SN/T 4298-2015
基本信息
标准号： SN/T 4298-2015
中文名称：口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范
标准类别：商检行业标准(SN)
标准状态：现行
出版语种：简体中文
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标准分类号
关联标准
出版信息
相关单位信息
标准简介
SN/T 4298-2015.Quarantine protocol for nonstructural protein antibody aganist foot-and-mouth disease virus.
1范围
SN/T 4298规定了口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验、非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验技术要求。
SN/T 4298适用于牛口蹄疫非结构蛋白抗体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18935口 蹄疫诊断技术
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 1181口 蹄疫检疫技术规范
3概述
参见附录A。
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员进行口蹄疫非结构蛋白抗体的检测,应当采取预防气溶胶感染的安全措施。按照GB 19489中的有关规定进行操作。
5被检血清样品
5.1 按常规方法采血和分离血清
血清应新鲜,无腐败。
5.2 运送和保存血清
防止血清受热,若3d内不能送到实验室,需用冷藏方法运送血清。血清应放至4°C~8°C冰箱内.备用,如需长期保存,应置-20℃冰箱内。
1范围
SN/T 4298规定了口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验、非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验技术要求。
SN/T 4298适用于牛口蹄疫非结构蛋白抗体检测。
2规范性引用文件
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。
GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 18935口 蹄疫诊断技术
GB 19489实验室生物安 全通用要求
SN/T 1181口 蹄疫检疫技术规范
3概述
参见附录A。
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全,应由具备资格的工作人员进行口蹄疫非结构蛋白抗体的检测,应当采取预防气溶胶感染的安全措施。按照GB 19489中的有关规定进行操作。
5被检血清样品
5.1 按常规方法采血和分离血清
血清应新鲜,无腐败。
5.2 运送和保存血清
防止血清受热,若3d内不能送到实验室,需用冷藏方法运送血清。血清应放至4°C~8°C冰箱内.备用,如需长期保存,应置-20℃冰箱内。
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标准内容
中华人民共和国出入境检验检疫行业标准SN/T4298—2015
口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范Quarantine protocol for nonstructural protein antibody aganistfoot-and-mouthdiseasevirus
2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4298—2015
本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出境检验检疫局
