养液，灭活胎牛血清10mL，5.2.1.2.4
10000IU/mL青霉素及链霉素溶液2mL，用7.5%碳酸氢钠（质量分数）调节pH值至7.2~7.4。FITC标记的抗狂犬病病毒荧光抗体。5.2.1.2.5
5.2.1.2.6
细胞株BHK-21C13（ATCCCCL-10），培养于含10%胎牛血清、青霉素及链霉素的DMEM培养液。
病毒株CVS-11。
5.2.1.2.7
5.2.1.2.8
标准阳性血清，一般为6.7IU/mL，OIE提供。5.2.1.2.9
阴性血清：阴性犬血清于一20℃储存备用。5.2.1.3狂犬病病毒CVS株增殖
5.2.1.3.1细胞培养：BHK-21C13细胞用于增殖CVS病毒，细胞长成单层后应进行传代，勿使悬浮的细胞聚集，75cm细胞培养瓶细胞数约为2×10°，将细胞悬浮于20mL～30mLDMEM-10中5.2.1.3.2细胞接种：将感染指数（每个细胞内的感染病毒粒子数量）调整到0.1到0.5之间，将细胞及病毒悬液在35.5℃~37℃温育1h，期间每隔10min~15min摇匀一次。5.2.1.3.3病毒生长增殖：将病毒及细胞悬液800r/min~1000r/min离心15min，将沉淀重悬于DMEM-10中，2d后收获病毒培养物，5.2.1.3.4收获和储存：将培养物上清4℃条件下800g~1000g离心15min。取上清混匀后进行分装，保存于一80℃。冻存至少3d以后再进行感染滴度测定。5.2.1.4病毒TCID5o测定
5.2.1.4.1在96孔细胞培养板上使用24h内长成的BHK-21C13细胞单层进行测定。将0.1mL病毒液加人0.9mL培养液作10倍连续倍比稀释。每个稀释度接种6孔，每孔接种50μL。培养72h后进行阴阳性判读。根据Spearman-Karber法计算结果5.2.1.4.2细胞悬浮，测定前1d，将细胞分散后用DMEM-10制成105细胞/mL悬液，加人96孔培养板，200μL/孔。将培养板在35.5℃～37℃以及含5%CO2的培养箱中培养24h。5.2.1.4.3病毒液稀释，用不含胎牛血清的DMEM培养液对病毒从10-1到10-12作10倍系列稀释。5.2.1.4.4感染细胞，吸弃96孔培养板中的培养液，将各个稀释度的病毒液50μL加入各个培养孔，每个稀释度接种6孔。将培养板在35.5℃37℃以及含5%CO2的培养箱中温育1h，然后加入200μLDMEM-5。
5.2.1.4.5培养，将培养板在35.5℃～37℃以及含5%CO，的培养箱中温育3d。5.2.1.4.6染色和滴度计算，将细胞进行FAT染色，进行阴阳性判读，有特异性荧光的孔判为阳性，否则为阴性，根据Spearman-Karber法计算结果，见式（1)。logio(Dso)=-(z。-号+d）
式中：
log1o（Dso）——
病毒TCIDso的log10对数；
所有孔均为阳性的最大病毒稀释度的log10对数；倍比稀释倍数的1log10对数（本试验为1)；——阳性孔数：
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重复孔数（本试验为6)；
所有孔均为阳性的最大稀释度开始，阳性孔数与重复孔数的比值之和。计算举例参见附录B。
正式试验操作步骤
5.2.1.5.1
培养板布局
按照图1所示板式布局进行试验，1号板为对照板，用于CVS病毒TCIDs回归测定（1列～4列），以及设立标准阴、阳性血清，空白对照。其余板子用于测定被检血清。log
稀释度
血清1
血清2
1431.912.39
注：图中标明50μL的孔应加入50μL未稀释血清。以log10进行表示。
血清3
血清4
阴影孔需加人100TCIDse/50μL病毒液50μL。血清稀释度图1被检血清板布局（见5.2.1.5.35.2.1.5.2加培养液
