SN/T 4178-2015
基本信息
标准号： SN/T 4178-2015
中文名称：南瓜花叶病毒检疫鉴定方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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下载大小：13178400
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4178-2015.Detection and identification of Squash mosaic virus.
1范围
SN/T 4178规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法。
SN/T 4178适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1809进出境植物种子检疫规程
SN/T 2122进出境植物 及植物产品检疫抽样
3南瓜花叶病毒基本信息
中文名称:南瓜花叶病毒
英文名称: Squash mosaic virus
缩写: SqMV
分类地位:小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生虹豆病毒科( Secoviridae).豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)成员。
传播方式:种子传播、昆虫介体传播和机械传播。
4方法原理
南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。
5仪器设备与试剂
5.1 主要仪器设备与用具
本标准主要涉及到的仪器设备和用具为:植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001 g).PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)。
1范围
SN/T 4178规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法。
SN/T 4178适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
SN/T 1809进出境植物种子检疫规程
SN/T 2122进出境植物 及植物产品检疫抽样
3南瓜花叶病毒基本信息
中文名称:南瓜花叶病毒
英文名称: Squash mosaic virus
缩写: SqMV
分类地位:小RNA病毒目(Picornavirales)、伴生虹豆病毒科( Secoviridae).豇豆花叶病毒亚科(Comovirinae)、豇豆花叶病毒属(Comovirus)成员。
传播方式:种子传播、昆虫介体传播和机械传播。
4方法原理
南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。
5仪器设备与试剂
5.1 主要仪器设备与用具
本标准主要涉及到的仪器设备和用具为:植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平(感量:0.001 g).PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器(1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL)。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4178—2015
南瓜花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Squash mosaic virus2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T 4178—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、武汉哇哇噻纳技术开发有限公司。本标准主要起草人：廖富荣、黄迎波、林石明、梁新苗、吴媛、陈青、邓丛良、赵晓丽、聂棱、陈红运I
1范围
南瓜花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法。本标准适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定2规范性引用文件
SN/T4178—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1809进出境植物种子检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3南瓜花叶病毒基本信息
中文名称：南瓜花叶病毒