本标准主要起草人：王玉玲、肖妍、刘国红、季新成、张俊哲、柴铭骏、刘红梅I
口蹄疫非结构蛋自抗体检疫技术规范SN/T4298—2015
本标准规定了口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验、非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验技术要求。
本标准适用于牛口蹄疫非结构蛋白抗体检测。2规范性引用文件wwW.bzxz.Net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18935口蹄疫诊断技术
GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1181口蹄疫检疫技术规范
3概述
参见附录A。
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行口蹄疫非结构蛋白抗体的检测，应当采取预防气溶胶感染的安全措施。按照GB19489中的有关规定进行操作。5被检血清样品
按常规方法采血和分离血清
血清应新鲜，无腐败。
运送和保存血清
防止血清受热，若3d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4℃～8℃冰箱内备用，如需长期保存，应置一20℃冰箱内口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验6
6.1试剂和材料
6.1.196孔微量板：用于样品稀释。SN/T4298—2015
6.1.2试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。6.1.3口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂：由非结构蛋白包被的抗原包被板、20X洗液、大肠杆菌（E.coli)、脱脂奶粉、马血清、阴性对照血清、阳性对照血清1、阳性对照血清2、100×结合物、底物、终止液，试剂存放于冰箱（4℃～8℃）中。6.2
仪器和设备
洗板机。
温箱。
酶标仪：波长450nm、620nm。
微量板振荡器。
天平。
台式离心机。
可调微量移液器。
试验原理
用口蹄疫病毒非结构蛋白包被ELISA微量反应板。当加入被检血清样品时，如果样品中含有非结构蛋白抗体，则与包被的非结构蛋白特异性结合形成抗原抗体复合物，未结合的物质通过洗涤从微量后，抗原抗体复合物与之结合，未结合的物质通过洗涤洗去。再加入底物反应板上洗去。加人酶标抗体后后，底物与结合抗原抗体复合物的酶标抗体发生显色反应：如果样品中不含有非结构蛋白抗体，则不能与包被的非结构蛋白结合，不能形成抗原体复合物，酶标抗体不会结合，加人底物后不显色。微量孔颜色的深浅与样品中非结构蛋白抗体的量成正比，通过酶标仪读取光密度值判定样品的阴、阳性。6.4试验程序
6.4.1试验前预准备
试剂的使用
在试验前1h左右，将包被板、洗液、终止液、底物、马血清、大肠杆菌、脱脂奶粉从冰箱中取出，于室温（22℃～25℃）下放置，使试剂恢复至室温状态，马血清大肠杆菌、脱脂奶粉用后放回冰箱。对照血清、100×结合物在使用前从冰箱中取出，用后放回冰箱中6.4.1.2
洗液的配制
用蒸馏水将20×洗液作20倍稀释，1块板约需洗液500mL（25mL20×洗液+475mL蒸馏水）。若20×洗液瓶内有晶体，可放置37℃士0.5℃水浴至晶体溶解后再配制洗液。试验中所用洗液量参见表1。表1试验所需洗液及样品/结合物稀释液量样品数量
1板（88个样品）
2板（176个样品）
3板（264个样品）
4板（352个样品）
5板（440个样品）
洗液用量/mL
样品/结合物稀释液用量/mL
6.4.1.3样品/结合物稀释液的配制SN/T4298—2015
取5g脱脂奶粉溶于约50mL洗液中，加人10mL马血清、100μL大肠杆菌，混匀，用洗液将混合液补至100mL。每次试验现配现用，试验所用量参见表1。6.4.1.4结合物工作液的配制
