SN/T 4292-2015
基本信息
标准号： SN/T 4292-2015
中文名称：家蚕微粒子病检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
下载格式：.zip .pdf
下载大小：9699598
标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4292-2015.Quarantine protocol for pebrine.
1范围
SN/T 4292规定了家蚕微孢子虫的实验室检测,包括光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应(PCR)法和实时荧光PCR法。
SN/T 4292适用于进出境家蚕微粒子病的检疫
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1家蚕silkworm( Bombyx mori)
家蚕为完全变态昆虫,具有卵、幼虫、茧和蛾(成虫)四个虫态。
3.2蚕卵(蚕种)silkworn egg
蚕卵外观略呈扁平椭圆形，一端稍尖为前端，另-端稍钝为后端,膨起的一方为腹侧，与腹侧相对的一方为背侧。
蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵。
3.3蚕幼虫silkworm larva(larvae)
从卵孵化后的蚁蚕到化蛹期间的蚕，蚕幼虫呈长園简形,背方为圆形,分头部、胸部和腹部3个明显的体段。
3.4蚕茧silkworm cocoon
蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状,外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧(dried cocoon)和鲜茧(fresh cocoon)。前者是经过60 °C~120 °C干燥处理6 h,充分干燥的蚕茧,后者是未经高温干燥处理的活蛹蚕茧。
3.5蚕蛾silkworm moth
分头胸腹3个体段,中后胸各有一对翅,全身被白色鳞片。
1范围
SN/T 4292规定了家蚕微孢子虫的实验室检测,包括光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应(PCR)法和实时荧光PCR法。
SN/T 4292适用于进出境家蚕微粒子病的检疫
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1家蚕silkworm( Bombyx mori)
家蚕为完全变态昆虫,具有卵、幼虫、茧和蛾(成虫)四个虫态。
3.2蚕卵(蚕种)silkworn egg
蚕卵外观略呈扁平椭圆形，一端稍尖为前端，另-端稍钝为后端,膨起的一方为腹侧，与腹侧相对的一方为背侧。
蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵。
3.3蚕幼虫silkworm larva(larvae)
从卵孵化后的蚁蚕到化蛹期间的蚕，蚕幼虫呈长園简形,背方为圆形,分头部、胸部和腹部3个明显的体段。
3.4蚕茧silkworm cocoon
蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状,外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧(dried cocoon)和鲜茧(fresh cocoon)。前者是经过60 °C~120 °C干燥处理6 h,充分干燥的蚕茧,后者是未经高温干燥处理的活蛹蚕茧。
3.5蚕蛾silkworm moth
分头胸腹3个体段,中后胸各有一对翅,全身被白色鳞片。
标准图片预览
标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4292—2015
家蚕微粒子病检疫技术规范
Quarantineprotocolforpebrine2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T4292—2015
本标准主要起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局，
本标准主要起草人：何永强、吴姗、曹琛福、鲁兴萌、黎昊雁、帅江冰、张晓峰、朱振江、戴云通、王素华李晓军。
