SN/T 4289-2015
基本信息
标准号： SN/T 4289-2015
中文名称：斑点叉尾鯝病毒病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：9569621
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4289-2015.Quarantine protocol for channel catfish virus disease.
1范围
SN/T 4289规定了斑点叉尾鯝病毒病临床症状、病原分离、中和试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应的检测方法。
SN/T 4289适用于斑点叉尾鯝病毒病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3概述
斑点叉尾鯝病毒病(channel catfish virus disease ,CCVD)是由斑点叉尾鯝病毒(channel catfish vi-rus,CCV)感染斑点叉尾鯝等温水鱼而引起的病毒性疾病,发病死亡率可达100%。该病曾被世界动物卫生组织(OIE)列入水生动物疫病名录,我国农业部和国家质量监督检验检疫总局将该病列人《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》二类传染病(参见附录A)。
4设备和器材
4.1 倒置显微镜。
4.2 生化培养箱。
4.3普通冰箱和低温冰箱。
4.4 离心机和离心管。
4.5超净工作台。
4.6 PCR 仪。
4.7电泳仪。
4.8凝胶 成像仪。
4.9酶标仪。
1范围
SN/T 4289规定了斑点叉尾鯝病毒病临床症状、病原分离、中和试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应的检测方法。
SN/T 4289适用于斑点叉尾鯝病毒病的检疫。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
3概述
斑点叉尾鯝病毒病(channel catfish virus disease ,CCVD)是由斑点叉尾鯝病毒(channel catfish vi-rus,CCV)感染斑点叉尾鯝等温水鱼而引起的病毒性疾病,发病死亡率可达100%。该病曾被世界动物卫生组织(OIE)列入水生动物疫病名录,我国农业部和国家质量监督检验检疫总局将该病列人《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》二类传染病(参见附录A)。
4设备和器材
4.1 倒置显微镜。
4.2 生化培养箱。
4.3普通冰箱和低温冰箱。
4.4 离心机和离心管。
4.5超净工作台。
4.6 PCR 仪。
4.7电泳仪。
4.8凝胶 成像仪。
4.9酶标仪。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4289—2015
斑点叉尾病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol forchannel catfish virus disease2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bzxZ.net
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4289—2015
本标准修改采用了OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中2.1.6：斑点叉尾鲷病毒病。本标准与OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）2.1.6相比，主要差别如下：-将ELISA流程中的封闭液由脱脂奶粉改为1%明胶；一去除了在ELISA待检样品中加人TritonX-100的步骤，增加了H,O2去除非特异性过氧化物酶的步骤；
一修改了ELISA检测流程中PBST的洗涤次数；一增加了酚氯仿法抽提病毒核酸的内容；将内控DNA的长度改为186bp。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张晏、王娜、张利峰、景宏丽、吴绍强、邓俊花I
