SN/T 4290-2015
基本信息
标准号： SN/T 4290-2015
中文名称：多子小瓜虫检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4290-2015.Quarantine protocol for Ichthyophthirius multifilis.
1范围
SN/T 4290规定了多子小瓜虫的临床诊断、形态学诊断和PCR检测方法。
SN/T 4290适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。
2规范性引用文 件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技 术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
滋养体trophont
成虫adult
多子小瓜虫的寄生阶段，指感染期幼虫从进人鱼的皮肤或鳃，至发育成熟并离开鱼体的阶段。
3.2包囊tomont
寄生于宿主的滋养体脱离宿主在水中自由活动形成包囊。
3.3幼虫theront
包囊连续分裂形成大量幼虫,幼虫破囊而出,长大形成感染期幼虫。
4疾病概述
由多子小瓜虫( Ichthyophthirius muliflis)寄生鱼体引起的传染病称为多子小瓜虫病(ich-thyophthriasis),又称白点病。该虫对大多数淡水和半咸水鱼类都易感。鱼类因该虫的感染,以及因该虫造成的损伤继发其他病原的感染,可造成大批死亡。多子小瓜虫病详细内容参见附录A。
1范围
SN/T 4290规定了多子小瓜虫的临床诊断、形态学诊断和PCR检测方法。
SN/T 4290适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。
2规范性引用文 件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T 6682分 析实验室用水规格和试验方法
GB/T 19495.2转基因产品检测实验室技 术要求
3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1
滋养体trophont
成虫adult
多子小瓜虫的寄生阶段，指感染期幼虫从进人鱼的皮肤或鳃，至发育成熟并离开鱼体的阶段。
3.2包囊tomont
寄生于宿主的滋养体脱离宿主在水中自由活动形成包囊。
3.3幼虫theront
包囊连续分裂形成大量幼虫,幼虫破囊而出,长大形成感染期幼虫。
4疾病概述
由多子小瓜虫( Ichthyophthirius muliflis)寄生鱼体引起的传染病称为多子小瓜虫病(ich-thyophthriasis),又称白点病。该虫对大多数淡水和半咸水鱼类都易感。鱼类因该虫的感染,以及因该虫造成的损伤继发其他病原的感染,可造成大批死亡。多子小瓜虫病详细内容参见附录A。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4290—2015
多子小瓜虫检疫技术规范
Quarantine protocol for Ichthyophthirius multifilis2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4290—2015
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国海南出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭书林、陈信忠、吴山楠、龚艳清、杨俊萍、黄纪徽、孔凡德1
1范围
多子小瓜虫检疫技术规范
本标准规定了多子小瓜虫的临床诊断、形态学诊断和PCR检测方法。本标准适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的SN/T4290—2015
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