1范围
家蚕微粒子病检疫技术规范
SN/T4292—2015
本标准规定了家蚕微孢子虫的实验室检测，包括光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应（PCR)法和实时荧光PCR法。
本标准适用于进出境家蚕微粒子病的检疫2规范性引用文件
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
家蚕silkworm（Bombyxmori）
家蚕为完全变态昆虫，具有卵、幼虫、董和蛾（成虫）四个虫态3.2
蚕卵（蚕种）silkwormegg
蚕卵外观略呈扁平椭圆形，
一方为背侧。
端稍尖为前端，另一端稍钝为后端，膨起的一方为腹侧，与腹侧相对的蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵3.3
蚕幼虫silkwormlarva(larvae）从卵孵化后的蚁蚕到化期间的蚕，蚕幼虫呈长圆筒形，背方为圆形，分头部、胸部和腹部3个明显的体段。
蚕茧silkwormcocoon
蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状，外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧（driedcocoon）和鲜（freshcocoon）。前者是经过60℃～120℃干燥处理6h，充分干燥的蚕茧，后者是未经高温干燥处理的活蛹蚕茧。3.5
蚕蛾silkwormmoth
分头胸腹3个体段，中后胸各有一对翅，全身被白色鳞片。3.6
蚕微孢子虫
nosemabombycis;Nb
属原生动物界微孢子虫门，微孢子虫目，微孢子虫属，呈椭圆形，大小约为（3μm4μm）×（1.5μm~SN/T4292—2015
2μm），是蚕微粒子病的病原体。3.7
产附 aspectof laideggs
家蚕母蛾将蚕卵产于蚕连纸或夏布上的附着情况。4
临床病症
4.1蚕幼虫的病症
体色不正常，呈锈色，大小不均匀，发育迟缓，举动不活泼。小蚕期表现为收蚁后不疏毛，体色深暗，体躯瘦小，易发生“细蚕”，蚕儿稍大后出现焦尾蚕、焦足蚕和半脱皮蚕、不脱皮蚕，蚕体小，皮肤多皱褶。4.2蛹体病症
出现大肚蛹，腹部环节松弛，环节上有大小不等的病斑，体表无光泽，反应迟钝，4.3
3蛾体病症
出现卷翅蛾，羽化后长期不展翅，或展翅不全；蛾体腹部有大小不等黑斑的黑星蛾；蛾体鳞毛脱落呈焦黄色的秃蛾；蛾体腹部节间伸长松弛的大肚蛾，翅短小，病蛾交配能力差，产卵少，产附不整齐。4.4蚕卵病症
卵形不正，大小不均匀，排列不整齐，产重叠卵，易脱落，不受精卵、死卵多。实验室诊断
光学相差显微镜检查法
5.1.1材料和设备
盖玻片。
拭子。
剪刀。
镊子。
PRO250捣碎机或其他等效设备。纱网：50目～100目。
离心管（1.5mL、5mL、15mL）。光学相差显微镜（600倍或400倍）。5.1.2样品待检液制备
采取家蚕的卵（或幼虫、董、母蛾等）样品，按照1：10加人生理盐水，用PRO250等捣碎机充分捣碎（经过干燥处理或放置时间较久的样本，则需浸泡12h后再捣碎；鲜活5龄幼虫需解剖取中肠，用中肠捣碎），匀浆液用纱网（规格50目～100目）过滤，收集滤液。滤液差速离心（500r/min，离心1min，弃沉淀，然后上清液以5000r/min，10min离心，弃上清液）2次～3次。用适量（约样本质量体积比的1倍～10倍)生理盐水悬浮，作为微孢子虫待检液，立刻使用或一20℃冰箱保存。2
5.1.3操作步骤
SN/T4292—2015
从5.1.2制备的每个离心管中取出2个待检液样本50μL，滴于载玻片，盖上盖玻片，用40×15（或10)倍光学相差显微镜2人对检，先看中间，边调节微调旋钮，边慢慢移向四周，保证每个标本不少于20个视野。
5.1.4结果判定
光学相差显微镜检出家蚕微抱子虫者（参见附录A）为阳性，未检出家蚕微抱子虫者为阴性。5.2聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光PCR方法5.2.1试剂与材料
试剂与材料包括：蛋白酶K、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、2mg/LRNAaseA、TaqDNA聚合酶
其他所用试剂见附录B。试验所用试剂为分析纯，水应符合GB/T6682一级水要求。5.2.2设备