1号板，1到4列以及A9到A12的细胞对照孔，150u孔，其余孔，100μL/孔；被检血清板，第6和第12列，200μL/孔。其余所有孔，100μL/孔。5.2.1.5.3加被检血清
被检血清应56℃灭活30min。如图2所示，每份被检血清（不作稀释)加人相应的4个孔内，50μL/孔。5.2.1.5.4按以下方式在96孔培养板上稀释血清标准阴、阳性血清：用50uL200μL多通道加样器在首列稀释孔连续吹吸至少8次，吸取50μL到下一排，连续操作直至最后一排，弃去50μL。被检血清（所有板）：如上所述，从第一列开始，连续吸取50μL进行系列稀释直至第5和11列（稀释度10-2.39）。使用5μL50μL多通道加样器，从第5列和第11列分别移取10μL到第6列和第12列，（稀释度从10-2.39到10-4.23）。将多通道加样器调整至90μL，将第6列和第12列液体混匀，然后弃去180μL，然后加人70μL培养液到这2列孔中。5.2.1.5.5加病毒液
CVS毒株储存于一80℃，1.0μL/管。取出1管，用流动的冷水迅速溶解后置于冰水浴中。稀释病6
SN/T4087—2014
毒至100TCIDso/50μL。将此稀释度的病毒液50μL加入各个已加血清的孔中。1号对照板H1到H4各加人50μL病毒液，然后依次移取50μL进行系列稀释，最后第1列弃去50μL（1号板，A1到A4孔）。1号板A9到A12孔不加病毒（细胞对照）。加人的病毒量允许范围为30TCID5o/50μL～300TCIDso/50μL。将微量培养板置于含5%CO的35℃37℃加湿培养箱温育1h。log
稀释度
血清1
血清2
血清3
血清4
未稀释血清。阴影孔需加人100TCIDso/50μL病毒液50μL。血清稀释度注：图中标明50μL的孔应加人50叫以log10进行表示。
图2被检血清板布局
5.2.1.5.6加细胞悬液
用胰酶消化长满单层的BHK-21
细胞，
用适当体积的DMEM-10重悬细胞，使得细胞数为4×105/mL。每孔加人50μL细胞悬液。将细胞培养板置于含5%CO的355.2.1.5.7
固定和染色
C～37℃加湿培养箱进行培养。
培养48h后，弃去培养液，然后分别用pH7.2PBS
和80%丙酮各漂洗1次，然后用80%丙酮室温固定30min，在室温干燥至少30min。每孔加人50ul工作浓度的FITC标记的狂犬病荧光抗体，轻轻30min。弃去孔中的荧光抗体然后用PBS洗涤2次，然后在吸水纸摇晃培养板后在35℃～37℃温育上拍干板子。
5.2.1.5.8结果判定
在荧光显微镜下逐孔进行观察，对结果进行定性判定（阴性或阳性），观察到特异性荧光的孔判为阳性，否则为阴性。首先对细胞对照孔和病毒对照孔进行观察判定。CVS滴度，阴性血清和标准阳性血清中和效价根据Spearman-Karber方法进行计算将每次试验测得的CVS病毒滴度（TCIDso），阴性血清中和效价（Dso）标准阳性血清中和效价（Dso）记录于质控单。对于同一批次的质控对照品，每次测得的效价要与以往试验测得的效价进行对比，如果在统计学上与以往测定结果的平均值差异不显著（土2SD)，表明测定结果有效，反之无效。将病毒对照结果，血清对照结果以及被检血清结果进行比对，根据Spearman-Karber公式计算出被检血清效价。将测得的被检血清中和效价与已知中和抗体滴度的标准阳性血清中和效价进行比较，可以计算出被检血清的中和抗体滴度（IU/mL）。可应用当天的logDso值或标准阳性血清的平均值将被检血清中和抗体滴度换算为IU/mL。将logDs值换算为IU/mL，见式（2）和式（3）：7
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