1范围
斑点叉尾病毒病检疫技术规范
SN/T4289—2015
本标准规定了斑点叉尾鲫病毒病临床症状、病原分离、中和试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应的检测方法。
本标准适用于斑点叉尾鲫病毒病的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述
斑点叉尾鲷病毒病（channelcatfishvirusdisease，CCVD）是由斑点叉尾病毒（channelcatfishvirus，CCV)感染斑点叉尾等温水鱼而引起的病毒性疾病，发病死亡率可达100%。该病曾被世界动物卫生组织（OIE)列入水生动物疫病名录，我国农业部和国家质量监督检验检疫总局将该病列入《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》二类传染病（参见附录A）。设备和器材
倒置显微镜。
生化培养箱。
普通冰箱和低温冰箱。
离心机和离心管。
超净工作台。
PCR仪。
电泳仪。
凝胶成像仪。
酶标仪。
试剂和材料
水：应符合GB/T6682中一级水的规格。CCV病毒参考株（阳性对照），由国家指定机构提供羊抗CCV的IgG，由国家指定机构提供。5.3
鼠抗CCV的单克隆抗体，由国家指定机构提供。5.4
内控DNA，是一段长186bp的人工合成DNA片段，其两端的序列和CCV的引物序列互补。由1
SN/T4289—2015
检测实验室合成，或购买商品化试剂。5.6斑点叉尾鲫卵巢细胞（CCO)。5.7Tag酶：5U/μL。一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化5.8dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L，一20℃保存。5.9引物：引物浓度为50pmol/μL。引物序列：F:5'-TCATCCGAATCCGACAACTGA-3R:5'-CCAAGATCGCGGAGAAAC-3\
扩增CCV蛋白激酶基因序列中136bp片段。5.10无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。5.11
琼脂糖：电泳纯。
5.12封闭液：1%明胶。
6临床症状
病鱼摄食活动减弱，挛式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉人水底衰竭而亡。病鱼皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色。鳃丝苍白或出血，眼球突出。肾苍白肿大，肌肉、肝、肾及脾出血，肝、肾及脾肿大，胃内充满黏液样分泌物，腹膜水肿，腹腔内充满黄色渗出物。7采样
7.1采样要求
采样时水温应在20℃以上，挑选有典型临床症状的病鱼或者题死鱼进行检测。7.2采样部位
送到实验室的应是活鱼。
≤3cm的鱼苗，取整条鱼：体长3cm~6cm的鱼苗取内脏（包括若体长
肾）；体长大于6cm的鱼则取肾和脾8病毒的分离
8.1样品处理
先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1：10的最终稀释度重悬于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液（参见附录B中B.1)中。25℃下孵育2h4h，或4℃下孵育过夜，以释放病毒。8000g离心20min，收集上清液。8.2病毒接种与观察
8.2.1对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1：10、1：100和1：1000三个稀释度的上清液分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上（96孔板中），每稀释度至少2孔，每孔接种100μL。25℃～30℃吸附1h后，不弃去接种液，直接加人细胞培养液，置于25℃～30℃培养。试验中要有2孔阳性对照（接种CCV参考株）和空白对照（未接种病毒的细胞）。8.2.2阳性对照和待测样品都接种细胞后，10d内每天用40倍100倍倒置显微镜检查。整个培养阶段维持细胞培养液的pH值在7.3～7.6之间。8.2.3在空白对照细胞始终正常，阳性对照细胞出现了细胞病变（CPE)的情况下，当接种了被检上清2