滋养体trophont
成虫adult
多子小瓜虫的寄生阶段，指感染期幼虫从进人鱼的皮肤或鳃，至发育成熟并离开鱼体的阶段。3.2
tomont
寄生于宿主的滋养体脱离宿主在水中自由活动形成包囊3.3
幼虫theront
包囊连续分裂形成大量幼虫，幼虫破囊而出，长大形成感染期幼虫。4疾病概述
由多子小瓜虫（Ichthyophthiriusmultifiliis）寄生鱼体引起的传染病称为多子小瓜虫病（ichthyophthiriasis），又称白点病。该虫对大多数淡水和半咸水鱼类都易感。鱼类因该虫的感染，以及因该虫造成的损伤继发其他病原的感染，可造成大批死亡。多子小瓜虫病详细内容参见附录A。5试剂和材料
5.1所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。用于DNA提取及PCR实验的水需用灭菌双蒸水。
5.2绍丁氏固定液（Schaudinnssolution)（配制见附录B中B.1)。1
SN/T4290—2015
5.3波恩氏固定液（Bouin'ssolution)（配制见B.2）。5.4海登汉铁苏木精染色液（Heidenhain'sironhaematoxylin）（配制见B.3）。5.510%的甘油乙醇（配制见B.4)。Taq酶、dNTPs（含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)等PCR所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。5.6
阳性对照为多子小瓜虫滋养体，5.7
5.8PCR引物：XGCF:5\-GTACTTTATTTAGGAGGAGGACT-3',XGCR:5°-TGTTTAACGAGAGAAAATCATAAAT-3'
5.9CTAB溶液（配制见B.5）。
抽提液1（配制见B.6）。
抽提液2（配制见B.7)。
TBE电泳缓冲液（配制见B.8）。核酸染色剂（EB)（配制见B.9）。上样缓冲液（配制见B.10）。
器材和设备
普通PCR仪。
显微镜。
立体显微镜。
高速冷冻离心机。
解剖器具。
微量移液器。
电泳仪。
凝胶成像分析系统或紫外检测仪。载玻片和盖玻片。
临床诊断
多子小瓜虫对大多数淡水和半咸水的不同年龄段鱼类都易感，其中，对鱼苗、鱼种、观赏鱼类及越冬后期的鱼种等影响严重。主要寄生于鱼的皮肤、鳍、鳃和口腔等部位。鱼体感染多子小瓜虫病时，其皮肤、鳍条和鳃瓣上形成许多直径1mm左右的小白点，严重时，躯干、头、鳍、鳃和口腔等处都布满小白点，体表似覆盖一层白色薄膜，有时眼角膜上也有小白点，并伴有大量黏液覆盖于体表和鳃丝（参见附录A）。因黏孢子虫病、打粉病等多种病，其体表症状与多子小瓜虫病相似，所以临床诊断法仅可作为初步诊断。8实验室诊断
8.1虫体的收集
收集从鱼体脱落沉集于容器底部的多子小瓜虫，或从活鱼皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼、鼻等部位刮取组织样本。显微镜观察用虫体可用5%福尔马林固定保存；PCR检测用虫体和鱼体组织可保存于70%的乙醇中，或于一20℃以下冻存备用。2
8.2形态学诊断
8.2.1皮肤组织涂片法
8.2.1.1涂片采集和检查
SN/T4290—2015
取洁净载玻片，按压或刮取鱼体受感染部位的上皮细胞，在立体显微镜下用解剖针挑破白点表层，可见虫体释出。置于显微镜（40×）观察有无多子小瓜虫的滋养体、包囊和幼虫的形态特征（参见附录A）。该方法的灵敏度相对较低，适宜于发病严重的鱼体。8.2.1.2涂片染色方法
8.2.1.2.1组织涂片上滴加适量的绍丁氏液进行固定10min。2加1滴～2滴按1：1比例混合的碘酒和乙醇，洗去过多的固定剂，使成淡茶色。8.2.1.2.2
3蒸馏水水化涂片，再用海登汉铁苏木精染色液染色：先用4%的铁明矾媒染30min～60min，8.2.1.2.3
经蒸馏水洗涤2次；再用0.5%苏木精染色液染30min~60min；最后用2%的铁明矾进行分色。显微镜下观察
鳍和鳃组织的检查
