SN/T 4161-2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR方法 Detection method for Vibrio parahaemolyticus by real-time fluorescence PCR at frontier ports 2015-02-09发布 2015-09-01实施 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国江西出入境检验检疫局。本标准主要起草人：胡婷、杨春华、刘岚、孙思扬、谢玉萍、徐菱菱、周延。 1 范围 本标准规定了国境口岸副溶血性弧菌实时荧光PCR检验的对象、标本的采集、运输和保存，操作方法及结果报告。本标准适用于国境口岸副溶血性弧菌感染的筛选检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 4789.17—2003 食品卫生微生物学检验 肉与肉制品检验 GB/T 4789.20—2003 食品卫生微生物学检验 水产食品检验 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 副溶血性弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 副溶血性弧菌，属弧菌科弧菌属，革兰染色阴性，兼性厌氧菌，为多形态杆菌或稍弯曲弧菌。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、发烧、腹泻及水样便（重症者为黏液便或黏血便）为主要症状。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid） PCR：聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction） Taq DNA polymerase：Taq DNA 聚合酶 5 检测对象 5.1 疑似副溶血弧菌感染者的临床标本，如粪便；疑似副溶血弧菌污染环境标本，如水样，以及食品。 6 实验室生物安全和PCR防污染要求 实验室生物安全应符合GB 19489的规定。PCR防污染措施按WS/T 230和SN/T 1193的规定执行。 7 仪器与器材 7.1 实时荧光定量PCR仪及配套PCR反应管。 7.2 生物安全柜。 7.3 高速冷冻离心机：最大转速1...（注：原文缺失具体转速值） 7.4 台式离心机（离心速度900g）。 7.5 涡旋振荡器。 7.6 恒温水浴锅。 7.7 高压灭菌锅。 7.8 低温冰箱、冷藏、冷冻冰箱。 7.9 可调式微量加样器。 8 试剂 8.1 生理盐水：由蒸馏水和NaCl配制，浓度为0.85%。 8.2 阳性对照品：人工制备含副溶血弧菌检测序列的质控品。 8.3 阴性对照品：灭菌双蒸水（ddH2O）。 8.4 DNA提取液：含0.9% NaCl和0.1% EDTA-Na2的混合液。 9 检测程序 9.1 样品的采集 9.1.1 粪便样本 采集病人发病早期新鲜粪便5g~8g，水样便采集1mL~3mL。使用一次性无菌采便管，成形便采集；经旋转，有可见粪便的棉拭放人采便管内。亦可用湿润的直肠棉拭插入直肠内3cm~5cm处并轻轻旋转，采集后放入采便管，管外表贴上带有唯一标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。 9.1.2 水样标本 水样用无菌容器采集3mL~5mL，密闭后外表贴上带有唯一识别标识号码的标签，直接用于检测，或保存，或送检。 9.1.3 食品标本 9.1.3.1 肉与肉制品的取样方法按GB/T 4789.17—2003中的规定。 9.1.3.2 各种水产食品及其制品的取样方法按GB/T 4789.20—2003中5.1的规定。 9.2 样本的运转与保存 样本运输采用冰壶加冰密封运输。对于不立即检测的样本，应保存于—20℃待检。 9.3 样本的前处理 9.3.1 粪便样本 挑取米粒大小粪便，放置于有0.5mL生理盐水的离心管中，振荡混匀，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。 9.3.2 水样样本 取标本3mL，16200g离心2min。去尽上清，沉淀用于核酸提取。 9.3.3 食品样本 以无菌方法取肉类或水产品组织样品0.1g，用0.2mL无菌生理盐水在离心管中研磨，然后在100℃沸水中加热5min，经8000g离心3min，取上清用于以后的荧光PCR反应。