SN/T 4164-2015
基本信息
标准号： SN/T 4164-2015
中文名称：国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4164-2015.Detection of Sindbis virus at frontier port.
1范围
SN/T 4164规定了国境口岸人出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光PCR和逆转录PCR检测方法,包括标本采集、处理、检测程序和结果判定。
SN/T 4164适用于国境口岸人出境人员或捕获的蚊类携带辛德些斯病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
WS 233微生 物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1辛德毕斯病毒Sindbis virus
辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)属于披膜病毒科(Togaviridea )甲病毒属(Alphavirus),为单股正链RNA病毒,分子量约4.3x 10的六次方Da，沉降系数为42 S~49 s,具有真核mRNA的典型特征,裸RNA具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介,临床表现主要为发热、脑膜炎.脑炎、皮肤损害、抽搐、肌无力和皮疹等
1范围
SN/T 4164规定了国境口岸人出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光PCR和逆转录PCR检测方法,包括标本采集、处理、检测程序和结果判定。
SN/T 4164适用于国境口岸人出境人员或捕获的蚊类携带辛德些斯病毒的实验室检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
WS 233微生 物和生物医学实验室生物安全通用准则
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1辛德毕斯病毒Sindbis virus
辛德毕斯病毒(Sindbis virus,SINV)属于披膜病毒科(Togaviridea )甲病毒属(Alphavirus),为单股正链RNA病毒,分子量约4.3x 10的六次方Da，沉降系数为42 S~49 s,具有真核mRNA的典型特征,裸RNA具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介,临床表现主要为发热、脑膜炎.脑炎、皮肤损害、抽搐、肌无力和皮疹等
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4164—2015
国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法Detection of Sindbis virus at frontier port2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
涂醒查真伪
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4164—2015
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：赵锋、刘杨、钟玮、郭慧琳、张华荣、张丽杰、洪烨、王颖、骆星丹、孙肖红。1范围
国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法SN/T4164—2015
本标准规定了国境口岸人出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光PCR和逆转录PCR检测方法，包括标本采集、处理、检测程序和结果判定本标准适用于国境口岸人出境人员或捕获的蚊类携带辛德毕斯病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
辛德毕斯病毒
Sindbisvirus
辛德毕斯病毒（Sindbisvirus，SINV）属于披膜病毒科（Togaviridea）甲病毒属（Alphauirus），为单股正链RNA病毒，分子量约4.
×10°Da，沉降系数为42S~49s
S，具有真核mRNA的典型特征，裸RNA具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介，临床表现主要为发热、脑膜炎、脑炎、皮肤损害、抽描、肌无力和皮疹等。3.2bzxZ.net
real-timefluoresceneeRT-PCR
实时荧光RT-PCR
实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。
RT-PCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）将一条RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶通过PCR进行扩增。3.4