英文名称：Squashmosaicvirus
缩写：SqMV
分类地位：小RNA病毒目（P）
icornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）、豇豆花叶病毒属（Comouirus）成员传播方式：种子传播、昆虫介体传播和机械传播SqMV的其他信息参见附录
4方法原理
南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。5仪器设备与试剂
5.1主要仪器设备与用具
本标准主要涉及到的仪器设备和用具为：植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）。5.2主要试剂与配制
血清学试剂及其缓冲液配制见附录B,分子生物学试剂及其缓冲液配制见附录C和附录D。1
SN/T4178—2015
检测与鉴定
抽样检查
按照SN/T2122、SN/T1809给出的方法进行抽样、取样。6.2
2隔离种植
对于种子样品，一方面，可用种子直接检测（如取6g的种子，研磨粉碎后检测）；另一方面，可先隔离种植后用苗进行检测
隔离种植：在温室或植物生长箱等隔离条件下播种，至2片～3片叶后观察。对于疑似病毒症状的植株，用以下方法（如DAS-ELISA、RT-PCR等）进行检测；对于未表现症状的植株，取约10株为一混合样品，用DAS-ELISA方法检测
6.3血清学检测
6.3.1DAS-ELISA检测
按附录B给出的方法，进行DAS-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。6.3.2免疫层析检测
按试剂操作说明，进行免疫层析检测。分子生物学检测
6.4.1RT-PCR检测
按附录C给出的方法，进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
6.4.2IC-RT-PCR检测
按附录D给出的方法，进行IC-RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
6.4.3序列测定与分析
RT-PCR或IC-RT-PCR检测阳性的样品，可进一步进行序列测定分析。把测定的序列与已知序列进行比对，以确定是否为SqMV序列。注：根据国际病毒分类委员会（ICTV)第九次分类报告中伴生虹豆病毒科（Secoviridae)病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为：CP的氨基酸序列一致性小于75%。7结果判定
7.1当血清学检测(DAS-ELISA或免疫层析）和分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR)结果均为阳性时，则判定为检出SqMV。
7.2当分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR)结果均为阳性、测定的序列为SqMV序列时，则判定2
为检出SqMV。
8结果记录
SN/T4178—2015
记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据，分子生物学检测结果保存电泳照片，免疫层析检测结果保存照片。样品保存
阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。3
SN/T4178—2015
A.1同物异名
squash mosaic comovirus
muskmelonmosaiccomovirus
cucurbit ring mosaic virus
muskmelonnecrotic mosaic
pumpkinmosaicvirus
watermelon stunt virus
A.2分布
附录A
（资料性附录）
南瓜花叶病毒相关信息
由于种子传播在栽培的葫芦科作物中非常普遍，很可能在葫芦科作物的生长区域均有分布。以下列出了目前已报道的主要国家或地区：欧洲：希腊、意大利、荷兰
亚洲：孟加拉国、中国、印度、伊朗、以色列、日本、约旦、哈萨克斯坦、黎巴嫩、菲律宾、也门；非洲：埃及、摩洛哥；
买加、蒙特塞拉特岛：
中美洲与加勒比海：洪都拉
斯、牙
北美洲：加拿大、墨西哥、美国；南美洲：阿根廷、巴西、委内瑞拉大洋洲：新西兰。
3寄主范围
自然寄主
主要侵染葫芦科（Cucurbitaceae）作物，如西瓜（CitrullusLanatus）、甜瓜（Cucumismelon）、黄瓜（Cucumissativus）、笋瓜（Cucurbitamarima）、南瓜（Cucurbitamoschata）、西葫芦（Cucurbitapepo），以及藜属（Chenopodium）的灰菜（C.album）。A.3.2诊断寄主
诊断寄主上的症状：