结合物在使用前5min10min内，按照表2配制。如1块反应板，需配制11mL结合物工作液，应取110μL100×结合物加人到11mL样品/结合物稀释液中，混匀。表2
微量板的数量
正式试验
样品的孵育
结合物工作液的配制
样品/结合物稀释液
100×结合物
取190μL样品/结合物稀释液加至微量稀释板中，取10μL样品或对照血清（对照血清使用前离清1加3个孔，阳性对照血清2加2个孔。每心加至对应的孔内，阴性对照血清加2个孔，阳性对照血目应孔内置微量板振荡器上中速振荡个样品用新的滴头。血清加至相板中相应孔内。
封板，37℃土0.5℃温箱中孵育30m合物工作液。
6.4.2.2洗板
min后，移取100μL加人反应
在孵育结束前5min~10min按6.4.1.4配制结孵育结束后，将板迅速翻转倒掉板内液体至废液缸后，在干净的吸水纸上扣至无液体流出，放置洗板机上洗板或手工洗板6次，手工洗板时应在每次洗板后，将板翻转倒掉板内液体，并在干净的吸水纸上扣至无液体流出。洗板结束后，将板翻转至干净的吸水纸上扣至无液体流出。6.4.2.3结合物的孵育
取100μL结合物工作液加至反应板的每个孔内，封板，37℃士0.5℃温箱孵育30min士0.5min。6.4.2.4洗板
按6.4.2.2操作。
底物的孵育
取100μL底物加至反应板的每个孔内，室温（22℃～25℃）孵育15min士0.5min，当反应颜色较浅时，可延长孵育时间5min～10min。3
SN/T4298—2015
反应的终止
取100uL终止液加至反应板的每个孔内。终止液的加入顺序应与底物的加人顺序相同。6.4.2.7读板
反应终止后30min内在450nm和620nm（作为自动背景校正）双波长下读板。6.4.3
结果判定
6.4.3.1试验的有效性
对照血清的检测结果在满足下列要求时，试验为成立，方可进行样品的结果判定；否则，试验应重做：
每个CN的吸收值都小于0.1时，计算其平均值。每个CP1的吸收值减去CN平均值后应大于0.15。如果有一个CP1值不满足条件，可以忽略它，用另外2个CP1计算平均值；如果3个都满足，计算3个CP1的平均值一一每个CP2的吸收值减去CN平均值后，计算其平均值。-CP2/CP1应为2.1，最大误差士25%。6.4.3.2
样品的结果判定
按式(1)计算T/C值：
T/C=(A-B)/(C-B)
式中：
被检样品的吸收值；
B——CN吸收值的平均值；
CP1吸收值的平均值，
当T/C<0.8时，被检血清样品判定为阴性反应。当0.8≤T/C<1,被检血清样品判定为可疑反应。当T/C≥1,被检血清样品判定为阳性反应。（1)
当样品的结果判定为阳性反应或可疑反应时，则应对样品进行重复检测，结果仍为阳性或可疑的，则应采用酶联免疫电转移印迹试验或病毒分离（见SN/T1181或GB/T18935）等方法作进一步的确证试验；当样品的结果判定为阴性反应时，则判定样品为阴性。非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验7
试剂和材料
八道孵育槽。
试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验（EITB)检测试剂：致敏硝化纤维素条、10X缓冲液、大肠杆菌（E.coli）、脱脂奶粉、阴性对照血清、阳性对照血清1、阳性对照血清2、10o×结合物、底物稀释液、NBT底物、BCIP，试剂存放于冰箱（4℃～8℃)中。7.2
仪器和设备
温箱。
微型翘板摇床。
台式离心机。
7.2.4可调微量移液器。
7.2.5天平。
试验原理
SN/T4298—2015
将纯化的口蹄疫病毒3ABC、3D、2C、3B、3A非结构蛋白电转移印迹在硝化纤维素膜上。当加人样品时，如果样品中有特异性抗体，则与之结合，形成抗原抗体复合物，如果样品中没有特异性抗体则不发生结合，在洗涤过程中将被洗去，而结合在硝化纤维素条上的抗原抗体复合物不被洗去。当加人结合物（碱性磷酸酶标记的抗体）后，结合物与抗原抗体复合物结合，未结合的物质将被洗去。当加入底物时，底物与结合了抗原抗体复合物的结合物发生酶反应，在结合特异性抗体的非结构蛋白条带处产生肉眼可见的颜色反应。着色密度高低与样品中非结构蛋白抗体的量成正比。根据非结构蛋白条带着色的密度情况判定样品的阴、阳性。