高速台式冷冻离心机。最大离心力12000g以上。4℃～8℃冰箱和-20℃冰箱。
微量加样器。量程包括：0.5μ~10μ，5μ～20μ，20μ~200μ，200μ~1000μ。PCR扩增仪。
5.2.2.5日
电泳仪。
凝胶成像系统。免费标准下载网bzxz
实时荧光定量PCR仪。
Precellys24(BertinTechnologies）多功能样本研磨均质器或其他等效均质器。5.2.2.9水浴锅。
直径425μm~600μm的玻璃珠和陶瓷珠。5.2.3
样本核酸释放
物理破碎法
取上述0.5mL待检液（5.1.2）于破碎离心管中，加0.5mL核酸提取液、0.6g混合珠（玻璃珠：陶瓷珠=3：1)和0.1mL10%SDS，于Precellys24（BertinTechnologies）或其他等效多功能样本研磨均质器5500r/min破碎20s，破碎6次后，再加5μL蛋白酶K（终浓度为1mg/mL），55℃水浴2h，留珠取液。
5.2.3.2发芽法
取上述0.5mL待检液（5.1.2），加人0.2mol/LKOH0.5mL，充分混合，27℃诱导1h后5000r/min，离心5min，去上清液。用0.5mL生理盐水重悬，25℃放置30min。5.2.4样本核酸的抽提
5.2.4.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为被检样品数、一份阴性、一份阳性对照数量之和，对每管进行编号。
5.2.4.2每管中加人5.2.3.1或5.2.3.2处理后的样品、阴性对照和阳性对照各500uL，再加入等体积的3
SN/T4292—2015
饱和酚.颠倒充分混匀5min，4℃条件下12000r/min离心10min。5.2.4.3取水相至新的1.5mL离心管内，加等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），颠倒充分混匀5min，4℃条件下12000r/min离心10min。5.2.4.4取水相至新的1.5mL离心管内，加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1)，颠倒充分混匀5min，4℃条件下12000r/min离心10min。5.2.4.5取水相至新的1.5mL离心管内，加2.5倍体积的预冷（一20℃）的无水乙醇，0.1倍体积3mol/L的乙酸钠（pH5.2），一20℃沉淀30min，12000r/min离心10min，去上清液。沉淀用75%的乙醇漂洗，6000r/min离心3min，重复洗涤一次，吸干上清液，自然风干，溶于5.2.4.6
100μLTE，加人2μLRNAaseA，37℃保温30min，可用于PCR检测。提取的微孢子虫DNA短时间用可在4℃保存，长时间备用
PCR检测
PCR反应体系和反应参类
也可采用其他等效方法进行DNA抽提，PCR反应的引物、反应体系见表1和表2，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同反应体积进行相应调整。按以下条件进行扣编：94℃预变
72℃延伸10min。每个反应体系应设置两5min；94℃30s，42℃60s72℃45s，40个循环；平行反应。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测表1PCR检测所需引物
PCR类型
普通PCR
引物序列（5°-3）
F1:CTGTCAT
TTGTAAI
TATTCTTTGT
PCR预混液
dNTP(2.5pmol/μL)
25pmol/μL)
引物1(10pmol/
引物2（10pmol/μL）
Taq酶（5U/μL)
DNA模板（1ng~10ng）
CR反应体系
25μL反应体系加样体积/μL
注1：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整扩增片段长度/bp
50μL反应体系加样体积/μL
注2：PCR反应体系缓冲液可以根据所选Taq酶的不同而选择配套的缓冲液，其反应体系可以参照试剂说明书。PCR结果判定
对样品DNA提取液进行PCR检测，只有当阴性对照未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小扩增条带时，试验才成立。如果测试样品出现预期大小扩增条带，并且对样品的PCR产物进行测序分析，4
SN/T4292—2015