甜瓜（Cucumismelon）、西葫芦（Cucurbitapepo）：系统花叶、常有环斑、叶畸型角瓜（Cucumismetuliferus）：局部褪绿斑。不能侵染的寄主种类：苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）、曼陀罗（Daturastramonium）、心叶烟（Nicotianaglutinosa）、普通烟（N.tabacumcvsTurkish，Havana)。4
A.4形态特征
等轴多面体病毒，正二十面体，直径28nm～30nm。A.5基因组
SN/T4178—2015
基因组分段、正单链RNA片段分布在2个粒体中。基因组的5'-末端含有基因组链接蛋白（VPg），3-末端含有poly（A）尾。RNA-1全长5867nts[不含poly（A）序列（EU421059），含有一个大的开放阅读框，编码一个1858个氨基酸的209.4kDa聚合蛋白被剪切成5个推断的蛋白。RNA-2全长3395nts［不含poly（A)序列（EU421060），且RNA1和RNA2的5未端序列高度一致，含有一个开切成运动蛋白、大外壳蛋白和小外壳蛋白。放阅读框，编码一个聚合蛋白，被剪病毒的血清型
根据血清学反应,SqMV曾被分为两种血清型。血清组I在罗马甜瓜上引起严重的症状、而在南瓜些成员侵染西瓜，而血清组Ⅱ则不侵染西瓜。另外，不同血清型的上多数为轻型的症状。血清组I的一SqMV其种子传播的特性有所不同血清组I（SqMV-I）株系通过甜瓜、南瓜、笋瓜和西瓜种子传播，而血清组IⅡI（SqMV-Ⅱ）通过南瓜种子传播，引起南瓜和笋瓜严重症状，但在甜瓜上产生轻型症状A.7
传播途径
A.7.1种子传播
SqMV血清组I（SqMV-I）株系通过甜瓜、南瓜、笋瓜和西瓜种子传播，血清组Ⅱ（SqMV-IⅡ）通过南瓜种子传播。种子传播率通常为0.1
有报道传播率达到94%。来自摩
香洛哥
（C.murale）种子传播，传播率为A.7.2介体传播
10%，商业性和试验种子产
生大约10%的被感染幼苗。也
些SqMV分离物可以通过昆诺阿藜（C.quinoa）和墙生藜%
至少可通过14种咀嚼式昆虫传播，大多数是属于叶甲科（Chrysomelidae）（Acalymmasp.、Atranchya.sp.,Aulacophorasp.和Diabroticasp.），或者飘虫科（Coccinellidae）（食植飘虫属Epilachnasp.）。在西半球，主要是西部黄瓜条叶甲（Acalymmatrivittata）和黄瓜十一星叶星甲（Diaboticaundecimpunctata）。在地中海盆地，主要是黄瓜叶甲（Epilachnachrysomelina[E.elaterii]。另外，一种蝗虫（Melanoplusdifferentialis）也报道可以传播该病毒。A.7.3其他方式
机械传播。
SN/T4178—2015
ELISA所采用的试剂及配制
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN，）
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测方法
加入900mL水溶解，用HCI调节pH到9.6，然后加水至1L。保存在4℃中。注：叠氮化钠、（NaN）为高毒类化学药品，使用时必须采取必要的防护措施。若没有配备必要的防护措施，可不添加。下同。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KHPO.）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI）
叠氮化钠（NaN）
加人900mL水溶解，用NaOH或HCI调节pH到7.4，然后加水至1L。洗涤缓冲液（PBST）
1L的PBS中加人0.5mL的Tween20。B.1.4
样品提取缓冲液（pH7.4）
1L的PBST中加人20g的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。5酶标抗体稀释缓冲液
1L的PBST加人20g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2.0g的牛血清白蛋白(BSA)。底物缓冲液
MgCl2·6H20
二乙醇胺bZxz.net
叠氮化钠（NaN.）
用800mL纯水溶解，并用HCI调整pH至9.8，然后加HzO到1L。注：缓冲液可以储存在4℃～10℃中至少2个月，使用前回温至室温。B.1.7
底物溶液（需现配现用）
4-硝基苯磷酸二钠（pNPP）
底物缓冲液
SN/T4178—2015
配制前，先把底物缓冲液回温至室温。在10mL的底物缓冲液中加入10mg的pNPP粉末（或5mg/片的片剂2片），溶解，即配制成1mg/mL的底物溶液。注：溶液体积根据需要配制。可按照每条（8孔）需要1mL，而一整板需要10mL进行配制。B.1.8抗体
SqMV抗体、碱性磷酸酯酶标记的SqMV抗体。B.2操作步骤
检测样品的制备
