SN/T 4291-2015.Quarantine protocol for simian immunodeficiency virus with dot immunobinding assay.
1范围
SN/T 4291规定了实验猴猴免疫缺陷病毒(SIV)斑点酶免疫法实验室检测的操作程序和技术要求。
SN/T 4291适用于实验猴猴免疫缺陷病毒(SIV)的检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB 19489实验室生物安 全通用要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1实验猴lab primates
人工饲养,对其携带的微生物实行控制,遗传背景明确或者来源清楚的,用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的非人灵长类动物,如食蟹猴、猕猴等。
3.2斑点酶免疫法enzyme-linked immunospot assay
将抗原吸附到硝酸纤维膜上,将吸附了待检血清的滤纸盖在抗原点上,样本中病毒抗体和膜上的抗原发生特异结合,然后加入酶标二抗反应,最后加入底物显色,使特异的抗原-抗体酶结合物点呈现肉眼可见的红色斑点，以定性检测病毒抗体。
4缩略语
下列缩略语适用于本文件。
SIV :猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus)
5设备和材料
5.1恒温培养箱或水浴箱:37.0℃
5.2跷跷板式摇床或酶标板摇床。
5.3涡旋振荡器。

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4291—2015
猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法
检疫技术规范
Quarantine protocol for simian immunodeficiency virus with dotimmunobindingassay
2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
刮涂层查真
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。SN/T4291—2015
请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。本标准起草单位：中华人民共和国广西出入境检验检疫局、中华人民共和国云南出入境检验检疫局、苏州西山生物技术有限公司。本标准主要起草人：罗兆飞、温和心、陈立军、刘军义、盘宝进、罗广生、韦梅良、艾军、时长军、郭连香。1范围
猴免疫缺陷病毒斑点酶免疫法
检疫技术规范
SN/T4291-2015
本标准规定了实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV)斑点酶免疫法实验室检测的操作程序和技术要求。本标准适用于实验猴猴免疫缺陷病毒（SIV)的检测。2
规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB19489实验室生物安全通用要求3
术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
labprimates
实验猴
人工饲养，对其携带的微生物实行控制，遗传背景明确或者来源清楚的，用于科学研究、教学、生产、检定及其他科学实验的非人灵长类动物，如食蟹猴、猕猴等。3.2
法enzyme-linkedimmunospotassay斑点酶免疫法
将抗原吸附到硝酸纤维膜上，将吸附了待检血清的滤纸盖在抗原点上，样本中病毒抗体和膜上的抗原发生特异结合，然后加入酶标二抗反应，最后加人底物显色，使特异的抗原-抗体-酶结合物点呈现肉眼可见的红色斑点，以定性检测病毒抗体。缩略语
下列缩略语适用于本文件。
SIV：猴免疫缺陷病毒（simianimmunodeficiencyvirus）5设备和材料
恒温培养箱或水浴箱：37.0℃。5.2跷跷板式摇床或酶标板摇床。5.3涡旋振荡器。
5.4可调移液器及吸头。下载标准就来标准下载网
5.5电子分析天平：精度0.1mg。5.6
载样条：宽o.5cm，长1cm的小滤纸条，1
SN/T4291—2015
5.7渗滤垫：大小为9cm×9cm的厚滤纸。5.8尖头镊子。
9大小为9cm×9cm方形塑料平血。5.9
试剂和材料
除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或去离子水。注：不同试剂盒制造商的产品应严格按照其说明书要求操作，本标准以猴免疫缺陷病毒斑点酶联免疫检测试剂盒(VRL)\盒中的试剂及配制为例。6.1预点SIV抗原的硝酸纤维抗原膜6.20.1mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液母液（10×PBS）：称取80gKCl,1.9gKH,PO4，加水至
至1L，充分溶解
NaCl,29gNazHPO,12H,O,2g
6.3磷酸盐缓冲液（1×PBS）取100mL10×PBS.加900mL水，混勺。6.4样本稀释液：称取5g脱脂奶粉，加PBS至100mL。6.5洗涤液（0.1%PBST）：往1L1×PBS中加1mL叶温-20，混匀。6.60.2mol/LpH8.0Tris缓冲液：称取11.34gTris粉末，加水至400mL。6.7显色剂A：称取15mg4-氯-2-甲基重氮苯1,5-萘二磺酸盐（耐晒红TR盐），加Tris缓冲液至5mL，充分溶解，即用即配。
6.8显色剂B：称取2mg茶酚，加水至5mL。6.9酶标二抗：取10μL碱性磷酸酶标记的羊抗猴IgG抗体加人10mLPBS中作1：1000稀释作为工作液。
6.10终止液(0.1%EDTA)：称取1gEDTA，用去离子水稀释，定容至1000mL，室温保存。阳性对照血清。
阴性对照血清。
检验方法
样品处理
采集静脉血1.5mL，分离血清备用。7.2操作步骤
7.2.1血清稀释：用样本稀释液将样品和阴性、阳性血清作1：5稀释，涡旋混匀。7.2.2准备膜：取出抗原膜，编号后置于平血中，加人15mL样本稀释液，置摇床上慢速摇动，室温封闭30min，结束后将膜用1×PBS快速洗涤三次，每次1min，最后弃去洗液，然后在抗原膜下垫人一张渗滤垫，注入少许0.1%PBST，确认膜和滤纸充分湿润，再倒出多余液体，直至膜上不挂液为止。7.2.3贴膜：用尖头镊子轻夹一片载样条，将一端小心浸人样品稀释液中，待载样条吸附上液体后提出液面，并将纸条在试管口轻刷1次～2次，去掉多余的液体，然后贴覆在抗原膜上。用吸水纸擦干镊尖，再贴下一个样本。
7.2.4孵育：每张膜贴好后，盖上平血盖，置于水浴箱或恒温培养箱中37.0℃孵育30min。7.2.5洗涤：用0.1%PBST冲去膜上的载样条，并取走渗滤垫后加适量0.1%PBST，置摇床上中速摇1）由苏州西山生物技术有限公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果有其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。2
动，洗涤三次，每次5min，最后弃去洗液。SN/T4291—2015
7.2.6酶标二抗反应：将稀释好的酶标二抗倒人平血，于室温（20℃～28℃）孵育30min。7.2.7洗涤：弃去二抗，用0.1%PBST洗涤三次，每次5min，洗涤过程中置摇床上中速摇动，最后弃去洗液。
7.2.8显色：先将配好的显色剂A和显色剂B等体积混合，然后倒人平皿中，反应时轻摇平血，待弱阳性对照清晰可见（相当于图1中“十/-”)时即可终止反应。约需2min5min。7.2.9终止：将染好的膜浸人预先准备的15mL终止液中，1min后用蒸馏水快速洗涤4次～5次，将膜置于空气中自然晾干。
8结果判定
阳性对照呈肉眼可见的红色斑点，阴性对照无染色则实验成立。若待检样品病毒抗原点呈红色，如图1中“十～十十十”深度，则判为阳性，对于阳性结果，选用本方法或另一种方法重试，如仍为阳性者判为阳性；若待检样本病毒抗原点呈现较浅的红色，如图1中“十/一”深度，则判为可疑；对于可疑的结果，选用本方法或另一种方法重试，如仍为可疑者判为阳性；若待检样品病毒抗原点无色，则判为阴性。+/-
9生物安全要求
开展该检测项目的实验室应满足GB19489中生物安全二级实验室要求。
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