证实与蚕微孢子虫的核酸序列（参见附录C)一致，则判定样品为阳性，否则判定为阴性；如果测试样品中未出现预期的扩增条带，则判定测试样品为阴性。5.2.6实时荧光PCR检测
5.2.6.1实时荧光PCR反应体系和反应参数实时荧光PCR引物、探针见表3，反应体系见表4，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同反应体积进行相应调整。实时荧光PCR反应程序可根据具体的荧光PCR检测仪型号来设定，以ABI仪器为例，按以下条件进行扩增：93℃2min；93℃30s，55℃45s，40个循环，在每个循环的退火阶段收集荧光；以LightCycler仪器为例，按以下条件进行扩增：95℃10s；95℃5s，60℃23s，40个循环，在每个循环的退火阶段收集荧光。每个反应体系应设置两个行反应。
表3实时荧光PCR检测所需引物和探针序列PCR类型
实时荧光PCR
引物序列（5
F2:AGTGCCATCGTTGCTGGTT
R2:TGGGC
CTTTCTTCTT
探针的5'端用FAM标记，3端用TAMRA标记探针序列
(5°-3\)
AACCGCTAAGGAAAC
CCGCAAGGA
表4实时荧光PCR反应体系
荧光PCR预混液
ROX染料Ⅱ
（10pmel/μL）
2(10pmol/μL)
DNA模板（Ing~10ng）
扩增片段长度/bp
20μL反应体系加样体积/μL
25μL反应体系加样体积/μL
注1：实时荧光PCR体系缓冲液建议使用市售专用试剂
注2：若采用ABI的仪器则要在体系中添加ROX染料IⅡ，若使用LightCycler仪器，则不需要添加，该部分体积加ddHzO替代。
目标基因检测到的Ct值在20～30之间是较适合DNA模板量。注3：DNA模板的加人量可适当调整。注4：上述反应体系和扩增程序可根据不同仪器的要求进行适当调整，5.2.6.2
实时荧光PCR质控标准
阴性对照：无荧光增幅现象。
阳性对照：呈现出典型的阳性扩增曲线，且Ct值小于或等于35。上述指标有一项不符合，应重做实时荧光PCR扩增实验。SN/T4292—2015
实时荧光PCR结果判定
在阳性对照和阴性对照结果正常的情况下，测试样品出现标准扩增曲线，且Ct值小于或等于35，可初步判断为阳性；测试样品Ct值在35～40之间，建议重检，复检后若样品的Ct值仍小于40，并出现扩增曲线，则可初步判断为阳性；若Ct值大于或等于40，则判断为阴性。初步判断为阳性者，则需要进行普通PCR试验并进行测序确认，或者用显微镜检查法确认，6
A.1家蚕微粒子病简介
附录A
（资料性附录）
家蚕微粒子病概述
SN/T4292-—2015
家蚕微粒子病（pebrine）是由家蚕微孢子虫（Nosemabombycis，简称Nb）引起的能致蚕业生产毁灭性破坏的传染病。据记载，该病最早于19世纪中叶发生于法国，法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业的毁灭。在亚洲的日本、印度以及我国等均广泛流行，危害大，难以防治家蚕微孢子虫属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫目、微孢子虫属，呈椭圆形，大小约为（3um～4μm）×（1.5μm2μm）。蚕微孢子虫可全身性感染蚕，在蚕（幼虫）、蛹、蛾体内寄生，能经蚕卵胚胎传染和食下传染。病原广泛存在于病蚕、病蛹、病蛾、蚕粪、蚕尿、肠液、蚕皮、蛹皮、鳞毛以及脱落物卵壳中。
家蚕微孢子虫检测技术简介
家蚕微孢子虫检测技术经历了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测和分子生物学检测方法的研究。自1870年Pasteur创立母峨袋检法以来，母峨微孢子虫的光学显微镜检验方法一直应用至今。本规范引入了聚合酶链式反应（PCR)和实时荧光PCR方法，PCR法是以小亚单位核糖体RNA特定基因为靶标进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。实时荧光PCR法通过检测扩增曲线，以确定样品中是否含有家蚕微孢子虫核酸。
家蚕微孢子虫光学显微镜检图片A.3
家蚕微抱子虫光学显微镜检图片见图A.1。Nb：（2.9μm~4.1μm）×（1.7μm~2.1μm）；400倍~600倍放大。图A.1家蚕微孢子虫光学显微镜检图片7
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家蚕微粒子病检疫技术规范