叶片样品：按1：10的比例（质量体积比）在检测样品中加人样品提取缓冲液，研磨成勾浆后（如果症状样品，则取显示症状的叶片；如果未显示症状，则取10株叶片进行混合检测），离心，上清液作为检测样品。
种子样品：种子用研磨仪研磨后（如取6g的种子），按1：5的比例（质量体积比）在粉末中加入样品提取缓冲液（如在0.6g的粉末中加人3mL样品提取缓冲液），混勾，离心，上清液作为检测样品。B.2.2包被抗体
根据检测试剂说明，用包被缓冲液按比例稀释SqMV抗体（如1：200）。注：根据需要估算配制溶液体积，即：每条（8孔）需要1mL，而一整板需要10mL。下同。在96孔微孔板中每孔加入100μL包被抗体溶液。在室温下孵育2h～4h或在4℃下包被过夜，B.2.3加入检测样品
倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。加人100μL检测样品提取液到酶标板的孔中，每个样品至少2个孔。并设置阳性、空白和阴性对照。
在室温下孵育2h或在4℃下过夜
B.2.4加入酶标抗体
在孵育完成前，根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体（如1：200）。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100L酶标抗体溶液。
在室温下孵育2 h。
B.2.5加入底物
根据需要配制1mg/mL的底物溶液（现配现用）。注：在准备底物溶液的过程中，不要接触药剂或暴露在强光中，以避免在阴性对照孔中出现背景颜色倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100μL新鲜配制的底物溶液，B.2.6吸光值测定
室温下避光放置（30min～60min），至阳性对照孔明显显色。用酶标仪在405nm处读取吸光值，7
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南瓜花叶病毒检疫鉴定方法
Detection and identification of Squash mosaic virus2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T 4178—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布结构不承担识别这些专利的责任本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局、中华人民共和国湖南出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出人境检验检疫局、武汉哇哇噻纳技术开发有限公司。本标准主要起草人：廖富荣、黄迎波、林石明、梁新苗、吴媛、陈青、邓丛良、赵晓丽、聂棱、陈红运I
1范围
南瓜花叶病毒检疫鉴定方法
本标准规定了南瓜花叶病毒血清学、分子生物学的检测和鉴定方法。本标准适用于植物上南瓜花叶病毒的检测与鉴定2规范性引用文件
SN/T4178—2015
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。SN/T1809进出境植物种子检疫规程SN/T2122进出境植物及植物产品检疫抽样3南瓜花叶病毒基本信息
中文名称：南瓜花叶病毒
英文名称：Squashmosaicvirus
缩写：SqMV
分类地位：小RNA病毒目（P）
icornavirales）、伴生豇豆病毒科（Secoviridae）、豇豆花叶病毒亚科（Comovirinae）、豇豆花叶病毒属（Comouirus）成员传播方式：种子传播、昆虫介体传播和机械传播SqMV的其他信息参见附录
4方法原理
南瓜花叶病毒血清学、分子生物学特征是制定本标准的主要依据。5仪器设备与试剂
5.1主要仪器设备与用具
本标准主要涉及到的仪器设备和用具为：植物汁液提取仪、研磨仪、酶标仪、洗板机、微量天平（感量：0.001g）、PCR仪、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、高速冷冻台式离心机、水浴槽或恒温孵育器、pH计、各种量程的可调移液器（1000μL、200μL、100μL、20μL、10μL、2μL）。5.2主要试剂与配制
血清学试剂及其缓冲液配制见附录B,分子生物学试剂及其缓冲液配制见附录C和附录D。1
SN/T4178—2015
检测与鉴定
抽样检查
按照SN/T2122、SN/T1809给出的方法进行抽样、取样。6.2
2隔离种植
对于种子样品，一方面，可用种子直接检测（如取6g的种子，研磨粉碎后检测）；另一方面，可先隔离种植后用苗进行检测
隔离种植：在温室或植物生长箱等隔离条件下播种，至2片～3片叶后观察。对于疑似病毒症状的植株，用以下方法（如DAS-ELISA、RT-PCR等）进行检测；对于未表现症状的植株，取约10株为一混合样品，用DAS-ELISA方法检测
6.3血清学检测