剪取小块表现异常的鳍条，置于滴有生理盐水的载玻片上进行观察；或取少量鳃丝于载玻片进行观察。
组织切片方法
组织样品的固定
取鱼的肌肉、鳃和鳍等组织，用波恩氏液固定3h～5h，再用50%乙醇洗涤数次，最后放人70%的乙醇中保存。
固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）→85%乙醇（60min）→95%乙醇（60min）→无水乙醇I（30min）→无水乙醇Ⅱ（30min）→二甲苯+无水乙醇（体积比1：1)（30min）→二甲苯I（30min）→二甲苯Ⅱ（30min）→二甲苯十石蜡（体积比1：1)（15min）→石蜡I（15min）→石蜡ⅡI（15min）→石蜡包埋→切片（根据组织块大小和种类，各步时间作适当调整）。切片厚度不超过6 μm。
复水和染色
切片按以下程序进行复水：二甲苯（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1)（3min）→无水乙醇（3min）-→95%乙醇（3min）→85%乙醇（3min）→70%乙醇（3min）→蒸馏水（5min）。然后按照8.2.1.2.3方法进行染色。
脱水、封片和观察
8.2.3.4月
染色后的切片按以下程序进行脱水和封片：蒸馏水（5min）-→+85%乙醇（5min）→95%乙醇（5min）→无水乙醇I（5min）→无水乙醇Ⅱ（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1）（5min）→二甲苯I(5min）→二甲苯Ⅱ（5min）→中性树脂封片。显微镜观察。3
SN/T4290—2015
8.2.4甘油酒精透明法
虫体先用5%福尔马林固定，然后保存在10%的甘油乙醇中。观察时吸出若干虫体置于载玻片上，盖上盖玻片，让乙醇逐渐挥发，甘油逐渐变浓。经24h，虫体即可透明。显微镜观察。8.2.5结果判断
显微镜下观察到具有多子小瓜虫幼虫形态特征的虫体，可初步诊断为多子小瓜虫感染；显微镜下观察到具有多子小瓜虫成虫形态特征的虫体，可确诊为多子小瓜虫感染。多子小瓜虫幼虫和成虫的形态结构特征详见附录A。
8.3PCR方法
实验室要求
实验室操作按照GB/T19495.
核酸提取
取鱼体组织（皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼、鼻）约25mg，或2个～20个虫体置于1.5mL8.3.2.1
灭菌离心管中，加人150μLCTAB溶液，用一次性研磨充分研磨，再加人650μLCTAB溶液，混匀后室温放置2h，使样品充分裂解加入350μL抽提液1.充分混合后12000g离心5min，取上层水相。
2加人350μL抽提液
夜2，充分混合后12000g离心5min，取上层水相。8.3.2.3
清液。
加人1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇.混勾后室温放置10min。15000g离心10min，弃上瞬时离心，用移液器小心吸弃残留上清液。室温放置5min晾干沉淀。加人10μL灭菌双兼水，轻弹管壁便沉淀溶解，即可用作PCR模板。8.3.3
PCR反应体系
采用50μL反应体系
，反应设阳性对照和空
在PCR管中依次加人灭菌双蒸水31μL，自对照。
10XPCR缓冲液5μL，引物XGCF禾和引物XGCR（20
μmoL/L各1μL，MgCl,（25mmol/L）5μL，dNTPs（10mmoL/L)1μLTag酶（5U/μL)1uL，DNA模板（空白对照加灭菌双蒸水）5μL。8.3.4PCR反应
反应程序为：94℃5min，然后94℃30s53℃304℃保存
8.3.5电泳
℃30s35个循环，最后延伸72℃10min，用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖平板，加核酸染色剂EB。将6μL样品和2μL样品缓冲液混合后加入样品孔，设立DNA分子量标准物作对照。紫外检测仪下观察结果。8.3.6结果判定