Quarantineprotocolforpebrine2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口SN/T4292—2015
本标准主要起草单位：中华人民共和国浙江出人境检验检疫局、浙江大学、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局，
本标准主要起草人：何永强、吴姗、曹琛福、鲁兴萌、黎昊雁、帅江冰、张晓峰、朱振江、戴云通、王素华李晓军。
1范围
家蚕微粒子病检疫技术规范
SN/T4292—2015
本标准规定了家蚕微孢子虫的实验室检测，包括光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应（PCR)法和实时荧光PCR法。
本标准适用于进出境家蚕微粒子病的检疫2规范性引用文件
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文下列文件对于本文件的应用是必不可少的。件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
家蚕silkworm（Bombyxmori）
家蚕为完全变态昆虫，具有卵、幼虫、董和蛾（成虫）四个虫态3.2
蚕卵（蚕种）silkwormegg
蚕卵外观略呈扁平椭圆形，
一方为背侧。
端稍尖为前端，另一端稍钝为后端，膨起的一方为腹侧，与腹侧相对的蚕种是指用于养蚕生产和商业的蚕卵3.3
蚕幼虫silkwormlarva(larvae）从卵孵化后的蚁蚕到化期间的蚕，蚕幼虫呈长圆筒形，背方为圆形，分头部、胸部和腹部3个明显的体段。
蚕茧silkwormcocoon
蚕从吐丝器吐出丝物质后形成的，呈椭圆形和球形等形状，外为丝物质内存蚕蛹的蚕阶段。蚕茧分为干茧（driedcocoon）和鲜（freshcocoon）。前者是经过60℃～120℃干燥处理6h，充分干燥的蚕茧，后者是未经高温干燥处理的活蛹蚕茧。3.5
蚕蛾silkwormmoth
分头胸腹3个体段，中后胸各有一对翅，全身被白色鳞片。3.6
蚕微孢子虫
nosemabombycis;Nb
属原生动物界微孢子虫门，微孢子虫目，微孢子虫属，呈椭圆形，大小约为（3μm4μm）×（1.5μm~SN/T4292—2015
2μm），是蚕微粒子病的病原体。3.7
产附 aspectof laideggs
家蚕母蛾将蚕卵产于蚕连纸或夏布上的附着情况。4
临床病症
4.1蚕幼虫的病症
体色不正常，呈锈色，大小不均匀，发育迟缓，举动不活泼。小蚕期表现为收蚁后不疏毛，体色深暗，体躯瘦小，易发生“细蚕”，蚕儿稍大后出现焦尾蚕、焦足蚕和半脱皮蚕、不脱皮蚕，蚕体小，皮肤多皱褶。4.2蛹体病症
出现大肚蛹，腹部环节松弛，环节上有大小不等的病斑，体表无光泽，反应迟钝，4.3
3蛾体病症
出现卷翅蛾，羽化后长期不展翅，或展翅不全；蛾体腹部有大小不等黑斑的黑星蛾；蛾体鳞毛脱落呈焦黄色的秃蛾；蛾体腹部节间伸长松弛的大肚蛾，翅短小，病蛾交配能力差，产卵少，产附不整齐。4.4蚕卵病症
卵形不正，大小不均匀，排列不整齐，产重叠卵，易脱落，不受精卵、死卵多。实验室诊断
光学相差显微镜检查法
5.1.1材料和设备
盖玻片。
拭子。
剪刀。
镊子。
PRO250捣碎机或其他等效设备。纱网：50目～100目。
离心管（1.5mL、5mL、15mL）。光学相差显微镜（600倍或400倍）。5.1.2样品待检液制备
采取家蚕的卵（或幼虫、董、母蛾等）样品，按照1：10加人生理盐水，用PRO250等捣碎机充分捣碎（经过干燥处理或放置时间较久的样本，则需浸泡12h后再捣碎；鲜活5龄幼虫需解剖取中肠，用中肠捣碎），匀浆液用纱网（规格50目～100目）过滤，收集滤液。滤液差速离心（500r/min，离心1min，弃沉淀，然后上清液以5000r/min，10min离心，弃上清液）2次～3次。用适量（约样本质量体积比的1倍～10倍)生理盐水悬浮，作为微孢子虫待检液，立刻使用或一20℃冰箱保存。2
5.1.3操作步骤
SN/T4292—2015
从5.1.2制备的每个离心管中取出2个待检液样本50μL，滴于载玻片，盖上盖玻片，用40×15（或10)倍光学相差显微镜2人对检，先看中间，边调节微调旋钮，边慢慢移向四周，保证每个标本不少于20个视野。
5.1.4结果判定
光学相差显微镜检出家蚕微抱子虫者（参见附录A）为阳性，未检出家蚕微抱子虫者为阴性。5.2聚合酶链式反应（PCR）和实时荧光PCR方法5.2.1试剂与材料
