SN/T4289—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 斑点叉尾病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for channel catfish virus disease 2015-09-02发布，2016-04-01实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。SN/T4289—2015本标准修改采用了OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）中2.1.6：斑点叉尾鲷病毒病。本标准与OIE《水生动物疾病诊断手册》（2006版）2.1.6相比，主要差别如下： -将ELISA流程中的封闭液由脱脂奶粉改为1%明胶； -去除了在ELISA待检样品中加入Triton X-100的步骤，增加了H2O2去除非特异性过氧化物酶的步骤； -修改了ELISA检测流程中PBST的洗涤次数； -增加了酚氯仿法抽提病毒核酸的内容； -将内控DNA的长度改为186bp。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国北京出入境检验检疫局。本标准主要起草人：张晏、王娜、张利峰、景宏丽、吴绍强、邓俊花。 1 范围 本标准规定了斑点叉尾病毒病临床症状、病原分离、中和试验、酶联免疫吸附试验和聚合酶链式反应的检测方法。本标准适用于斑点叉尾病毒病的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 概述 斑点叉尾鲷病毒病（channel catfish virus disease, CCVD）是由斑点叉尾病毒（channel catfish virus, CCV）感染斑点叉尾等温水鱼而引起的病毒性疾病，发病死亡率可达100%。该病曾被世界动物卫生组织（OIE）列入水生动物疫病名录，我国农业部和国家质量监督检验检疫总局将该病列入《中华人民共和国进境动物检疫疫病名录》二类传染病（参见附录A）。 4 设备和器材 4.1 倒置显微镜 4.2 生化培养箱 4.3 普通冰箱和低温冰箱 4.4 离心机和离心管 4.5 超净工作台 4.6 PCR仪 4.7 电泳仪 4.8 凝胶成像仪 4.9 酶标仪 5 试剂和材料 5.1 水：应符合GB/T 6682中一级水的规格。 5.2 CCV病毒参考株（阳性对照）：由国家指定机构提供。 5.3 羊抗CCV的IgG：由国家指定机构提供。 5.4 鼠抗CCV的单克隆抗体：由国家指定机构提供。 5.5 内控DNA：是一段长186bp的人工合成DNA片段，其两端的序列和CCV的引物序列互补。由检测实验室合成，或购买商品化试剂。 5.6 斑点叉尾鲷卵巢细胞（CCO)。 5.7 Taq酶：5U/μL，-20℃保存，不要反复冻融或温度剧烈变化。 5.8 dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各2.5mmol/L，-20℃保存。 5.9 引物：引物浓度为50pmol/μL。引物序列为：F: 5'-TCATCCGAATCCGACAACTGA-3'；R: 5'-CCAAGATCGCGGAGAAAC-3'，用于扩增CCV蛋白激酶基因序列中136bp片段。 5.10 无水乙醇：分析纯，使用前预冷到-20℃。 5.11 琼脂糖：电泳纯。 5.12 封闭液：1%明胶。 6 临床症状 病鱼摄食活动减弱，呈螺旋式旋转游动，头上尾下悬挂于养殖池边缘，最后沉入水底衰竭而亡。病鱼皮肤及鳍条基部出血，腹部膨大，腹水增多，呈现淡黄色。鳃丝苍白或出血，眼球突出。肾苍白肿大，肌肉、肝、肾及脾出血，肝、肾及脾肿大，胃内充满黏液样分泌物，腹膜水肿，腹腔内充满黄色渗出物。 7 采样 7.1 采样要求 采样时水温应在20℃以上，挑选有典型临床症状的病鱼或者死鱼进行检测。 7.2 采样部位 送到实验室的应是活鱼。≤3cm的鱼苗，取整条鱼；体长3cm~6cm的鱼苗取内脏（包括肾）；体长大于6cm的鱼则取肾和脾。 8 病毒的分离 8.1 样品处理 先用组织研磨器将样品匀浆成糊状，按1:10的最终稀释度重悬于含有1000IU/mL青霉素和1000μg/mL链霉素的培养液（参见附录B中B.1）中。25℃下孵育2h~4h，或4℃下孵育过夜，以释放病毒。8000g离心20min，收集上清液。 8.2 病毒接种与观察 8.2.1 对1:10的组织匀浆上清液再作两次10倍稀释，然后将1:10、1:100和1:1000三个稀释度的上清液分别接种到生长...