Ct值cyclethreshold
循环阅值，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。1
SN/T4164—2015
4检测对象
疑似感染的人出境人员血清和人出境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。实验室生物安全要求
检测工作中的个人防护参照GB19489。5.12
5.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全二级（BSL-2)及以上实验室的生物安全要求。5.3
使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。主要仪器设备
本方法使用的主要仪器设备包括：荧光定量PCR仪；
普通PCR仪；
电泳仪；
凝胶成像系统；
二级生物安全柜；
高压灭菌器；
-70℃超低温冰箱；
高速冷冻离心机；
组织匀浆机等。
7主要试剂
本方法使用的主要试剂包括：
样本制备及检测试剂：RNA保护剂、无水乙醇、琼脂糖、Goldview、20U/μLRNA酶抑制剂、200U/μLM-MLV逆转录酶、5U/μLTaq酶、1μg/μLoligd(T）、DEPCHzO、10XPCR缓冲液（含Mg2+）、5XRT-PCR缓冲液等。RNA提取试剂盒：QIAampViralRNAKit!\，内含AVL、AW1、AW2和AVE等成分。实时荧光PCR试剂盒：Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit2）。实时荧光RT-PCR检测目的片段为nspl基因，引物和探针如下：上游引物：5'-GTTCCTACCACAGCGACGAT-3”下游引物：5'-TGATACTGGTGCTCGGAAAACA-3”探针序列：5'FAM-TTGGACATAGGCAGCGCA-BHQ13\逆转录PCR检测目的片段为部分E2和6K蛋白基因，引物如下：上游引物：5-ACCACTTGACATTGCTCAC-31）德国Qiagen公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。美国Ambion公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等2）
效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。2
下游引物：5'-GTCTACCTTCGCCAGGTA-3SN/T4164—2015
上下游引物合成后用纯水溶解并分装冻存于冰箱内，引物浓度为20umol/L。上下游引物扩增核酸片段长度为563bp。
8检测程序
8.1样本的采集与保存运输
8.1.1人血清样本
使用不含抗凝剂的真空采血管无菌收集人静脉血3mL5mL，室温静置30min，待血液凝固后，2000r/min离心15min，收集上层血清于无菌合适的容器中并加贴标签，立即将容器置于冰屑或冰水混合物中送实验室检测或一70℃以下保存。8.1.2蚊虫样本
捕获的蚊虫麻醉后，快速分栋，分栋过程宜在简易低温装置上进行。分栋后按蚊虫种类每30只为-份（不足30只以一份计），装人适当的容器（如冻存管、离心管、塑料平血等），并加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。分装完毕的标本，送实验室检测或一70℃以下保存。
8.2样本处理
8.2.1人血清样本的处理
血清样本无需处理可直接提取核酸，如不及时检测应在一70℃以下保存。8.2.2蚊虫样本的处理
将待检蚊虫样本倒入研磨器中，加人RNA保护剂，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸人1.5mLRNase-free离心管，平衡后，3000r/min离心10min。取上清液提出核酸，剩余的蚊虫标本研磨液需保存在一70℃以下超低温冰箱以备复查。8.3病毒RNA提取
按照RNA提取试剂盒操作指导书操作。8.4实时荧光RT-PCR检测
8.4.1反应液的准备
设置25uL反应体系，每个待检样本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水5.2uL，RTPCRMix12.5μL，20μmol/L上游引物0.5μL，20μmol/L下游引物0.5μL，20μmol/L探针0.3μL，荧光RT-PCR酶1.0μL，模板RNA5.0μL。8.4.2扩增程序
扩增程序为：45℃、10min，1个循环；95℃、15min，1个循环；95℃、15s-60℃、30s（检测荧光信号），40个循环。
由于不同的荧光定量PCR仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。3
SN/T4164—2015
8.4.3结果判定
基线和对照
根据使用不同的荧光定量PCR仪设定好基线，设定的一般原则以阅值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。阳性对照可为辛德毕斯病毒核酸，也可为根据辛德毕斯病毒核酸序列体外合成的核酸片段；阴性对照为不含辛德毕斯病毒核酸的标本。质控标准