试剂与材料包括：蛋白酶K、饱和酚、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、75%乙醇、2mg/LRNAaseA、TaqDNA聚合酶
其他所用试剂见附录B。试验所用试剂为分析纯，水应符合GB/T6682一级水要求。5.2.2设备
高速台式冷冻离心机。最大离心力12000g以上。4℃～8℃冰箱和-20℃冰箱。
微量加样器。量程包括：0.5μ~10μ，5μ～20μ，20μ~200μ，200μ~1000μ。PCR扩增仪。
5.2.2.5日
电泳仪。
凝胶成像系统。免费标准下载网bzxz
实时荧光定量PCR仪。
Precellys24(BertinTechnologies）多功能样本研磨均质器或其他等效均质器。5.2.2.9水浴锅。
直径425μm~600μm的玻璃珠和陶瓷珠。5.2.3
样本核酸释放
物理破碎法
取上述0.5mL待检液（5.1.2）于破碎离心管中，加0.5mL核酸提取液、0.6g混合珠（玻璃珠：陶瓷珠=3：1)和0.1mL10%SDS，于Precellys24（BertinTechnologies）或其他等效多功能样本研磨均质器5500r/min破碎20s，破碎6次后，再加5μL蛋白酶K（终浓度为1mg/mL），55℃水浴2h，留珠取液。
5.2.3.2发芽法
取上述0.5mL待检液（5.1.2），加人0.2mol/LKOH0.5mL，充分混合，27℃诱导1h后5000r/min，离心5min，去上清液。用0.5mL生理盐水重悬，25℃放置30min。5.2.4样本核酸的抽提
5.2.4.1取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为被检样品数、一份阴性、一份阳性对照数量之和，对每管进行编号。
5.2.4.2每管中加人5.2.3.1或5.2.3.2处理后的样品、阴性对照和阳性对照各500uL，再加入等体积的3
SN/T4292—2015
饱和酚.颠倒充分混匀5min，4℃条件下12000r/min离心10min。5.2.4.3取水相至新的1.5mL离心管内，加等体积的酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1），颠倒充分混匀5min，4℃条件下12000r/min离心10min。5.2.4.4取水相至新的1.5mL离心管内，加等体积三氯甲烷：异戊醇（24：1)，颠倒充分混匀5min，4℃条件下12000r/min离心10min。5.2.4.5取水相至新的1.5mL离心管内，加2.5倍体积的预冷（一20℃）的无水乙醇，0.1倍体积3mol/L的乙酸钠（pH5.2），一20℃沉淀30min，12000r/min离心10min，去上清液。沉淀用75%的乙醇漂洗，6000r/min离心3min，重复洗涤一次，吸干上清液，自然风干，溶于5.2.4.6
100μLTE，加人2μLRNAaseA，37℃保温30min，可用于PCR检测。提取的微孢子虫DNA短时间用可在4℃保存，长时间备用
PCR检测
PCR反应体系和反应参类
也可采用其他等效方法进行DNA抽提，PCR反应的引物、反应体系见表1和表2，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同反应体积进行相应调整。按以下条件进行扣编：94℃预变
72℃延伸10min。每个反应体系应设置两5min；94℃30s，42℃60s72℃45s，40个循环；平行反应。PCR反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测表1PCR检测所需引物
PCR类型
普通PCR
引物序列（5°-3）
F1:CTGTCAT
TTGTAAI
TATTCTTTGT
PCR预混液
dNTP(2.5pmol/μL)
25pmol/μL)
引物1(10pmol/
引物2（10pmol/μL）
Taq酶（5U/μL)
DNA模板（1ng~10ng）
CR反应体系
25μL反应体系加样体积/μL
注1：反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整扩增片段长度/bp
50μL反应体系加样体积/μL
注2：PCR反应体系缓冲液可以根据所选Taq酶的不同而选择配套的缓冲液，其反应体系可以参照试剂说明书。PCR结果判定