SN/T4289—2015
稀释液的细胞出现CPE时，应立即进行病毒鉴定。如果没有CPE出现，则还要盲传一次，然后进行鉴定。
4盲传时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以8000g，4℃离心8.2.4
20min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，继续置于25℃～30℃培养7d。每天用40倍～100倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判断为阴性。如果阳性对照也未出现CPE，则实验失败。应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离。
9病毒的鉴定
9.1中和试验
收集出现CPE的细胞培养液，反复冻融2次后，在4℃下2000g离心15min去除细胞碎片。9.1.1
将含病毒的上清液系列稀释到工每稀释度的病毒液与等体积的抗CCV抗体溶液混合，同时另取这些病毒稀释液于等体积的细胞培养液混合（中和抗体溶液的效价按50%蚀斑减少单位计算不少于2000）。同时，取参考毒株作为阳性对照，取其他病毒株作为阴性对照，按照9.1.3的方法制备混合液。9.1.4
各混合物在25℃下孵育1h
将上述混合物分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上（培养于96孔板中），每稀释度接2孔，每孔50μL，于25℃下吸附0.5h~1h。吸附后每孔加人含有10%FCS的pH7.3~7.6的细胞培养液、于25℃～30℃下培养。9.1.7
检查CPE发生情况，计算并比较非中和对照组和中和试验组的TCIDso值。若病毒悬液被抗CCV特异性抗体处理后，CPE被抑制或被显著推迟，而未被处理的细胞培养液中CPE明显，导致二者病毒滴度相差2个以上，则待测的病毒为CCV中和抗体阳性。9.2
ELISA检测
用pH9.6的包埋液（参见B.2）适量稀释纯化的羊抗COVIgG，包被ELISA板，每孔100μL。9.2.1
4℃孵育过夜。
用含0.05%吐温-20的0.01
mol/LPBS(PBST，参见B.3和B.4）洗3次。℃反应1h，PBST洗3次。
用1%明胶（溶于PBST中）封闭，每孔200μL。9.2.3
加人待测的样品、CCV参考毒株（阳性对照）、未接种CCV的CCO悬液（阴性对照）和PBS（空白对照），每组设2个平行对照孔，每孔100μL,37℃反应1h。PBST洗3次。9.2.5加鼠抗CCV单克隆抗体到小孔中，每孔100μL，37℃反应1h。PBST洗3次。9.2.6加人0.1%H，Oz（用蒸馏水稀释）去除非特异性过氧化物酶。每孔150μL，37℃反应15min，PBST洗2次。
加人标记辣根过氧化物酶的抗鼠IgG（酶标二抗），每孔100μL，37℃反应1h。PBST洗3次。9.2.7
9.2.8加人底物（用底物缓冲液配制的TMB和过氧化氢，参见B.5B.7)。当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加人终止液（参见B.8），在450nm波长下读取结果。如果用其他底物（如底物缓冲液配制的OPD和过氧化氢）则需改用相应光波长（如490nm）测量。9.2.9结果判定。以空白对照的光密度值（即OD值)为零，测量各孔的光吸收值。先计算阳性对照和阴性对照的OD值之比（即P/N值）。如果P/N≥2.1，表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的P/N值之比。当P/N≥2.1时判为CCVELISA阳性。3
SN/T4289—2015
9.3PCR检测
DNA提取
10min。
将490μL细胞悬液放人1.5mL的离心管，反复冻融2次。加人10μL蛋白酶K缓冲液（参见B.9),56℃孵育1h。加人500μLTris饱和酚和500μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），振荡混匀。12000r/min离心吸取上层水相，加人新的1.5mL的离心管中。注意不要吸到中间层和下层，以免混人蛋白质。9.3.1.4