阳性对照在326bp位置处出现条带，空白对照不出现条带，结果有效。样品在326bp处无条带，判为阴性。样品在326bp位置处出现条带，需对PCR产物进行测序确认。参考序列参见附录C。8.4综合判定
临床诊断法可对多子小瓜虫感染进行初步判断；形态学诊断法观察到成虫，或者PCR检测结果为阳性，可确诊为多子小瓜虫感染。4
附录A
（资料性附录）
多子小瓜虫病概述
SN/T4290-—2015
多子小瓜虫病（ichthyophthiriasis）又称白点病，是由多子小瓜虫（Ichthyophthiriusmultifilis）寄生引起的传染病。多子小瓜虫属于原生动物门（Portozea），纤毛纲（Ciliata），膜口目（Holotricha），凹口科（Ophryoglenidae），小瓜虫属（Ichthyophthirius）。目前只有多子小瓜虫一种。世界各地均有分布。通常在江河等流动的水体中较少，而在湖泊、池塘、稻田以及水族箱等流动性较小的水体中分布广泛。多子小瓜虫生活史包括三个连续的阶段，各阶段的虫体形态有很大的差别（图A.1）。寄生于宿主体表的滋养体，脱离宿主在水中自由活动形成包囊。刚离开寄主的多子小瓜虫游泳很活泼，依靠纤毛以滚动或螺旋式前进。离开寄主在水中游泳的时间较短：一般在3h-6h就静止并分泌出一层透明胶膜形成包囊。包囊呈球形、椭球形或不规则形状，人大小不一，长300mm~1000μm，宽200μm~800μm，最小的直径仅70um。随着包囊的发育，逐渐形成左右两个半球，再到四胞或八胞期，还可分泌内胞膜，将左右两个集团包围，有时可形成三个以上集团。包囊中的幼虫发育成熟逸出水中快速游动感染新的宿主。不同发育阶段的幼虫形态有所不同。最初成熟的幼虫为圆球形，经5h～8h后开始活动，身体逐渐延长，前端变尖，后端钝圆，最前方有一个锥形的钻孔器。刚从包囊内出来的幼虫，身体为圆筒形，不久即变成鞋底形，身体的前半部有一个大的伸缩泡。大核呈圆形草或卵圆形，多数在身体的后方。身体前方腹面有一个“6”字形的原始胞口，胞口右边有3行～4行半环状的纤毛纹。身体后端有一根粗长的尾毛，长度为体纤毛的三倍。染色标本中的大核为卵形，蓝色。小核球形，深蓝色，位置不恒定。细胞质呈网状。长大的幼虫大小约（200μm500μm）×（200μm
300μm），体纤毛长7μm~9μm。尾毛长可达17μm～18μm。虫体游动活泼，并能随意改变形状。成虫即多子小瓜虫滋养体一般为乳白色的卵圆形或球形，大小约（350μm800μm）x（300μm~500um）
肉眼可见，是鱼体上发现的最大寄生原虫。在多子小瓜虫的腹面近前端可见有一“6”字形胞口，螺旋形白
的口缘由5行～8行纤毛组成，纤毛作逆时针方向运动，一直到胞咽。虫体有两个核，大核呈马蹄形、小核呈圆形，紧贴在大核上，胞质外层子小瓜虫的寄生阶段，从感染期幼虫进人鱼有很多细小的伸缩泡，内含有大量食物粒。滋养体阶段为多
的皮肤或鳃，到发育成熟并离开鱼体虫体吸取寄主营养
生，形成白色脓泡，虫体在脓泡内可以分裂繁殖，并在皮肤组织间不停移动，刺激寄主组织增般分裂3次～4
次，在宿主的上皮层形成大小相似的聚集虫体。多子小瓜虫身体
十分柔软，可似变形
虫样在黏液里
动，活动力强，在寄主组织中可以任意移
二皮细胞、吞人口中。经过一段时间的发育，虫体穿移。胞口部分坚实不变形，可以紧压并刮下寄主的上冲出脓泡进入水中（图A.2）。
多子小瓜虫完成其生活史所需的时间随水温的变化而不同。该病发生的适宜水温是15℃～25℃，在20℃～25℃最易感染鱼类，但在低水温如1℃也可以感染。30℃以上时虫体不能发育。SN/T4290—2015
说明：
成虫：
幼虫：
胞口：
纤毛线；
大核：
食物粒；
伸缩泡。
患小瓜虫病的病鱼
幼虫破囊入水
再感染鱼体
包囊连续分裂
形成大量幼虫
包囊四分裂
多子小瓜虫生活史
多子小瓜虫形态模式图
离开鱼体的成虫
形成包囊
包囊二分裂
B.1绍丁氏固定液
升汞饱和水溶液
95%乙醇
冰醋酸
临用前将甲、乙液混合。
B.2波恩氏固定液
饱和苦味酸
40%甲醛
冰醋酸
海登汉铁苏木精染色液
附录B
（规范性附录）
试剂配制
SN/T4290—2015bzxZ.net
