SN/T4292—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 家蚕微粒子病检疫技术规范 发布日期：2015-09-02 实施日期：2016-04-01 前言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T4292—2015。 本标准主要起草单位：中华人民共和国浙江出入境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：何永强、吴姗、曹琛福、鲁兴萌、黎昊雁、帅江冰、张晓峰、朱振江、戴云通、王素华、李晓军。 1 范围 本标准规定了家蚕微孢子虫的实验室检测，包括光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应（PCR）法和实时荧光PCR法。本标准适用于进出境家蚕微粒子病的检疫。 2 规范性引用文件 凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文。下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 家蚕 silkworm (Bombyx mori) 家蚕为完全变态昆虫，具有卵、幼虫、蛹和蛾（成虫）四个虫态。 3.2 蚕卵（蚕种） silkworm egg 蚕卵外观略呈扁平椭圆形，一方为背侧。端稍尖为前端，另一端稍钝为后端，膨起的一方为腹侧。与腹侧相对的蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵。 3.3 蚕幼虫 silkworm larva (larvae) 从卵孵化后的蚁蚕到化蛹期间的蚕，蚕幼虫呈长圆筒形，背方为圆形，分头部、胸部和腹部3个明显的体段。 3.4 蚕茧 silkworm cocoon 蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状，外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧（dried cocoon）和鲜（fresh cocoon）。前者是经过60℃～120℃干燥处理6h，充分干燥的蚕茧，后者是未经高温干燥处理的活蛹蚕茧。 3.5 蚕蛾 silkworm moth 分头胸腹3个体段，中后胸各有一对翅，全身被白色鳞片。 3.6 蚕微孢子虫 nosema bombycis; Nb 属原生动物界微孢子虫门，微孢子虫目，微孢子虫属，呈椭圆形，大小约为（3μm~4μm）×（1.5μm~2μm），是蚕微粒子病的病原体。 3.7 产附 aspect of laying eggs 家蚕母蛾将蚕卵产于蚕连纸或夏布上的附着情况。 4 临床病症 4.1 蚕幼虫的病症 体色不正常，呈锈色，大小不均匀，发育迟缓，举动不活泼。小蚕期表现为收蚁后不疏毛，体色深暗，体躯瘦小，易发生“细蚕”；蚕儿稍大后出现焦尾蚕、焦足蚕和半脱皮蚕、不脱皮蚕，蚕体小，皮肤多皱褶。 4.2 蛹体病症 出现大肚蛹，腹部环节松弛，环节上有大小不等的病斑，体表无光泽，反应迟钝。 4.3 蛾体病症 出现卷翅蛾，羽化后长期不展翅，或展翅不全；蛾体腹部有大小不等黑斑的黑星蛾；蛾体鳞毛脱落呈焦黄色的秃蛾；蛾体腹部节间伸长松弛的大肚蛾，翅短小，病蛾交配能力差，产卵少，产附不整齐。 4.4 蚕卵病症 卵形不正，大小不均匀，排列不整齐，产重叠卵，易脱落，不受精卵、死卵多。 5 实验室诊断 5.1 光学相差显微镜检查法 5.1.1 材料和设备 5.1.1.1 盖玻片 5.1.1.2 拭子 5.1.1.3 剪刀 5.1.1.4 镊子 5.1.1.5 PRO250捣碎机或其他等效设备 5.1.1.6 纱网：50目～100目 5.1.1.7 离心管（1.5mL、5mL、15mL） 5.1.1.8 光学相差显微镜（600倍或400倍） 5.1.2 样品待检液制备 采取家蚕的卵（或幼虫、蛹、母蛾等）样品，按照1:10加人生理盐水，用PRO250等捣碎机充分捣碎（经过干燥处理或放置时间较久的样本，则需浸泡12h后再捣碎；鲜活5龄幼虫需解剖取中肠，用中肠捣碎），匀浆液用纱网（规格50目～100目）过滤，收集滤液。滤液差速离心（500r/min，离心1min，弃沉淀，然后上清液以5000r/min，10min离心，弃上清液）2次～3次。用适量（约样本质量体积比的1倍～10倍）生理盐水悬浮，作为微孢子虫待检液，立刻使用或于-20℃冰箱保存。 5.1.3 操作步骤 从5.1.2制备的每个离心管中取出2个待检液样本50μL，滴于载玻片，盖上盖玻片，用40×或10倍光学相差显微镜进行对检，先看中间，边调节微调旋钮，边慢...