水相中加人不少于1.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后一20℃放置过夜12000r/min离心10min。
弃上清液，沉淀在室温下晾至半干，50uL水溶解，一20℃保存备用。注：也可以采用同等效力的其他DNA抽提方法，或相应的试剂盒来抽提病毒DNA。9.3.2PCR扩增DNA
应在单独的工作区进行PCR加样工作。最多每10个样品需要准备1个阴性对照和1个阳性对照。
反应体系：10×缓冲液10μL、25mmol/L的MgSO，10μL、dNTPs（每种浓度均为2.5mmol/L）4μL、每种引物（50pmol/μL）各0.8μL、Taq酶（5U/μL)0.6μL，内控DNA0.6μL模板6μL，加水到总体积为100μL。如果PCR没有热盖，每管还需加人50μL矿物油，否则可以不加。短时间低速离心让试剂集中在底部。再将反应管置于PCR扩增仪反应条件：先93℃4min，再93℃30s-60℃30s72℃30s，30次循环，然后72℃10min，最后4℃保温。
9.3.3琼脂糖电泳
用TBE电泳缓冲液（参见B.10)配制3%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB，参见B.11)平板。将8μL样品和2μL样品缓冲液（参见B.12）混匀后加人样品孔。在电泳时设立DNA分子量标准物作对照。100mA恒流电泳，溴酚蓝到达凝胶底部停止电泳。在紫外灯下或者凝胶成像仪中观察核酸带并判断结果。
9.3.4设立对照
在9.3.1样品处理过程中，每10份样品设立1组阳性对照、阴性对照和空白对照。9.3.4.1
取含有已知CCV参考株的细胞悬液作为阳性对照。取未接毒的细胞悬液作为阴性对照。9.3.4.3
9.3.4.4取等体积的水代替模板作为空白对照。9.3.5PCR检测结果判定
内控DNA会扩增出186bp的DNA片段，CCV病毒DNA会扩增出136bp的DNA片段。PCR后，阴性对照和空白对照会出现186bp的DNA片段，阳性对照会出现186bp和136bp2条DNA片段。如果对照中CCV浓度较高，186bp的DNA片段有可能很弱或消失。待测样品PCR扩增后能在相应136bpDNA位置上有带，可判为PCR阳性。无该条带或带的大小不是136bp判为PCR阴性。如果待测样品产生的DNA带大小异常或无法准确判断大小，需要将片段进行基因测序，并与已知标准基因序列比较（参见附录C)。4
综合判定
SN/T4289—2015
对有临床症状的鱼：细胞分离病毒产生CPE后，用中和试验、PCR、ELISA任何一项结果为阳性，即可确诊为患有斑点叉尾鲷病毒病。5
SN/T4289—2015
A.1病原
附录A
（资料性附录）
斑点叉尾病毒病概述
病原为斑点叉尾鲫病毒（CCV）。病毒为20面体双链DNA病毒，有囊膜。病毒粒子直径175nm~200nm。病毒只一种血清型，但采用单克隆抗体发现不同株间有不同抗原决定簇，并存在毒力的差异和基因序列的差异。CCV仅能在BB,CCO.KIK细胞株上复制生长，最适温度为25℃～30℃。症状与流行
该病在夏季水温25℃以上时会发病，流行适温为28℃～30℃。发病的临床症状包括：摄食活动减弱，式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉入水底衰竭而亡。病鱼皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色；鳃丝苍白或出血，眼球突出组织病理变化主要表现为：肾脏、肝脏肿大，脾脏充血，胃肠道水肿；造血组织和胃肠道内出现巨噬细胞聚集区；有些肠壁的黏膜、黏膜下层发生坏死、脱落；有些鱼的肠黏膜下层及绒毛严重出血，甚至血漏人肠腔；骨骼肌出血，胰脏坏死，神经细胞核出现空泡，周围神经纤维肿大。该病20世纪60年代在美国最先发现其流行，洪都拉斯和俄罗斯也有报道。目前主要在北美地区流行。近几年报道的自然暴发仅仅限于斑点叉尾的鱼苗和鱼种。也有研究结果证明，CCV还能感染南方大口站和加州鲈，并能造成感染鱼的迅速死亡。A.3预防与控制
CCVD目前没有有效的药物治疗
有报道使用经胡鲶（walkingcatfish）的KLK细胞株继和疫苗。
代的弱毒疫苗可保护小鲶鱼对抗野外型产毒株的致命攻击，麟酰乙酸（phosphonoaceticacid，PAA）也可抑制组织培养中的CCV，但尚未有大规模投入使用的报告A.4诊断