甲液（媒染液）：将2g～4g硫酸铁铵（铁明矾）溶于100mL蒸馏水中。临用之前配制。乙液（染色液）：将0.5g苏木精溶于10mL95%乙醇中，瓶口用双层纱布包扎，使其充分氧化（室内放置两个月）；加人90mL蒸馏水，塞紧瓶口，置冰箱中可长期保存。染色时，切片先用甲液媒染，并充分水洗后以乙液染色，染色后经水稍洗再用另一瓶甲液分色至适度。
B.410%的甘油乙醇
90mL70%乙醇加10mL甘油。
CTAB溶液
Tris-HCI(1moL/L)
EDTA(0.5moL/L)
20mL(pH8.0)
先用70mL双蒸水溶解，再定容至200mL，灭菌冷却后加人400μL2-巯基乙醇（0.25%1.0%）摇匀。
抽提液1
用1.0moL/LpH7.9Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇按25：24：1的比例混合，避光保存。7
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多子小瓜虫检疫技术规范
Quarantine protocol for Ichthyophthirius multifilis2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4290—2015
本标准起草单位：中华人民共和国厦门出人境检验检疫局检验检疫技术中心、中华人民共和国海南出入境检验检疫局。
本标准主要起草人：郭书林、陈信忠、吴山楠、龚艳清、杨俊萍、黄纪徽、孔凡德1
1范围
多子小瓜虫检疫技术规范
本标准规定了多子小瓜虫的临床诊断、形态学诊断和PCR检测方法。本标准适用于多子小瓜虫病的病原鉴定及其流行病学调查和监测。2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的SN/T4290—2015
凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T19495.2转基因产品检测实验室技术要求3术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。3.1
滋养体trophont
成虫adult
多子小瓜虫的寄生阶段，指感染期幼虫从进人鱼的皮肤或鳃，至发育成熟并离开鱼体的阶段。3.2
tomont
寄生于宿主的滋养体脱离宿主在水中自由活动形成包囊3.3
幼虫theront
包囊连续分裂形成大量幼虫，幼虫破囊而出，长大形成感染期幼虫。4疾病概述
由多子小瓜虫（Ichthyophthiriusmultifiliis）寄生鱼体引起的传染病称为多子小瓜虫病（ichthyophthiriasis），又称白点病。该虫对大多数淡水和半咸水鱼类都易感。鱼类因该虫的感染，以及因该虫造成的损伤继发其他病原的感染，可造成大批死亡。多子小瓜虫病详细内容参见附录A。5试剂和材料
5.1所有化学试剂均为分析纯。实验用水应符合GB/T6682中一级水的规格。用于DNA提取及PCR实验的水需用灭菌双蒸水。
5.2绍丁氏固定液（Schaudinnssolution)（配制见附录B中B.1)。1
SN/T4290—2015
5.3波恩氏固定液（Bouin'ssolution)（配制见B.2）。5.4海登汉铁苏木精染色液（Heidenhain'sironhaematoxylin）（配制见B.3）。5.510%的甘油乙醇（配制见B.4)。Taq酶、dNTPs（含dATP、dUTP、dCTP、dGTP)等PCR所需试剂可选用商品化试剂和试剂盒。5.6
阳性对照为多子小瓜虫滋养体，5.7
5.8PCR引物：XGCF:5\-GTACTTTATTTAGGAGGAGGACT-3',XGCR:5°-TGTTTAACGAGAGAAAATCATAAAT-3'
5.9CTAB溶液（配制见B.5）。
抽提液1（配制见B.6）。
抽提液2（配制见B.7)。
TBE电泳缓冲液（配制见B.8）。核酸染色剂（EB)（配制见B.9）。上样缓冲液（配制见B.10）。
器材和设备
普通PCR仪。