6.3.1DAS-ELISA检测
按附录B给出的方法，进行DAS-ELISA检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，样品提取缓冲液作空白对照。6.3.2免疫层析检测
按试剂操作说明，进行免疫层析检测。分子生物学检测
6.4.1RT-PCR检测
按附录C给出的方法，进行RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
6.4.2IC-RT-PCR检测
按附录D给出的方法，进行IC-RT-PCR检测。用已知病毒分离物作阳性对照，健康植物组织作阴性对照，并设置空白对照。
6.4.3序列测定与分析
RT-PCR或IC-RT-PCR检测阳性的样品，可进一步进行序列测定分析。把测定的序列与已知序列进行比对，以确定是否为SqMV序列。注：根据国际病毒分类委员会（ICTV)第九次分类报告中伴生虹豆病毒科（Secoviridae)病毒种类的分类标准，其中关于基因组序列的判定依据为：CP的氨基酸序列一致性小于75%。7结果判定
7.1当血清学检测(DAS-ELISA或免疫层析）和分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR)结果均为阳性时，则判定为检出SqMV。
7.2当分子生物学检测（RT-PCR或IC-RT-PCR)结果均为阳性、测定的序列为SqMV序列时，则判定2
为检出SqMV。
8结果记录
SN/T4178—2015
记录各项实验数据，包括样品种类、来源，检测时间、地点、方法和结果等。血清学检测结果保存吸光值的数据，分子生物学检测结果保存电泳照片，免疫层析检测结果保存照片。样品保存
阳性的样品应妥善保存在低温或超低温冰箱中，并做好登记和标识，以备复核。3
SN/T4178—2015
A.1同物异名
squash mosaic comovirus
muskmelonmosaiccomovirus
cucurbit ring mosaic virus
muskmelonnecrotic mosaic
pumpkinmosaicvirus
watermelon stunt virus
A.2分布
附录A
（资料性附录）
南瓜花叶病毒相关信息
由于种子传播在栽培的葫芦科作物中非常普遍，很可能在葫芦科作物的生长区域均有分布。以下列出了目前已报道的主要国家或地区：欧洲：希腊、意大利、荷兰
亚洲：孟加拉国、中国、印度、伊朗、以色列、日本、约旦、哈萨克斯坦、黎巴嫩、菲律宾、也门；非洲：埃及、摩洛哥；
买加、蒙特塞拉特岛：
中美洲与加勒比海：洪都拉
斯、牙
北美洲：加拿大、墨西哥、美国；南美洲：阿根廷、巴西、委内瑞拉大洋洲：新西兰。
3寄主范围
自然寄主
主要侵染葫芦科（Cucurbitaceae）作物，如西瓜（CitrullusLanatus）、甜瓜（Cucumismelon）、黄瓜（Cucumissativus）、笋瓜（Cucurbitamarima）、南瓜（Cucurbitamoschata）、西葫芦（Cucurbitapepo），以及藜属（Chenopodium）的灰菜（C.album）。A.3.2诊断寄主
诊断寄主上的症状：
甜瓜（Cucumismelon）、西葫芦（Cucurbitapepo）：系统花叶、常有环斑、叶畸型角瓜（Cucumismetuliferus）：局部褪绿斑。不能侵染的寄主种类：苋色藜（Chenopodiumamaranticolor）、曼陀罗（Daturastramonium）、心叶烟（Nicotianaglutinosa）、普通烟（N.tabacumcvsTurkish，Havana)。4
A.4形态特征
等轴多面体病毒，正二十面体，直径28nm～30nm。A.5基因组
SN/T4178—2015
基因组分段、正单链RNA片段分布在2个粒体中。基因组的5'-末端含有基因组链接蛋白（VPg），3-末端含有poly（A）尾。RNA-1全长5867nts[不含poly（A）序列（EU421059），含有一个大的开放阅读框，编码一个1858个氨基酸的209.4kDa聚合蛋白被剪切成5个推断的蛋白。RNA-2全长3395nts［不含poly（A)序列（EU421060），且RNA1和RNA2的5未端序列高度一致，含有一个开切成运动蛋白、大外壳蛋白和小外壳蛋白。放阅读框，编码一个聚合蛋白，被剪病毒的血清型
根据血清学反应,SqMV曾被分为两种血清型。血清组I在罗马甜瓜上引起严重的症状、而在南瓜些成员侵染西瓜，而血清组Ⅱ则不侵染西瓜。另外，不同血清型的上多数为轻型的症状。血清组I的一SqMV其种子传播的特性有所不同血清组I（SqMV-I）株系通过甜瓜、南瓜、笋瓜和西瓜种子传播，而血清组IⅡI（SqMV-Ⅱ）通过南瓜种子传播，引起南瓜和笋瓜严重症状，但在甜瓜上产生轻型症状A.7
传播途径
A.7.1种子传播
SqMV血清组I（SqMV-I）株系通过甜瓜、南瓜、笋瓜和西瓜种子传播，血清组Ⅱ（SqMV-IⅡ）通过南瓜种子传播。种子传播率通常为0.1