在水温25℃～35℃，特别是在28℃～30℃时，斑点叉尾鲷鱼苗大量死亡，出现鳍条基部出血、鳃丝苍白、脾肾肝等组织肿大坏死等临床症状，可以初步诊断是CCVD，需要进一步确诊。使用brownbullhead(BB)或channelcatfishovary(CCO)细胞株分离CCV，待产生CPE后，采用中和试验、ELISA技术和PCR方法确诊病毒。在OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中规定，这些检测方法只能用于有临床症状的鱼的检测。没有临床症状的鱼，不能用细胞分离和抗原检测的方法检测，可以用PCR方法检测。若仅仅PCR阳性，只能判定为可疑，6
B.1细胞培养液
附录B
（资料性附录）
试剂配制
SN/T4289—2015
按M199培养基（含Earles盐）说明书的要求，用一级水配制，然后加人10%经56℃30min灭活的胎牛血清，用NaHCO粉末调节培养液的pH至7.2～7.4。过滤除菌，分装后一20℃保存。在开放系统使用时，需要加人过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L
包埋稀释液（pH9.6）
0.01mol/LPBS(pH7.2~7
NazHPO
NaH,PO
充分搅拌溶解后，4℃保存
1000mL
1000ml
洗涤液PBST(0.01mol/LpH=7
4磷酸盐缓冲液，含0.05%的吐温-20）NaCl
NazHPO,·12H20
吐温-20
1000mL
充分搅拌溶解后，4℃保存（可以配制10倍浓缩液存储）。TMB储存液
TMB（TMB硫酸盐）
DMF（N，N-dimethylformamide,5mL/瓶)4℃保存。
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斑点叉尾病毒病检疫技术规范
Quarantine protocol forchannel catfish virus disease2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局bzxZ.net
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4289—2015
本标准修改采用了OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中2.1.6：斑点叉尾鲷病毒病。本标准与OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）2.1.6相比，主要差别如下：-将ELISA流程中的封闭液由脱脂奶粉改为1%明胶；一去除了在ELISA待检样品中加人TritonX-100的步骤，增加了H,O2去除非特异性过氧化物酶的步骤；
一修改了ELISA检测流程中PBST的洗涤次数；一增加了酚氯仿法抽提病毒核酸的内容；将内控DNA的长度改为186bp。
本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出人境检验检疫局。本标准主要起草人：张晏、王娜、张利峰、景宏丽、吴绍强、邓俊花I
1范围
斑点叉尾病毒病检疫技术规范
SN/T4289—2015
本标准规定了斑点叉尾鲫病毒病临床症状、病原分离、中和试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应的检测方法。
本标准适用于斑点叉尾鲫病毒病的检疫。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3概述
斑点叉尾鲷病毒病（channelcatfishvirusdisease，CCVD）是由斑点叉尾病毒（channelcatfishvirus，CCV)感染斑点叉尾等温水鱼而引起的病毒性疾病，发病死亡率可达100%。该病曾被世界动物卫生组织（OIE)列入水生动物疫病名录，我国农业部和国家质量监督检验检疫总局将该病列入《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》二类传染病（参见附录A）。设备和器材
倒置显微镜。
生化培养箱。
普通冰箱和低温冰箱。
离心机和离心管。
超净工作台。
PCR仪。
电泳仪。
凝胶成像仪。