显微镜。
立体显微镜。
高速冷冻离心机。
解剖器具。
微量移液器。
电泳仪。
凝胶成像分析系统或紫外检测仪。载玻片和盖玻片。
临床诊断
多子小瓜虫对大多数淡水和半咸水的不同年龄段鱼类都易感，其中，对鱼苗、鱼种、观赏鱼类及越冬后期的鱼种等影响严重。主要寄生于鱼的皮肤、鳍、鳃和口腔等部位。鱼体感染多子小瓜虫病时，其皮肤、鳍条和鳃瓣上形成许多直径1mm左右的小白点，严重时，躯干、头、鳍、鳃和口腔等处都布满小白点，体表似覆盖一层白色薄膜，有时眼角膜上也有小白点，并伴有大量黏液覆盖于体表和鳃丝（参见附录A）。因黏孢子虫病、打粉病等多种病，其体表症状与多子小瓜虫病相似，所以临床诊断法仅可作为初步诊断。8实验室诊断
8.1虫体的收集
收集从鱼体脱落沉集于容器底部的多子小瓜虫，或从活鱼皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼、鼻等部位刮取组织样本。显微镜观察用虫体可用5%福尔马林固定保存；PCR检测用虫体和鱼体组织可保存于70%的乙醇中，或于一20℃以下冻存备用。2
8.2形态学诊断
8.2.1皮肤组织涂片法
8.2.1.1涂片采集和检查
SN/T4290—2015
取洁净载玻片，按压或刮取鱼体受感染部位的上皮细胞，在立体显微镜下用解剖针挑破白点表层，可见虫体释出。置于显微镜（40×）观察有无多子小瓜虫的滋养体、包囊和幼虫的形态特征（参见附录A）。该方法的灵敏度相对较低，适宜于发病严重的鱼体。8.2.1.2涂片染色方法
8.2.1.2.1组织涂片上滴加适量的绍丁氏液进行固定10min。2加1滴～2滴按1：1比例混合的碘酒和乙醇，洗去过多的固定剂，使成淡茶色。8.2.1.2.2
3蒸馏水水化涂片，再用海登汉铁苏木精染色液染色：先用4%的铁明矾媒染30min～60min，8.2.1.2.3
经蒸馏水洗涤2次；再用0.5%苏木精染色液染30min~60min；最后用2%的铁明矾进行分色。显微镜下观察
鳍和鳃组织的检查
剪取小块表现异常的鳍条，置于滴有生理盐水的载玻片上进行观察；或取少量鳃丝于载玻片进行观察。
组织切片方法
组织样品的固定
取鱼的肌肉、鳃和鳍等组织，用波恩氏液固定3h～5h，再用50%乙醇洗涤数次，最后放人70%的乙醇中保存。
固定好的组织块用水充分洗涤，按下列程序处理：70%乙醇（60min）→85%乙醇（60min）→95%乙醇（60min）→无水乙醇I（30min）→无水乙醇Ⅱ（30min）→二甲苯+无水乙醇（体积比1：1)（30min）→二甲苯I（30min）→二甲苯Ⅱ（30min）→二甲苯十石蜡（体积比1：1)（15min）→石蜡I（15min）→石蜡ⅡI（15min）→石蜡包埋→切片（根据组织块大小和种类，各步时间作适当调整）。切片厚度不超过6 μm。
复水和染色
切片按以下程序进行复水：二甲苯（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1)（3min）→无水乙醇（3min）-→95%乙醇（3min）→85%乙醇（3min）→70%乙醇（3min）→蒸馏水（5min）。然后按照8.2.1.2.3方法进行染色。
脱水、封片和观察
8.2.3.4月
染色后的切片按以下程序进行脱水和封片：蒸馏水（5min）-→+85%乙醇（5min）→95%乙醇（5min）→无水乙醇I（5min）→无水乙醇Ⅱ（5min）→二甲苯十无水乙醇（体积比1：1）（5min）→二甲苯I(5min）→二甲苯Ⅱ（5min）→中性树脂封片。显微镜观察。3
SN/T4290—2015
8.2.4甘油酒精透明法
虫体先用5%福尔马林固定，然后保存在10%的甘油乙醇中。观察时吸出若干虫体置于载玻片上，盖上盖玻片，让乙醇逐渐挥发，甘油逐渐变浓。经24h，虫体即可透明。显微镜观察。8.2.5结果判断
显微镜下观察到具有多子小瓜虫幼虫形态特征的虫体，可初步诊断为多子小瓜虫感染；显微镜下观察到具有多子小瓜虫成虫形态特征的虫体，可确诊为多子小瓜虫感染。多子小瓜虫幼虫和成虫的形态结构特征详见附录A。
8.3PCR方法
实验室要求
实验室操作按照GB/T19495.