7.4试验程序
7.4.1试验前预准备
7.4.1.1试剂的使用
在试验前1h左右，将致敏硝化纤维素条、10×浓缩的缓冲溶液、底物稀释液、大肠杆菌、脱脂奶粉从冰箱中取出，于室温（22℃～25℃）下放置，使试剂恢复至室温状态。大肠杆菌、脱脂奶粉用后放回冰箱中。对照血清、100X结合物、NBT和BCIP在使用前从冰箱中取出，用后放回冰箱中。7.4.1.2试验所需的溶液量
试验所需的溶液量见表3。
表3试验所需溶液量
样品数量
1组纤维条
（26个样品+3个对照血清）
1组纤维条
（52个样品+6个对照血清）
1组纤维条
（78个样品+9个对照血清）
7.4.1.3洗液的配制
饱和缓冲液
用蒸馏水将10×缓冲液做10倍稀释，1组纤维条约需洗液500mL（25mL10×缓冲液+475mL蒸馏水）。若10×缓冲液瓶内有晶体，可放置37℃士0.5℃水浴至晶体溶解后再配制洗液。7.4.1.4饱和缓冲液的配制
取2.5g脱脂奶粉，加入30mL蒸馏水，溶解后，加人5mL10×缓冲液，50μL大肠杆菌，混匀，用蒸馏水补至50mL。每次试验现配现用饱和溶液。5
SN/T4298—2015
结合物工作液的配制
结合物在使用前5min~10min内，按照表4配制。如1组纤维条，需配制18.5mL结合物工作液，应先将185uL100×结合物加入到18.5mL饱和缓冲液中，混匀。表4
样品数量
1组纤维条
（26个样品+3个对照血清）
2组纤维条
（52个样品+6个对照血清）
3组纤维条
（78个样品+9个对照血清）
底物工作液的配制
结合物工作液的配制
饱和缓冲溶液
100×结合物
底物在使用前5min~10min内，按照表5配制。如1组纤维条，需配制15.5mL底物工作液，应先将110uLNBT小心缓慢加人到15.5mL底物稀释液中，然后加人55uLBCIP，混匀。
表5结合物和底物工作液的配制
样品数量
1组纤维条
（26个样品+3个对照血清）
2组纤维条
（52个样品+6个对照血清）
3组纤维条
（78个样品+9个对照血清）
正式试验
条带的饱和
稀释液
底物霜
用塑料镊子将每个致敏硝化纤维素条放至孵育槽相应的槽道内，加人0.8mL饱和缓冲液至每个道内，确保条被浸润，且条上的数字可以见到。将槽放置微型翘板摇床上，室温（22℃～25℃）摇动孵育30min。摇动的速度通常设为6个循环（前后）/min。
样品的孵育
取4μL样品或对照血清加至0.8mL饱和缓冲液中，终浓度为1：200。为了使反应处于同一反应时间，在加血清时应将翘板摇床调至30°左右倾斜角，使纤维素条至槽道内上端，以使条不会接触到槽道下端的已加人血清的缓冲液
SN/T4298—2015
将槽至翘板摇床上室温摇动孵育60min，摇动时应见到条的字母端。每次试验每一组纤维素条都应设立阴性血清、阳性血清1、阳性血清2对照，每26个样品为一组纤维素条。7.4.2.3洗纤维素条
孵育结束后，将槽倾斜倒掉饱和缓冲液，注意避免从一个道污染到另一个道。翻转槽在吸水纸上吸干。用一个装有洗液的洗液瓶轻轻冲洗槽道和纤维素条，翻转槽并在吸水纸上吸干槽。加入1mL洗液至每个槽道内，将槽置翘板摇床上室温摇动洗5min，翻转槽在吸水纸上吸干；重复洗2次。洗完3次后，将槽翻转在吸水纸上扣干槽内洗液。或者选用真空泵，用1mL洗液洗纤维条，泵吸净后，再用1mL洗液洗纤维条，重复2次。最后加人1mL洗液至每个槽道内，将槽置翘板摇床室温摇动洗5min，翻转槽在吸水纸上吸干；重复洗2次。洗完3次后，将槽翻转在吸水纸上扣干槽内洗液。7.4.2.4结合物的孵育
完成洗纤维素条后，将槽放至30°左右倾斜角的翘板摇床上，以确保条的字母端可以见到。取0.6mL结合物工作液加至每个槽道内。将槽至翘板摇床上室温摇动孵育60min。7.4.2.5洗纤维素条
按7.4.2.3操作。
底物的孵育
完成洗纤维素条后，将槽放至30左右倾斜角的翘板摇床上，确保条的字母端可以见到。取0.5mL底物工作液加至每个槽道内。将槽至翘板摇床上，室温摇动孵育直至阳性对照血清1出现5个条带，大约孵育15min左右出现5个条带
7.4.2.7反应的终止