酶标仪。
试剂和材料
水：应符合GB/T6682中一级水的规格。CCV病毒参考株（阳性对照），由国家指定机构提供羊抗CCV的IgG，由国家指定机构提供。5.3
鼠抗CCV的单克隆抗体，由国家指定机构提供。5.4
内控DNA，是一段长186bp的人工合成DNA片段，其两端的序列和CCV的引物序列互补。由1
SN/T4289—2015
检测实验室合成，或购买商品化试剂。5.6斑点叉尾鲫卵巢细胞（CCO)。5.7Tag酶：5U/μL。一20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化5.8dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L，一20℃保存。5.9引物：引物浓度为50pmol/μL。引物序列：F:5'-TCATCCGAATCCGACAACTGA-3R:5'-CCAAGATCGCGGAGAAAC-3\
扩增CCV蛋白激酶基因序列中136bp片段。5.10无水乙醇：分析纯，使用前预冷到一20℃。5.11
琼脂糖：电泳纯。
5.12封闭液：1%明胶。
6临床症状
病鱼摄食活动减弱，挛式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉人水底衰竭而亡。病鱼皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色。鳃丝苍白或出血，眼球突出。肾苍白肿大，肌肉、肝、肾及脾出血，肝、肾及脾肿大，胃内充满黏液样分泌物，腹膜水肿，腹腔内充满黄色渗出物。7采样
7.1采样要求
采样时水温应在20℃以上，挑选有典型临床症状的病鱼或者题死鱼进行检测。7.2采样部位
送到实验室的应是活鱼。
≤3cm的鱼苗，取整条鱼：体长3cm~6cm的鱼苗取内脏（包括若体长
肾）；体长大于6cm的鱼则取肾和脾8病毒的分离
8.1样品处理
先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1：10的最终稀释度重悬于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液（参见附录B中B.1)中。25℃下孵育2h4h，或4℃下孵育过夜，以释放病毒。8000g离心20min，收集上清液。8.2病毒接种与观察
8.2.1对1：10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1：10、1：100和1：1000三个稀释度的上清液分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上（96孔板中），每稀释度至少2孔，每孔接种100μL。25℃～30℃吸附1h后，不弃去接种液，直接加人细胞培养液，置于25℃～30℃培养。试验中要有2孔阳性对照（接种CCV参考株）和空白对照（未接种病毒的细胞）。8.2.2阳性对照和待测样品都接种细胞后，10d内每天用40倍100倍倒置显微镜检查。整个培养阶段维持细胞培养液的pH值在7.3～7.6之间。8.2.3在空白对照细胞始终正常，阳性对照细胞出现了细胞病变（CPE)的情况下，当接种了被检上清2
SN/T4289—2015
稀释液的细胞出现CPE时，应立即进行病毒鉴定。如果没有CPE出现，则还要盲传一次，然后进行鉴定。
4盲传时，将接种了组织匀浆上清稀释液的细胞单层培养物冻融一次，以8000g，4℃离心8.2.4
20min，收集上清液。将上清液接种到新鲜细胞单层，继续置于25℃～30℃培养7d。每天用40倍～100倍倒置显微镜检查。如果样品经过接种细胞和盲传后均没有CPE出现，则结果判断为阴性。如果阳性对照也未出现CPE，则实验失败。应换用敏感细胞和一批新的组织样品重新进行病毒分离。
9病毒的鉴定
9.1中和试验
收集出现CPE的细胞培养液，反复冻融2次后，在4℃下2000g离心15min去除细胞碎片。9.1.1
将含病毒的上清液系列稀释到工每稀释度的病毒液与等体积的抗CCV抗体溶液混合，同时另取这些病毒稀释液于等体积的细胞培养液混合（中和抗体溶液的效价按50%蚀斑减少单位计算不少于2000）。同时，取参考毒株作为阳性对照，取其他病毒株作为阴性对照，按照9.1.3的方法制备混合液。9.1.4
各混合物在25℃下孵育1h