核酸提取
取鱼体组织（皮肤、鳍、鳃、头、鳞片、角膜、口腔、眼、鼻）约25mg，或2个～20个虫体置于1.5mL8.3.2.1
灭菌离心管中，加人150μLCTAB溶液，用一次性研磨充分研磨，再加人650μLCTAB溶液，混匀后室温放置2h，使样品充分裂解加入350μL抽提液1.充分混合后12000g离心5min，取上层水相。
2加人350μL抽提液
夜2，充分混合后12000g离心5min，取上层水相。8.3.2.3
清液。
加人1.5倍体积一20℃预冷的无水乙醇.混勾后室温放置10min。15000g离心10min，弃上瞬时离心，用移液器小心吸弃残留上清液。室温放置5min晾干沉淀。加人10μL灭菌双兼水，轻弹管壁便沉淀溶解，即可用作PCR模板。8.3.3
PCR反应体系
采用50μL反应体系
，反应设阳性对照和空
在PCR管中依次加人灭菌双蒸水31μL，自对照。
10XPCR缓冲液5μL，引物XGCF禾和引物XGCR（20
μmoL/L各1μL，MgCl,（25mmol/L）5μL，dNTPs（10mmoL/L)1μLTag酶（5U/μL)1uL，DNA模板（空白对照加灭菌双蒸水）5μL。8.3.4PCR反应
反应程序为：94℃5min，然后94℃30s53℃304℃保存
8.3.5电泳
℃30s35个循环，最后延伸72℃10min，用TBE电泳缓冲液配制2%的琼脂糖平板，加核酸染色剂EB。将6μL样品和2μL样品缓冲液混合后加入样品孔，设立DNA分子量标准物作对照。紫外检测仪下观察结果。8.3.6结果判定
阳性对照在326bp位置处出现条带，空白对照不出现条带，结果有效。样品在326bp处无条带，判为阴性。样品在326bp位置处出现条带，需对PCR产物进行测序确认。参考序列参见附录C。8.4综合判定
临床诊断法可对多子小瓜虫感染进行初步判断；形态学诊断法观察到成虫，或者PCR检测结果为阳性，可确诊为多子小瓜虫感染。4
附录A
（资料性附录）
多子小瓜虫病概述
SN/T4290-—2015
多子小瓜虫病（ichthyophthiriasis）又称白点病，是由多子小瓜虫（Ichthyophthiriusmultifilis）寄生引起的传染病。多子小瓜虫属于原生动物门（Portozea），纤毛纲（Ciliata），膜口目（Holotricha），凹口科（Ophryoglenidae），小瓜虫属（Ichthyophthirius）。目前只有多子小瓜虫一种。世界各地均有分布。通常在江河等流动的水体中较少，而在湖泊、池塘、稻田以及水族箱等流动性较小的水体中分布广泛。多子小瓜虫生活史包括三个连续的阶段，各阶段的虫体形态有很大的差别（图A.1）。寄生于宿主体表的滋养体，脱离宿主在水中自由活动形成包囊。刚离开寄主的多子小瓜虫游泳很活泼，依靠纤毛以滚动或螺旋式前进。离开寄主在水中游泳的时间较短：一般在3h-6h就静止并分泌出一层透明胶膜形成包囊。包囊呈球形、椭球形或不规则形状，人大小不一，长300mm~1000μm，宽200μm~800μm，最小的直径仅70um。随着包囊的发育，逐渐形成左右两个半球，再到四胞或八胞期，还可分泌内胞膜，将左右两个集团包围，有时可形成三个以上集团。包囊中的幼虫发育成熟逸出水中快速游动感染新的宿主。不同发育阶段的幼虫形态有所不同。