反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct≤35并有明显扩增曲线2个条件，否则，实验结果无效。
8.4.3.3结果判定
阴性结果：样品无Ct值或Ctz
>40，且无明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RTPCR检测阴性。
阳性结果：样品Ct值≤35，并有明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RT-PCR检测阳性。
可疑结果：样品Ct值在35～40之间的样本应重做.若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。8.5逆转录PCR检测
8.5.1设立对照
在实验中同时设立阳性对照和空空白对照
阳性对照：以辛德毕斯病毒毒株或携带目的片段的质粒为扩增模板。水为扩增模板。
空白对照：以DEPC
8.5.2RNA逆转录
用提取的RNA在反应体系中逆转录成cDNA，配置如下体系：RNA5μL，1μg/μLoligd(T)1μL，DEPCH,O补足至10μl,70℃预变性5min后迅速冰浴，然后加人10μL混合物，组成如下：5×RTPCR缓冲液4μL,10mmol/LeachdNTPsμL20U/uLF
RNA酶抑制剂(RNAasin)1μL200U/μL孵育1h，72℃加热10min灭活逆转录酶，获得M-MLV逆转录酶0.8μL,DEPCH,O3.2μL。42cDNA。
8.5.3PCR反应液的准备
取上述cDNA进行PCR反应，配置40μL反应体系，反应液组成为：10XPCR缓冲液（含Mg2+）4.0μL，10mmol/LeachdNTPs0.8μL，20μmol/L上游引物0.5μL，20μmol/L下游引物0.5μL，5U/μLTaq酶0.3μL,模板cDNA4.0μL,DEPCHO29.9μL。8.5.4PCR扩增程序
反应条件为：94℃、3min，1个循环；94℃、20s-→50℃、30s→72℃、30s，35个循环；72℃、10min；16℃保温。
8.5.5琼脂糖凝胶电泳检测
取9μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，于含5μL/mLGoldview的1.5%琼脂糖凝胶中进行电4
泳检测，5V/cm恒压，电泳20min～30min。用凝胶成像系统拍照记录结果。8.5.6结果判定
8.5.6.1质控标准
SN/T4164—2015
反应结果应同时符合空白对照未出现563bp扩增条带，且阳性对照在563bp位置出现特异性扩增条带2个条件，否则，实验结果无效。8.5.6.2结果判断
阴性结果：样品在563bp位置没有出现特异性扩增条带，则判定为辛德毕斯病毒核酸逆转录PCR检测阴性。
阳性结果：样品在563bp位置出现特异性扩增条带，则判定为辛德毕斯病毒核酸逆转录PCR检测阳性。阳性结果样品可以通过复检或核酸测序进一步确认。
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国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法Detection of Sindbis virus at frontier port2015-02-09发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
涂醒查真伪
2015-09-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4164—2015
本标准起草单位：中华人民共和国四川出人境检验检疫局、中华人民共和国北京出入境检验检疫局、中华人民共和国重庆出人境检验检疫局、中华人民共和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国山东出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院本标准主要起草人：赵锋、刘杨、钟玮、郭慧琳、张华荣、张丽杰、洪烨、王颖、骆星丹、孙肖红。1范围
国境口岸辛德毕斯病毒的检测方法SN/T4164—2015
本标准规定了国境口岸人出境人员或蚊类携带辛德毕斯病毒的实时荧光PCR和逆转录PCR检测方法，包括标本采集、处理、检测程序和结果判定本标准适用于国境口岸人出境人员或捕获的蚊类携带辛德毕斯病毒的实验室检测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求WS233微生物和生物医学实验室生物安全通用准则3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件
辛德毕斯病毒
Sindbisvirus
辛德毕斯病毒（Sindbisvirus，SINV）属于披膜病毒科（Togaviridea）甲病毒属（Alphauirus），为单股正链RNA病毒，分子量约4.