将上述混合物分别接种到生长约24h的CCO单层细胞上（培养于96孔板中），每稀释度接2孔，每孔50μL，于25℃下吸附0.5h~1h。吸附后每孔加人含有10%FCS的pH7.3~7.6的细胞培养液、于25℃～30℃下培养。9.1.7
检查CPE发生情况，计算并比较非中和对照组和中和试验组的TCIDso值。若病毒悬液被抗CCV特异性抗体处理后，CPE被抑制或被显著推迟，而未被处理的细胞培养液中CPE明显，导致二者病毒滴度相差2个以上，则待测的病毒为CCV中和抗体阳性。9.2
ELISA检测
用pH9.6的包埋液（参见B.2）适量稀释纯化的羊抗COVIgG，包被ELISA板，每孔100μL。9.2.1
4℃孵育过夜。
用含0.05%吐温-20的0.01
mol/LPBS(PBST，参见B.3和B.4）洗3次。℃反应1h，PBST洗3次。
用1%明胶（溶于PBST中）封闭，每孔200μL。9.2.3
加人待测的样品、CCV参考毒株（阳性对照）、未接种CCV的CCO悬液（阴性对照）和PBS（空白对照），每组设2个平行对照孔，每孔100μL,37℃反应1h。PBST洗3次。9.2.5加鼠抗CCV单克隆抗体到小孔中，每孔100μL，37℃反应1h。PBST洗3次。9.2.6加人0.1%H，Oz（用蒸馏水稀释）去除非特异性过氧化物酶。每孔150μL，37℃反应15min，PBST洗2次。
加人标记辣根过氧化物酶的抗鼠IgG（酶标二抗），每孔100μL，37℃反应1h。PBST洗3次。9.2.7
9.2.8加人底物（用底物缓冲液配制的TMB和过氧化氢，参见B.5B.7)。当阳性对照出现明显蓝色，阴性对照无色时加人终止液（参见B.8），在450nm波长下读取结果。如果用其他底物（如底物缓冲液配制的OPD和过氧化氢）则需改用相应光波长（如490nm）测量。9.2.9结果判定。以空白对照的光密度值（即OD值)为零，测量各孔的光吸收值。先计算阳性对照和阴性对照的OD值之比（即P/N值）。如果P/N≥2.1，表明对照成立。再计算待测样品孔和阴性对照孔的P/N值之比。当P/N≥2.1时判为CCVELISA阳性。3
SN/T4289—2015
9.3PCR检测
DNA提取
10min。
将490μL细胞悬液放人1.5mL的离心管，反复冻融2次。加人10μL蛋白酶K缓冲液（参见B.9),56℃孵育1h。加人500μLTris饱和酚和500μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），振荡混匀。12000r/min离心吸取上层水相，加人新的1.5mL的离心管中。注意不要吸到中间层和下层，以免混人蛋白质。9.3.1.4
水相中加人不少于1.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀后一20℃放置过夜12000r/min离心10min。
弃上清液，沉淀在室温下晾至半干，50uL水溶解，一20℃保存备用。注：也可以采用同等效力的其他DNA抽提方法，或相应的试剂盒来抽提病毒DNA。9.3.2PCR扩增DNA
应在单独的工作区进行PCR加样工作。最多每10个样品需要准备1个阴性对照和1个阳性对照。
反应体系：10×缓冲液10μL、25mmol/L的MgSO，10μL、dNTPs（每种浓度均为2.5mmol/L）4μL、每种引物（50pmol/μL）各0.8μL、Taq酶（5U/μL)0.6μL，内控DNA0.6μL模板6μL，加水到总体积为100μL。如果PCR没有热盖，每管还需加人50μL矿物油，否则可以不加。短时间低速离心让试剂集中在底部。再将反应管置于PCR扩增仪反应条件：先93℃4min，再93℃30s-60℃30s72℃30s，30次循环，然后72℃10min，最后4℃保温。
9.3.3琼脂糖电泳
用TBE电泳缓冲液（参见B.10)配制3%的琼脂糖（含0.5μg/mLEB，参见B.11)平板。将8μL样品和2μL样品缓冲液（参见B.12）混匀后加人样品孔。在电泳时设立DNA分子量标准物作对照。100mA恒流电泳，溴酚蓝到达凝胶底部停止电泳。在紫外灯下或者凝胶成像仪中观察核酸带并判断结果。
9.3.4设立对照
在9.3.1样品处理过程中，每10份样品设立1组阳性对照、阴性对照和空白对照。9.3.4.1
取含有已知CCV参考株的细胞悬液作为阳性对照。取未接毒的细胞悬液作为阴性对照。9.3.4.3
9.3.4.4取等体积的水代替模板作为空白对照。9.3.5PCR检测结果判定
