SN/T 4143—2015 出口动物及其制品中玉米赤霉醇残留量检测方法 酶联免疫法 Determination of zeranol residues in animal-derived products for export - Enzyme-linked immunosorbent assay 2015-09-02 发布 2016-04-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：顾鸣、韩伟、王赢、朱坚。 1 范围 本标准规定了动物及其制品中玉米赤霉醇残留量的抽样、制样和酶联免疫测定方法。本标准适用于动物及其制品（牛、猪、免等内脏组织与肌肉组织）、乳粉和动物尿液中玉米赤霉醇残留量的筛选检验，阳性结果须用其他方法进行确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 试样的缩分和保存 3.1 试样制备 3.1.1 对组织样品：从全部样品中取有代表性样品，去除脂肪、充分绞碎、混匀，用四分法缩分出不小于1000g试样，密封并加以标识。 3.1.2 对动物尿样：从饲养现场收集动物尿液，充分混匀、澄清后，装入清洁密闭容器，试样不小于50mL，加封后标明标识。 3.2 样品容器 样品应装于合适的清洁干燥容器中，以保持样品的完整性和可追溯性。可采用聚乙烯塑料容器、玻璃容器等惰性材料容器（不允许使用橡胶容器）盛装样品，然后再放入较大的干净容器中密封装运。 3.3 样品封识 应在每个样品容器的外表贴上标签，标签上注明样品名、样品编号、生产批号、抽样日期、抽样地点、堆位、抽样人员，并由抽样人员或官方人员加封。 3.4 样品保存 3.4.1 抽样后样品应立即在-18℃以下冷冻保存，0℃～5℃条件下48h内送达实验室。 3.4.2 在抽样和制样过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 4 测定方法 4.1 原理 本方法的测定基础是竞争性酶联免疫反应。微孔板上包被有固相化的抗玉米赤霉醇抗体的二抗。当加入玉米赤霉醇酶标记物、游离玉米赤霉醇（玉米赤霉醇标准或样液）和玉米赤霉醇特异性抗体后，特异性抗体与二抗相结合，游离玉米赤霉醇与玉米赤霉醇酶标记物竞争数量有限的抗体结合位点，通过洗涤除去未结合的玉米赤霉醇酶标记物，然后加入底物和发色剂孵育显色，用酶标仪测定吸光度，根据吸光度值得出试样中玉米赤霉醇的含量。 4.2 试剂和材料 除去另外说明外，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。 4.2.1 β-葡萄糖醛酶 4.2.2 乙醚 4.2.3 甲醇 4.2.4 90%乙酸溶液 4.2.5 0.1mol/L乙酸钠缓冲液（pH 4.8） 4.2.6 1mol/L氢氧化钠溶液 4.2.7 玉米赤霉醇酶联免疫定量测定试剂盒：应能满足本方法测定低限要求，参见附录A和附录B。 4.2.8 玉米赤霉醇标准品 4.3 仪器和设备 4.3.1 酶标仪 4.3.2 均质器 4.3.3 离心机 4.3.4 氮气挥发器 4.3.5 振荡器 4.3.6 微量加样器：10μL~100μL，20μL~200μL 4.3.7 微量多通道加样器：10μL~100μL 4.3.8 自动洗板机 4.4 分析步骤 4.4.1 提取 组织样品（肌肉，肝脏，肾等）： 4.4.1.1 称取1g去除脂肪的已粉碎样品，加2mL蒸馏水，均质（对肝、肾组织需添加8μL β-葡萄糖醛酶，置37℃孵育2h）；加10mL乙醚，用振荡器振荡30s，再上下振荡10min，然后在-15℃ 3000g离心10min。在-25℃放置60min或-60℃放置30min，冻结水相，收集乙醚层。在剩余水相中加5mL乙醚，重复提取步骤；合并二次乙醚提取物，置60℃氮气流中吹蒸干；加1mL三氯甲烷溶解固体残渣。加3mL 1mol/L NaOH，用力振荡30s，在15℃ 2000g离心10min；吸取上层NaOH溶液相，置于含有250μL 90%乙酸溶液的玻璃瓶中；加5mL乙醚，用振荡器振荡30s，在15℃ 2000g离心10min；在-25℃放置60min或-60℃放置30min，收集乙醚层。置60℃氮气流中吹蒸干。