中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4178—2015 南瓜花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of Squash mosaic virus 发布日期：2015-02-09 实施日期：2015-09-01 国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国湖南出入境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、武汉哇哇噻纳技术开发有限公司。 本标准主要起草人：廖富荣、黄迎波、林石明、梁新苗、吴媛、陈青、邓丛良、赵晓丽、聂棱、陈红运。 1 范围 本标准规定了南瓜花叶病毒检疫鉴定方法。本标准规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法。本标准适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T 1809 进出境植物种子检疫规程 SN/T 2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3 南瓜花叶病毒基本信息 中文名称：南瓜花叶病毒 英文名称：Squash mosaic virus 缩写：SqMV 分类地位：小RNA病毒目（Picornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）、豇豆花叶病毒属（Comovirus）成员 传播方式：种子传播、昆虫介体传播和机械传播 SqMV的其他信息参见附录A。 4 方法原理 南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。 5 仪器设备与试剂 5.1 主要仪器设备与用具 本标准主要涉及到的仪器设备和用具为：植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）。 5.2 主要试剂与配制 血清学试剂及其缓冲液配制见附录B；分子生物学试剂及其缓冲液配制见附录C和附录D。 6 检测与鉴定 6.1 抽样检查 按照 SN/T 2122、SN/T 1809 给出的方法进行抽样、取样。 6.2 隔离种植 对于种子样品，一方面，可用种子直接检测（如取6g的种子，研磨粉碎后检测）；另一方面，可先隔离种植后用苗进行检测。 隔离种植：在温室或植物生长箱等隔离条件下播种，至2片～3片叶后观察。对于疑似病毒症状的植株，用以下方法（如DAS-ELISA、RT-PCR等）进行检测；对于未表现症状的植株，取约10株为一混合样品，用DAS-ELISA方法检测。 6.3 血清学检测 6.3.1 DAS-ELISA检测 按附录B给出的方法，进行DAS-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。 6.3.2 免疫层析检测 按试剂操作说明，进行免疫层析检测。 6.4 分子生物学检测 6.4.1 RT-PCR检测 按附录C给出的方法，进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。 6.4.2 IC-RT-PCR检测 按附录D给出的方法，进行IC-RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。 6.4.3 序列测定与分析 RT-PCR或IC-RT-PCR检测阳性的样品，可进一步进行序列测定分析。把测定的序列与已知序列进行比对，以确定是否为SqMV序列。 注：根据国际病毒分类委员会（ICTV）第九次分类报告中伴生豇豆病毒科（Secoviridae）病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为：CP的氨基酸序列一致性小于75%。 7 结果判定 7.1 当血清学检测（DAS-ELISA或免疫层析）和分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR）结果均为阳性时，则判定为检出SqMV。 7.2 当分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR）结果均为阳性、测定的序列为SqMV序列时，则判定为检出SqMV。 8 结果记录 记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据，分子生物学检测结果保存电泳照片。