内控DNA会扩增出186bp的DNA片段，CCV病毒DNA会扩增出136bp的DNA片段。PCR后，阴性对照和空白对照会出现186bp的DNA片段，阳性对照会出现186bp和136bp2条DNA片段。如果对照中CCV浓度较高，186bp的DNA片段有可能很弱或消失。待测样品PCR扩增后能在相应136bpDNA位置上有带，可判为PCR阳性。无该条带或带的大小不是136bp判为PCR阴性。如果待测样品产生的DNA带大小异常或无法准确判断大小，需要将片段进行基因测序，并与已知标准基因序列比较（参见附录C)。4
综合判定
SN/T4289—2015
对有临床症状的鱼：细胞分离病毒产生CPE后，用中和试验、PCR、ELISA任何一项结果为阳性，即可确诊为患有斑点叉尾鲷病毒病。5
SN/T4289—2015
A.1病原
附录A
（资料性附录）
斑点叉尾病毒病概述
病原为斑点叉尾鲫病毒（CCV）。病毒为20面体双链DNA病毒，有囊膜。病毒粒子直径175nm~200nm。病毒只一种血清型，但采用单克隆抗体发现不同株间有不同抗原决定簇，并存在毒力的差异和基因序列的差异。CCV仅能在BB,CCO.KIK细胞株上复制生长，最适温度为25℃～30℃。症状与流行
该病在夏季水温25℃以上时会发病，流行适温为28℃～30℃。发病的临床症状包括：摄食活动减弱，式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉入水底衰竭而亡。病鱼皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色；鳃丝苍白或出血，眼球突出组织病理变化主要表现为：肾脏、肝脏肿大，脾脏充血，胃肠道水肿；造血组织和胃肠道内出现巨噬细胞聚集区；有些肠壁的黏膜、黏膜下层发生坏死、脱落；有些鱼的肠黏膜下层及绒毛严重出血，甚至血漏人肠腔；骨骼肌出血，胰脏坏死，神经细胞核出现空泡，周围神经纤维肿大。该病20世纪60年代在美国最先发现其流行，洪都拉斯和俄罗斯也有报道。目前主要在北美地区流行。近几年报道的自然暴发仅仅限于斑点叉尾的鱼苗和鱼种。也有研究结果证明，CCV还能感染南方大口站和加州鲈，并能造成感染鱼的迅速死亡。A.3预防与控制
CCVD目前没有有效的药物治疗
有报道使用经胡鲶（walkingcatfish）的KLK细胞株继和疫苗。
代的弱毒疫苗可保护小鲶鱼对抗野外型产毒株的致命攻击，麟酰乙酸（phosphonoaceticacid，PAA）也可抑制组织培养中的CCV，但尚未有大规模投入使用的报告A.4诊断
在水温25℃～35℃，特别是在28℃～30℃时，斑点叉尾鲷鱼苗大量死亡，出现鳍条基部出血、鳃丝苍白、脾肾肝等组织肿大坏死等临床症状，可以初步诊断是CCVD，需要进一步确诊。使用brownbullhead(BB)或channelcatfishovary(CCO)细胞株分离CCV，待产生CPE后，采用中和试验、ELISA技术和PCR方法确诊病毒。在OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中规定，这些检测方法只能用于有临床症状的鱼的检测。没有临床症状的鱼，不能用细胞分离和抗原检测的方法检测，可以用PCR方法检测。若仅仅PCR阳性，只能判定为可疑，6
B.1细胞培养液
附录B
（资料性附录）
试剂配制
SN/T4289—2015
按M199培养基（含Earles盐）说明书的要求，用一级水配制，然后加人10%经56℃30min灭活的胎牛血清，用NaHCO粉末调节培养液的pH至7.2～7.4。过滤除菌，分装后一20℃保存。在开放系统使用时，需要加人过滤除菌的HEPES，使其在培养液中的终浓度为0.02mol/L
包埋稀释液（pH9.6）
0.01mol/LPBS(pH7.2~7
NazHPO
NaH,PO
充分搅拌溶解后，4℃保存
1000mL
1000ml
洗涤液PBST(0.01mol/LpH=7
4磷酸盐缓冲液，含0.05%的吐温-20）NaCl
NazHPO,·12H20
吐温-20
1000mL
充分搅拌溶解后，4℃保存（可以配制10倍浓缩液存储）。TMB储存液
TMB（TMB硫酸盐）
DMF（N，N-dimethylformamide,5mL/瓶)4℃保存。
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