中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4273—2015 国境口岸版纳病毒荧光PCR检测方法 Real time PCR detection methods of Banna virus at ports 发布日期：2015-05-26 实施日期：2016-01-01 前言 本标准按照 GB/T 1.1—2009 给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广东出入境检验检疫局、中华人民共和国四川出入境检验检疫局、中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：洪烨、丁国允、孙薇、周艳容、师永霞、郑夔、黄吉城、刘扬、戴俊、苏水宽、贺骥、孙肖红、幸芦琴、李小波、钟玉清、相大鹏、郭波旋。 1 范围 本标准规定了国境口岸版纳病毒的实时荧光RT-PCR检测方法，包括标本采集、处理，检验程序、方法及结果判定。本标准适用于国境口岸版纳病毒的实验室检测。 2 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 实时荧光RT-PCR：实时荧光反转录-聚合酶链反应 Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的值时所经历的循环数 RNA：核糖核酸 FAM：FAM荧光染料，一种荧光报告基团 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 版纳病毒 (Bannavirus) 版纳病毒（Bannavirus，BAV）为12节段双链RNA病毒，是一种虫媒病毒，主要经蚊虫传播，可引起人类发热和病毒性脑炎，目前该病毒主要分布在我国和印度尼西亚等地区。版纳病毒电镜下观察为二十面体球形颗粒，表面有纤突，直径在60nm～70nm之间。病毒的基因组由12个节段的双链(dsRNA)组成，全长约为21000bp。 3.2 实时荧光PCR (real-time fluorescence PCR) 实时荧光PCR方法是在常规PCR的基础上，加入一套可反映PCR扩增过程的荧光报告系统，通过监测系统接收到荧光信号，实时判断每个反应管内目的基因的模板扩增情况。 4 主要仪器设备 本方法使用的主要仪器包括荧光定量PCR仪、超净工作台、Ⅱ级生物安全柜、高压灭菌锅、低温高速离心机（最大离心力20000×g）、玻璃研磨器、漩涡振荡器、冰箱（4℃、-20℃、-70℃或液氮罐）、移液器等。 5 主要试剂 本方法使用的主要试剂包括：核酸提取试剂如Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Kit；实时荧光RT-PCR通用试剂如Ambion公司的AgPath-ID™ One-step RT-PCR Kit；PBS溶液（pH 7.0）；无RNA酶的DEPC水；引物和探针（针对版纳病毒Vp12基因片段编码区核苷酸高度保守区进行设计，引物和探针序列见表1）。 表1 版纳病毒实时荧光RT-PCR检测的引物和探针 | 引物/探针名称 | 序列 (5'-3') | 扩增片段大小 | | :--- | :--- | :--- | | Banna-FP | CGTAATTTTATGGACCACCTGGA | 82bp | | Banna-RP | CATAAGAAGCATGGCGACCTAG | 82bp | | Banna-probe | FAM-CTACTGGTCCTGTGCO-CGTTAGGTCCC-BHQ1 | 82bp | 6 标本的采集与处理 6.1 人体标本 无菌采集发热期可疑病人的静脉血或脑脊液。血标本于室温静置30min使其凝固，500×g离心10min，收集血清于2mL无菌螺口塑料管中；脑脊液则直接装入2mL无菌螺口塑料管，低温送到实验室检测。如24h内不能送到实验室，将血清或脑脊液管用耐低温油性记号笔上编号，置于-70℃保存。 6.2 蚊标本 将采集的蚊子直接放入-20℃至-70℃容器中冻死后，取出并进行分类编号，一般按30～50只一份，不足30只的可按采样点或分类归为一袋。装入2mL无菌螺口塑料血清管内，旋紧管盖，做好编号。于-70℃以下运输或保存。蚊标本处理时应在冰上操作。从-70℃容器中取出蚊标本，倒入研磨器中，加入PBS液1mL，反复研磨至组织碎片基本消失，随即将研磨液吸入1.5mL离心管配平后，置于预冷4℃的离心机上，12000r/min离心1min。取上清液提取核酸进行实时荧光RT-PCR检测，剩余的蚊标本研磨液需保存在-70℃以下容器以备复查。 7 病毒核酸提取方法 按试剂盒说明提取核酸，用于实时荧光RT-PCR检测，或在-70℃储存RNA待检。 8 实时荧光RT-PCR检测 8.1 反应体系配制 配制20μL反应体系，每个待检标本反应液的组成为：无RNA酶的灭菌双蒸水2.2μL、2×RT-PCR Master Mix...