SN/T4291—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法检疫技术规范 Quarantine protocol for simian immunodeficiency virus with dot immunobinding assay 发布日期：2015-09-02 实施日期：2016-04-01 发布机构：中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。SN/T4291—2015请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、苏州西山生物技术有限公司。 本标准主要起草人：罗兆飞、温和心、陈立军、刘军义、盘宝进、罗广生、韦梅良、艾军、时长军、郭连香。 1 范围 本标准规定了实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV）斑点酶免疫法实验室检测的操作程序和技术要求。本标准适用于实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV）的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实验猴 (lab primates)：人工饲养，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的非人灵长类动物，如食蟹猴、猕猴等。 3.2 斑点酶免疫法 (enzyme-linked immunospot assay)：将抗原吸附到硝酸纤维膜上，将吸附了待检血清的滤纸盖在抗原点上，样本中病毒抗体和膜上的抗原发生特异结合，然后加入酶标二抗反应，最后加入底物显色，使特异的抗原-抗体-酶结合物点呈现肉眼可见的红色斑点，以定性检测病毒抗体。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 SIV：猴免疫缺陷病毒 (simian immunodeficiency virus) 5 设备和材料 5.1 恒温培养箱或水浴箱：37.0℃。 5.2 跷跷板式摇床或酶标板摇床。 5.3 涡旋振荡器。 5.4 可调移液器及吸头。 5.5 电子分析天平：精度0.1mg。 5.6 载样条：宽0.5cm，长1cm的小滤纸条。 5.7 渗滤垫：大小为9cm×9cm的厚滤纸。 5.8 尖头镊子。 5.9 大小为9cm×9cm方形塑料平皿。 6 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。注：不同试剂盒制造商的产品应严格按照其说明书要求操作，本标准以猴免疫缺陷病毒斑点酶联免疫检测试剂盒 (VRL) 盒中的试剂及配制为例。 6.1 预点SIV抗原的硝酸纤维抗原膜。 6.2 0.1 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液母液 (10×PBS)：称取80g KCl, 1.9g KH2PO4, 29g Na2HPO4·12H2O, 2g NaCl，加水至1L，充分溶解。 6.3 磷酸盐缓冲液 (1×PBS)：取100mL 10×PBS，加900mL水，混匀。 6.4 样本稀释液：称取5g脱脂奶粉，加PBS至100mL。 6.5 洗涤液 (0.1% PBST)：往1L 1×PBS中加1mL Tween-20，混匀。 6.6 0.2 mol/L pH 8.0 Tris缓冲液：称取11.34g Tris粉末，加水至400mL。 6.7 显色剂A：称取15mg 4-氯-2-甲基重氮苯-1,5-萘二磺酸盐（耐晒红TR盐），加Tris缓冲液至5mL，充分溶解，即用即配。 6.8 显色剂B：称取2mg茶酚，加水至5mL。 6.9 酶标二抗：取10μL 碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG抗体加入10mL PBS中作1:1000稀释作为工作液。 6.10 终止液 (0.1% EDTA)：称取1g EDTA，用去离子水稀释，定容至1000mL，室温保存。 6.11 阳性对照血清。 6.12 阴性对照血清。 7 检验方法 7.1 样品处理 采集静脉血1.5mL，分离血清备用。 7.2 操作步骤 7.2.1 血清稀释：用样本稀释液将样品和阴性、阳性血清作1:5稀释，涡旋混匀。 7.2.2 准备膜：取出抗原膜，编号后置于平皿中，加入15mL样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭30min，结束后将膜用1×PBS快速洗涤三次，每次1min，最后弃去洗液，然后在抗原膜下垫入一张渗滤垫，注入少许0.1% PBST，确认膜和滤纸充分湿润，再倒出多余液体，直至膜上不挂液为止。 7.2.3 贴膜：用尖头镊子轻夹一片载样条