×10°Da，沉降系数为42S~49s
S，具有真核mRNA的典型特征，裸RNA具有感染性。辛德毕斯病毒在自然界中的宿主范围广泛，主要以库蚊和伊蚊为传播媒介，临床表现主要为发热、脑膜炎、脑炎、皮肤损害、抽描、肌无力和皮疹等。3.2bzxZ.net
real-timefluoresceneeRT-PCR
实时荧光RT-PCR
实时荧光RT-PCR方法有多种，本标准采用的是TaqMan水解探针法，其原理是在常规RT-PCR的基础上，加人一条特异性的荧光探针，该探针为一段寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团和一个荧光灭基团，探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，利用Taq酶的5-3'外切酶活性将探针酶切水解，使荧光报告基团和荧光淬灭基团分离，从而荧光监测系统可以接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的积累与PCR产物形成完全同步。
RT-PCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应，由依赖RNA的DNA聚合酶（逆转录酶）将一条RNA链逆转录成为互补DNA，再以此为模板，由依赖DNA的DNA聚合酶通过PCR进行扩增。3.4
Ct值cyclethreshold
循环阅值，每个反应管内的荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数。1
SN/T4164—2015
4检测对象
疑似感染的人出境人员血清和人出境交通工具、集装箱、货物以及口岸等场所捕获的媒介蚊虫。实验室生物安全要求
检测工作中的个人防护参照GB19489。5.12
5.2实验室应遵循GB19489和WS233对生物安全二级（BSL-2)及以上实验室的生物安全要求。5.3
使用过的实验用品应遵照GB19489对废弃物的处理要求进行无害化处理。主要仪器设备
本方法使用的主要仪器设备包括：荧光定量PCR仪；
普通PCR仪；
电泳仪；
凝胶成像系统；
二级生物安全柜；
高压灭菌器；
-70℃超低温冰箱；
高速冷冻离心机；
组织匀浆机等。
7主要试剂
本方法使用的主要试剂包括：
样本制备及检测试剂：RNA保护剂、无水乙醇、琼脂糖、Goldview、20U/μLRNA酶抑制剂、200U/μLM-MLV逆转录酶、5U/μLTaq酶、1μg/μLoligd(T）、DEPCHzO、10XPCR缓冲液（含Mg2+）、5XRT-PCR缓冲液等。RNA提取试剂盒：QIAampViralRNAKit!\，内含AVL、AW1、AW2和AVE等成分。实时荧光PCR试剂盒：Ag-Path-IDTMOnestepRT-PCRKit2）。实时荧光RT-PCR检测目的片段为nspl基因，引物和探针如下：上游引物：5'-GTTCCTACCACAGCGACGAT-3”下游引物：5'-TGATACTGGTGCTCGGAAAACA-3”探针序列：5'FAM-TTGGACATAGGCAGCGCA-BHQ13\逆转录PCR检测目的片段为部分E2和6K蛋白基因，引物如下：上游引物：5-ACCACTTGACATTGCTCAC-31）德国Qiagen公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。美国Ambion公司产品，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对这一产品的认可，如果其他等2）
效产品具有相同的效果，则可使用这些产品。2
下游引物：5'-GTCTACCTTCGCCAGGTA-3SN/T4164—2015
上下游引物合成后用纯水溶解并分装冻存于冰箱内，引物浓度为20umol/L。上下游引物扩增核酸片段长度为563bp。
8检测程序
8.1样本的采集与保存运输
8.1.1人血清样本
使用不含抗凝剂的真空采血管无菌收集人静脉血3mL5mL，室温静置30min，待血液凝固后，2000r/min离心15min，收集上层血清于无菌合适的容器中并加贴标签，立即将容器置于冰屑或冰水混合物中送实验室检测或一70℃以下保存。8.1.2蚊虫样本
捕获的蚊虫麻醉后，快速分栋，分栋过程宜在简易低温装置上进行。分栋后按蚊虫种类每30只为-份（不足30只以一份计），装人适当的容器（如冻存管、离心管、塑料平血等），并加贴标签。标签内容至少包括以下信息：编号、种类、采集时间、采集地点、采集人等。分装完毕的标本，送实验室检测或一70℃以下保存。
8.2样本处理
8.2.1人血清样本的处理
血清样本无需处理可直接提取核酸，如不及时检测应在一70℃以下保存。8.2.2蚊虫样本的处理