将槽倾斜倒掉或泵吸干底物工作液，用蒸馏水洗净纤维素条，将槽翻转在吸水纸上吸干槽内液体。将纤维素条留在槽道内室温下约2bh风干条或用塑料镊子将条放至吸水纸上风干。当条干好后，将每一组纤维素条粘贴在试验记录单（参见附录B）上，并可再用宽透明胶带粘牢在记录单上，可将试验记录单彩色复印或扫描后作为原始记录保存。7.4.3结果判定
试验的有效性
对照血清的检测结果在满足下列要求时，试验为成立，方可进行样品的结果判定；否则，试验应重做：
阴性对照血清：不能出现任一5种蛋白（3ABC、3D、3B、3A、2C)条带反应或只有痕迹；阳性对照血清1：5种蛋白中每一个应出现很浅的均一密度的条带；阳性对照血清2：5种蛋白中每一个应出现很清晰的比CP1深的条带。2样品的结果判定
每份样品血清的反应应比照同一个试验中同一组纤维条阳性对照血清1的反应，根据五条带的每个带的着色深浅分析判定结果。当样品有两个或更多蛋白条带的着色密度低于阳性对照血清1时，判定为阴性反应；当样品在3ABC、3A、3B、3D（土2C)蛋白带处的着色密度等于或高于阳性对照血清1时，
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口蹄疫非结构蛋白抗体检疫技术规范Quarantine protocol for nonstructural protein antibody aganistfoot-and-mouthdiseasevirus
2015-09-02发布
中华人民共和国
国家质量监督检验检疫总局
2016-04-01实施
本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。SN/T4298—2015
本标准起草单位：中华人民共和国天津出人境检验检疫局、中华人民共和国新疆出境检验检疫局
本标准主要起草人：王玉玲、肖妍、刘国红、季新成、张俊哲、柴铭骏、刘红梅I
口蹄疫非结构蛋自抗体检疫技术规范SN/T4298—2015
本标准规定了口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验、非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验技术要求。
本标准适用于牛口蹄疫非结构蛋白抗体检测。2规范性引用文件wwW.bzxz.Net
下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T18935口蹄疫诊断技术
GB19489实验室生物安全通用要求SN/T1181口蹄疫检疫技术规范
3概述
参见附录A。
4生物安全措施
为了保护实验室人员的安全，应由具备资格的工作人员进行口蹄疫非结构蛋白抗体的检测，应当采取预防气溶胶感染的安全措施。按照GB19489中的有关规定进行操作。5被检血清样品
按常规方法采血和分离血清
血清应新鲜，无腐败。
运送和保存血清
防止血清受热，若3d内不能送到实验室，需用冷藏方法运送血清。血清应放至4℃～8℃冰箱内备用，如需长期保存，应置一20℃冰箱内口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验6
6.1试剂和材料
6.1.196孔微量板：用于样品稀释。SN/T4298—2015
6.1.2试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。6.1.3口蹄疫非结构蛋白抗体间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂：由非结构蛋白包被的抗原包被板、20X洗液、大肠杆菌（E.coli)、脱脂奶粉、马血清、阴性对照血清、阳性对照血清1、阳性对照血清2、100×结合物、底物、终止液，试剂存放于冰箱（4℃～8℃）中。6.2
仪器和设备
洗板机。
温箱。
酶标仪：波长450nm、620nm。
微量板振荡器。
天平。
台式离心机。
可调微量移液器。
试验原理