最初成熟的幼虫为圆球形，经5h～8h后开始活动，身体逐渐延长，前端变尖，后端钝圆，最前方有一个锥形的钻孔器。刚从包囊内出来的幼虫，身体为圆筒形，不久即变成鞋底形，身体的前半部有一个大的伸缩泡。大核呈圆形草或卵圆形，多数在身体的后方。身体前方腹面有一个“6”字形的原始胞口，胞口右边有3行～4行半环状的纤毛纹。身体后端有一根粗长的尾毛，长度为体纤毛的三倍。染色标本中的大核为卵形，蓝色。小核球形，深蓝色，位置不恒定。细胞质呈网状。长大的幼虫大小约（200μm500μm）×（200μm
300μm），体纤毛长7μm~9μm。尾毛长可达17μm～18μm。虫体游动活泼，并能随意改变形状。成虫即多子小瓜虫滋养体一般为乳白色的卵圆形或球形，大小约（350μm800μm）x（300μm~500um）
肉眼可见，是鱼体上发现的最大寄生原虫。在多子小瓜虫的腹面近前端可见有一“6”字形胞口，螺旋形白
的口缘由5行～8行纤毛组成，纤毛作逆时针方向运动，一直到胞咽。虫体有两个核，大核呈马蹄形、小核呈圆形，紧贴在大核上，胞质外层子小瓜虫的寄生阶段，从感染期幼虫进人鱼有很多细小的伸缩泡，内含有大量食物粒。滋养体阶段为多
的皮肤或鳃，到发育成熟并离开鱼体虫体吸取寄主营养
生，形成白色脓泡，虫体在脓泡内可以分裂繁殖，并在皮肤组织间不停移动，刺激寄主组织增般分裂3次～4
次，在宿主的上皮层形成大小相似的聚集虫体。多子小瓜虫身体
十分柔软，可似变形
虫样在黏液里
动，活动力强，在寄主组织中可以任意移
二皮细胞、吞人口中。经过一段时间的发育，虫体穿移。胞口部分坚实不变形，可以紧压并刮下寄主的上冲出脓泡进入水中（图A.2）。
多子小瓜虫完成其生活史所需的时间随水温的变化而不同。该病发生的适宜水温是15℃～25℃，在20℃～25℃最易感染鱼类，但在低水温如1℃也可以感染。30℃以上时虫体不能发育。SN/T4290—2015
说明：
成虫：
幼虫：
胞口：
纤毛线；
大核：
食物粒；
伸缩泡。
患小瓜虫病的病鱼
幼虫破囊入水
再感染鱼体
包囊连续分裂
形成大量幼虫
包囊四分裂
多子小瓜虫生活史
多子小瓜虫形态模式图
离开鱼体的成虫
形成包囊
包囊二分裂
B.1绍丁氏固定液
升汞饱和水溶液
95%乙醇
冰醋酸
临用前将甲、乙液混合。
B.2波恩氏固定液
饱和苦味酸
40%甲醛
冰醋酸
海登汉铁苏木精染色液
附录B
（规范性附录）
试剂配制
SN/T4290—2015bzxZ.net
甲液（媒染液）：将2g～4g硫酸铁铵（铁明矾）溶于100mL蒸馏水中。临用之前配制。乙液（染色液）：将0.5g苏木精溶于10mL95%乙醇中，瓶口用双层纱布包扎，使其充分氧化（室内放置两个月）；加人90mL蒸馏水，塞紧瓶口，置冰箱中可长期保存。染色时，切片先用甲液媒染，并充分水洗后以乙液染色，染色后经水稍洗再用另一瓶甲液分色至适度。
B.410%的甘油乙醇
90mL70%乙醇加10mL甘油。
CTAB溶液
Tris-HCI(1moL/L)
EDTA(0.5moL/L)
20mL(pH8.0)
先用70mL双蒸水溶解，再定容至200mL，灭菌冷却后加人400μL2-巯基乙醇（0.25%1.0%）摇匀。
抽提液1
用1.0moL/LpH7.9Tris饱和酚、三氯甲烷、异戊醇按25：24：1的比例混合，避光保存。7
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