有报道传播率达到94%。来自摩
香洛哥
（C.murale）种子传播，传播率为A.7.2介体传播
10%，商业性和试验种子产
生大约10%的被感染幼苗。也
些SqMV分离物可以通过昆诺阿藜（C.quinoa）和墙生藜%
至少可通过14种咀嚼式昆虫传播，大多数是属于叶甲科（Chrysomelidae）（Acalymmasp.、Atranchya.sp.,Aulacophorasp.和Diabroticasp.），或者飘虫科（Coccinellidae）（食植飘虫属Epilachnasp.）。在西半球，主要是西部黄瓜条叶甲（Acalymmatrivittata）和黄瓜十一星叶星甲（Diaboticaundecimpunctata）。在地中海盆地，主要是黄瓜叶甲（Epilachnachrysomelina[E.elaterii]。另外，一种蝗虫（Melanoplusdifferentialis）也报道可以传播该病毒。A.7.3其他方式
机械传播。
SN/T4178—2015
ELISA所采用的试剂及配制
包被缓冲液（pH9.6）
碳酸钠（NazCO）
碳酸氢钠（NaHCO）
叠氮化钠（NaN，）
附录B
（规范性附录）
DAS-ELISA检测方法
加入900mL水溶解，用HCI调节pH到9.6，然后加水至1L。保存在4℃中。注：叠氮化钠、（NaN）为高毒类化学药品，使用时必须采取必要的防护措施。若没有配备必要的防护措施，可不添加。下同。
磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）
氯化钠(NaCI)
磷酸二氢钾（KHPO.）
磷酸氢二钠（Na2HPO）
氯化钾（KCI）
叠氮化钠（NaN）
加人900mL水溶解，用NaOH或HCI调节pH到7.4，然后加水至1L。洗涤缓冲液（PBST）
1L的PBS中加人0.5mL的Tween20。B.1.4
样品提取缓冲液（pH7.4）
1L的PBST中加人20g的聚乙烯吡咯烷酮（PVP)。5酶标抗体稀释缓冲液
1L的PBST加人20g的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和2.0g的牛血清白蛋白(BSA)。底物缓冲液
MgCl2·6H20
二乙醇胺bZxz.net
叠氮化钠（NaN.）
用800mL纯水溶解，并用HCI调整pH至9.8，然后加HzO到1L。注：缓冲液可以储存在4℃～10℃中至少2个月，使用前回温至室温。B.1.7
底物溶液（需现配现用）
4-硝基苯磷酸二钠（pNPP）
底物缓冲液
SN/T4178—2015
配制前，先把底物缓冲液回温至室温。在10mL的底物缓冲液中加入10mg的pNPP粉末（或5mg/片的片剂2片），溶解，即配制成1mg/mL的底物溶液。注：溶液体积根据需要配制。可按照每条（8孔）需要1mL，而一整板需要10mL进行配制。B.1.8抗体
SqMV抗体、碱性磷酸酯酶标记的SqMV抗体。B.2操作步骤
检测样品的制备
叶片样品：按1：10的比例（质量体积比）在检测样品中加人样品提取缓冲液，研磨成勾浆后（如果症状样品，则取显示症状的叶片；如果未显示症状，则取10株叶片进行混合检测），离心，上清液作为检测样品。
种子样品：种子用研磨仪研磨后（如取6g的种子），按1：5的比例（质量体积比）在粉末中加入样品提取缓冲液（如在0.6g的粉末中加人3mL样品提取缓冲液），混勾，离心，上清液作为检测样品。B.2.2包被抗体
根据检测试剂说明，用包被缓冲液按比例稀释SqMV抗体（如1：200）。注：根据需要估算配制溶液体积，即：每条（8孔）需要1mL，而一整板需要10mL。下同。在96孔微孔板中每孔加入100μL包被抗体溶液。在室温下孵育2h～4h或在4℃下包被过夜，B.2.3加入检测样品
倒去孔中的抗体包被溶液，用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。加人100μL检测样品提取液到酶标板的孔中，每个样品至少2个孔。并设置阳性、空白和阴性对照。
在室温下孵育2h或在4℃下过夜
B.2.4加入酶标抗体
在孵育完成前，根据试剂盒说明，用酶标抗体缓冲液稀释相应的酶标抗体（如1：200）。倒去孔中的检测样品提取液，用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100L酶标抗体溶液。
在室温下孵育2 h。
B.2.5加入底物
根据需要配制1mg/mL的底物溶液（现配现用）。注：在准备底物溶液的过程中，不要接触药剂或暴露在强光中，以避免在阴性对照孔中出现背景颜色倒去酶标抗体溶液，用PBST洗4次～5次孔（可在洗板机上完成）。每孔加人100μL新鲜配制的底物溶液，B.2.6吸光值测定
室温下避光放置（30min～60min），至阳性对照孔明显显色。用酶标仪在405nm处读取吸光值，7
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