对样品DNA提取液进行PCR检测，只有当阴性对照未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小扩增条带时，试验才成立。如果测试样品出现预期大小扩增条带，并且对样品的PCR产物进行测序分析，4
SN/T4292—2015
证实与蚕微孢子虫的核酸序列（参见附录C)一致，则判定样品为阳性，否则判定为阴性；如果测试样品中未出现预期的扩增条带，则判定测试样品为阴性。5.2.6实时荧光PCR检测
5.2.6.1实时荧光PCR反应体系和反应参数实时荧光PCR引物、探针见表3，反应体系见表4，反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同反应体积进行相应调整。实时荧光PCR反应程序可根据具体的荧光PCR检测仪型号来设定，以ABI仪器为例，按以下条件进行扩增：93℃2min；93℃30s，55℃45s，40个循环，在每个循环的退火阶段收集荧光；以LightCycler仪器为例，按以下条件进行扩增：95℃10s；95℃5s，60℃23s，40个循环，在每个循环的退火阶段收集荧光。每个反应体系应设置两个行反应。
表3实时荧光PCR检测所需引物和探针序列PCR类型
实时荧光PCR
引物序列（5
F2:AGTGCCATCGTTGCTGGTT
R2:TGGGC
CTTTCTTCTT
探针的5'端用FAM标记，3端用TAMRA标记探针序列
(5°-3\)
AACCGCTAAGGAAAC
CCGCAAGGA
表4实时荧光PCR反应体系
荧光PCR预混液
ROX染料Ⅱ
（10pmel/μL）
2(10pmol/μL)
DNA模板（Ing~10ng）
扩增片段长度/bp
20μL反应体系加样体积/μL
25μL反应体系加样体积/μL
注1：实时荧光PCR体系缓冲液建议使用市售专用试剂
注2：若采用ABI的仪器则要在体系中添加ROX染料IⅡ，若使用LightCycler仪器，则不需要添加，该部分体积加ddHzO替代。
目标基因检测到的Ct值在20～30之间是较适合DNA模板量。注3：DNA模板的加人量可适当调整。注4：上述反应体系和扩增程序可根据不同仪器的要求进行适当调整，5.2.6.2
实时荧光PCR质控标准
阴性对照：无荧光增幅现象。
阳性对照：呈现出典型的阳性扩增曲线，且Ct值小于或等于35。上述指标有一项不符合，应重做实时荧光PCR扩增实验。SN/T4292—2015
实时荧光PCR结果判定
在阳性对照和阴性对照结果正常的情况下，测试样品出现标准扩增曲线，且Ct值小于或等于35，可初步判断为阳性；测试样品Ct值在35～40之间，建议重检，复检后若样品的Ct值仍小于40，并出现扩增曲线，则可初步判断为阳性；若Ct值大于或等于40，则判断为阴性。初步判断为阳性者，则需要进行普通PCR试验并进行测序确认，或者用显微镜检查法确认，6
A.1家蚕微粒子病简介
附录A
（资料性附录）
家蚕微粒子病概述
SN/T4292-—2015
家蚕微粒子病（pebrine）是由家蚕微孢子虫（Nosemabombycis，简称Nb）引起的能致蚕业生产毁灭性破坏的传染病。据记载，该病最早于19世纪中叶发生于法国，法国、意大利等欧洲主要养蚕国家曾因该病的暴发而导致蚕丝业的毁灭。在亚洲的日本、印度以及我国等均广泛流行，危害大，难以防治家蚕微孢子虫属原生动物界微孢子虫门、微孢子虫目、微孢子虫属，呈椭圆形，大小约为（3um～4μm）×（1.5μm2μm）。蚕微孢子虫可全身性感染蚕，在蚕（幼虫）、蛹、蛾体内寄生，能经蚕卵胚胎传染和食下传染。病原广泛存在于病蚕、病蛹、病蛾、蚕粪、蚕尿、肠液、蚕皮、蛹皮、鳞毛以及脱落物卵壳中。
家蚕微孢子虫检测技术简介
家蚕微孢子虫检测技术经历了肉眼鉴定、显微镜检查、血清学检测和分子生物学检测方法的研究。自1870年Pasteur创立母峨袋检法以来，母峨微孢子虫的光学显微镜检验方法一直应用至今。本规范引入了聚合酶链式反应（PCR)和实时荧光PCR方法，PCR法是以小亚单位核糖体RNA特定基因为靶标进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。实时荧光PCR法通过检测扩增曲线，以确定样品中是否含有家蚕微孢子虫核酸。
家蚕微孢子虫光学显微镜检图片A.3
家蚕微抱子虫光学显微镜检图片见图A.1。Nb：（2.9μm~4.1μm）×（1.7μm~2.1μm）；400倍~600倍放大。图A.1家蚕微孢子虫光学显微镜检图片7
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