将待检蚊虫样本倒入研磨器中，加人RNA保护剂，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将研磨液吸人1.5mLRNase-free离心管，平衡后，3000r/min离心10min。取上清液提出核酸，剩余的蚊虫标本研磨液需保存在一70℃以下超低温冰箱以备复查。8.3病毒RNA提取
按照RNA提取试剂盒操作指导书操作。8.4实时荧光RT-PCR检测
8.4.1反应液的准备
设置25uL反应体系，每个待检样本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水5.2uL，RTPCRMix12.5μL，20μmol/L上游引物0.5μL，20μmol/L下游引物0.5μL，20μmol/L探针0.3μL，荧光RT-PCR酶1.0μL，模板RNA5.0μL。8.4.2扩增程序
扩增程序为：45℃、10min，1个循环；95℃、15min，1个循环；95℃、15s-60℃、30s（检测荧光信号），40个循环。
由于不同的荧光定量PCR仪性能有差异，必要时扩增程序可做适当调整。3
SN/T4164—2015
8.4.3结果判定
基线和对照
根据使用不同的荧光定量PCR仪设定好基线，设定的一般原则以阅值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点，也可根据仪器噪音情况调整。阳性对照可为辛德毕斯病毒核酸，也可为根据辛德毕斯病毒核酸序列体外合成的核酸片段；阴性对照为不含辛德毕斯病毒核酸的标本。质控标准
反应结果应同时符合阴性对照无扩增曲线而阳性对照Ct≤35并有明显扩增曲线2个条件，否则，实验结果无效。
8.4.3.3结果判定
阴性结果：样品无Ct值或Ctz
>40，且无明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RTPCR检测阴性。
阳性结果：样品Ct值≤35，并有明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RT-PCR检测阳性。
可疑结果：样品Ct值在35～40之间的样本应重做.若重做结果仍然有明显扩增曲线，则判定为辛德毕斯病毒核酸实时荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性。8.5逆转录PCR检测
8.5.1设立对照
在实验中同时设立阳性对照和空空白对照
阳性对照：以辛德毕斯病毒毒株或携带目的片段的质粒为扩增模板。水为扩增模板。
空白对照：以DEPC
8.5.2RNA逆转录
用提取的RNA在反应体系中逆转录成cDNA，配置如下体系：RNA5μL，1μg/μLoligd(T)1μL，DEPCH,O补足至10μl,70℃预变性5min后迅速冰浴，然后加人10μL混合物，组成如下：5×RTPCR缓冲液4μL,10mmol/LeachdNTPsμL20U/uLF
RNA酶抑制剂(RNAasin)1μL200U/μL孵育1h，72℃加热10min灭活逆转录酶，获得M-MLV逆转录酶0.8μL,DEPCH,O3.2μL。42cDNA。
8.5.3PCR反应液的准备
取上述cDNA进行PCR反应，配置40μL反应体系，反应液组成为：10XPCR缓冲液（含Mg2+）4.0μL，10mmol/LeachdNTPs0.8μL，20μmol/L上游引物0.5μL，20μmol/L下游引物0.5μL，5U/μLTaq酶0.3μL,模板cDNA4.0μL,DEPCHO29.9μL。8.5.4PCR扩增程序
反应条件为：94℃、3min，1个循环；94℃、20s-→50℃、30s→72℃、30s，35个循环；72℃、10min；16℃保温。
8.5.5琼脂糖凝胶电泳检测
取9μL扩增产物，加入1μL上样缓冲液，于含5μL/mLGoldview的1.5%琼脂糖凝胶中进行电4
泳检测，5V/cm恒压，电泳20min～30min。用凝胶成像系统拍照记录结果。8.5.6结果判定
8.5.6.1质控标准
SN/T4164—2015
反应结果应同时符合空白对照未出现563bp扩增条带，且阳性对照在563bp位置出现特异性扩增条带2个条件，否则，实验结果无效。8.5.6.2结果判断
阴性结果：样品在563bp位置没有出现特异性扩增条带，则判定为辛德毕斯病毒核酸逆转录PCR检测阴性。
阳性结果：样品在563bp位置出现特异性扩增条带，则判定为辛德毕斯病毒核酸逆转录PCR检测阳性。阳性结果样品可以通过复检或核酸测序进一步确认。
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