SN/T4298—2015 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范 Quarantine protocol for nonstructural protein antibody against foot-and-mouth disease virus 2015-09-02 发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 2016-04-01 实施 前言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津出境检验检疫局、中华人民共和国新疆出境检验检疫局 本标准主要起草人：王玉玲、肖妍、刘国红、季新成、张俊哲、柴铭骏、刘红梅 1 范围 本标准规定了口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验、非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验技术要求。本标准适用于牛口蹄疫非结构蛋白抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18935 口蹄疫诊断技术 GB 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1181 口蹄疫检疫技术规范 3 概述 参见附录A。 4 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行口蹄疫非结构蛋白抗体的检测，应当采取预防气溶胶感染的安全措施，并按照GB 19489中的有关规定进行操作。 5 被检血清样品 5.1 按常规方法采血和分离血清 血清应新鲜，无腐败。 5.2 运送和保存血清 防止血清受热，若3d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4℃～8℃冰箱内备用，如需长期保存，应置于-20℃冰箱内。 6 口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验 6.1 试剂和材料 6.1.1 96孔微量板：用于样品稀释。 6.1.2 试验用蒸馏水为GB/T 6682中的三级水。 6.1.3 口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂：由非结构蛋白包被的抗原包被板、20×洗液、大肠杆菌（E.coli）、脱脂奶粉、马血清、阴性对照血清、阳性对照血清1、阳性对照血清2、100×结合物、底物、终止液组成，试剂存放于冰箱（4℃～8℃）中。 6.2 仪器和设备 6.2.1 洗板机 6.2.2 温箱 6.2.3 酶标仪：波长450nm、620nm 6.2.4 微量板振荡器 6.2.5 天平 6.2.6 台式离心机 6.2.7 可调微量移液器 6.3 试验原理 用口蹄疫病毒非结构蛋白包被ELISA微量反应板。当加入被检血清样品时，如果样品中含有非结构蛋白抗体，则与包被的非结构蛋白特异性结合形成抗原抗体复合物；未结合的物质通过洗涤从微量孔中洗去。再加入酶标抗体后，酶标抗体与结合的抗原抗体复合物结合，未结合的物质通过洗涤洗去。最后加入底物，底物与结合抗原抗体复合物的酶标抗体发生显色反应。如果样品中不含有非结构蛋白抗体，则不能与包被的非结构蛋白结合，不能形成抗原抗体复合物，酶标抗体不会结合，加入底物后不显色。微量孔颜色的深浅与样品中非结构蛋白抗体的量成正比，通过酶标仪读取光密度值判定样品的阴、阳性。 6.4 试验程序 6.4.1 试验前预准备 6.4.1.1 试剂的使用 在试验前1h左右，将包被板、洗液、终止液、底物、马血清、大肠杆菌、脱脂奶粉从冰箱中取出，于室温（22℃～25℃）下放置，使试剂恢复至室温状态。马血清、大肠杆菌、脱脂奶粉用后应立即放回冰箱。对照血清、100×结合物在使用前从冰箱中取出，用后放回冰箱中。 6.4.1.2 洗液的配制 用蒸馏水将20×洗液作20倍稀释，1块板约需洗液500mL（25mL 20×洗液 + 475mL 蒸馏水）。若20×洗液瓶内有晶体，可放置37±0.5℃水浴至晶体溶解后再配制洗液。试验中所用洗液量参见表1。 表1 试验所需洗液及样品/结合物稀释液量 样品数量 | 洗液用量/mL | 样品/结合物稀释液用量/mL 1板 (88个样品) | 500 | 30 2板 (176个样品) | 1000 | 60 3板 (264个样品) | 1500 | 90 4板 (352个样品) | 2000 | 120 5板 (440个样品) | 2500 | 150 6.4.1.3 样品/结合物稀释液的配制 取5g脱脂奶粉溶于约50mL洗液中，加入10mL马血清、100μL大肠杆菌，混匀，用洗液将混合液补至100mL。每次试验现配现用。