用口蹄疫病毒非结构蛋白包被ELISA微量反应板。当加入被检血清样品时，如果样品中含有非结构蛋白抗体，则与包被的非结构蛋白特异性结合形成抗原抗体复合物，未结合的物质通过洗涤从微量后，抗原抗体复合物与之结合，未结合的物质通过洗涤洗去。再加入底物反应板上洗去。加人酶标抗体后后，底物与结合抗原抗体复合物的酶标抗体发生显色反应：如果样品中不含有非结构蛋白抗体，则不能与包被的非结构蛋白结合，不能形成抗原体复合物，酶标抗体不会结合，加人底物后不显色。微量孔颜色的深浅与样品中非结构蛋白抗体的量成正比，通过酶标仪读取光密度值判定样品的阴、阳性。6.4试验程序
6.4.1试验前预准备
试剂的使用
在试验前1h左右，将包被板、洗液、终止液、底物、马血清、大肠杆菌、脱脂奶粉从冰箱中取出，于室温（22℃～25℃）下放置，使试剂恢复至室温状态，马血清大肠杆菌、脱脂奶粉用后放回冰箱。对照血清、100×结合物在使用前从冰箱中取出，用后放回冰箱中6.4.1.2
洗液的配制
用蒸馏水将20×洗液作20倍稀释，1块板约需洗液500mL（25mL20×洗液+475mL蒸馏水）。若20×洗液瓶内有晶体，可放置37℃士0.5℃水浴至晶体溶解后再配制洗液。试验中所用洗液量参见表1。表1试验所需洗液及样品/结合物稀释液量样品数量
1板（88个样品）
2板（176个样品）
3板（264个样品）
4板（352个样品）
5板（440个样品）
洗液用量/mL
样品/结合物稀释液用量/mL
6.4.1.3样品/结合物稀释液的配制SN/T4298—2015
取5g脱脂奶粉溶于约50mL洗液中，加人10mL马血清、100μL大肠杆菌，混匀，用洗液将混合液补至100mL。每次试验现配现用，试验所用量参见表1。6.4.1.4结合物工作液的配制
结合物在使用前5min10min内，按照表2配制。如1块反应板，需配制11mL结合物工作液，应取110μL100×结合物加人到11mL样品/结合物稀释液中，混匀。表2
微量板的数量
正式试验
样品的孵育
结合物工作液的配制
样品/结合物稀释液
100×结合物
取190μL样品/结合物稀释液加至微量稀释板中，取10μL样品或对照血清（对照血清使用前离清1加3个孔，阳性对照血清2加2个孔。每心加至对应的孔内，阴性对照血清加2个孔，阳性对照血目应孔内置微量板振荡器上中速振荡个样品用新的滴头。血清加至相板中相应孔内。
封板，37℃土0.5℃温箱中孵育30m合物工作液。
6.4.2.2洗板
min后，移取100μL加人反应
在孵育结束前5min~10min按6.4.1.4配制结孵育结束后，将板迅速翻转倒掉板内液体至废液缸后，在干净的吸水纸上扣至无液体流出，放置洗板机上洗板或手工洗板6次，手工洗板时应在每次洗板后，将板翻转倒掉板内液体，并在干净的吸水纸上扣至无液体流出。洗板结束后，将板翻转至干净的吸水纸上扣至无液体流出。6.4.2.3结合物的孵育
取100μL结合物工作液加至反应板的每个孔内，封板，37℃士0.5℃温箱孵育30min士0.5min。6.4.2.4洗板
按6.4.2.2操作。
底物的孵育
取100μL底物加至反应板的每个孔内，室温（22℃～25℃）孵育15min士0.5min，当反应颜色较浅时，可延长孵育时间5min～10min。3
SN/T4298—2015
反应的终止
取100uL终止液加至反应板的每个孔内。终止液的加入顺序应与底物的加人顺序相同。6.4.2.7读板
反应终止后30min内在450nm和620nm（作为自动背景校正）双波长下读板。6.4.3
结果判定
6.4.3.1试验的有效性
对照血清的检测结果在满足下列要求时，试验为成立，方可进行样品的结果判定；否则，试验应重做：
每个CN的吸收值都小于0.1时，计算其平均值。每个CP1的吸收值减去CN平均值后应大于0.15。如果有一个CP1值不满足条件，可以忽略它，用另外2个CP1计算平均值；如果3个都满足，计算3个CP1的平均值一一每个CP2的吸收值减去CN平均值后，计算其平均值。-CP2/CP1应为2.1，最大误差士25%。6.4.3.2
样品的结果判定
按式(1)计算T/C值：
T/C=(A-B)/(C-B)
式中：
被检样品的吸收值；
B——CN吸收值的平均值；
CP1吸收值的平均值，
当T/C<0.8时，被检血清样品判定为阴性反应。当0.8≤T/C<1,被检血清样品判定为可疑反应。当T/C≥1,被检血清样品判定为阳性反应。（1)
当样品的结果判定为阳性反应或可疑反应时，则应对样品进行重复检测，结果仍为阳性或可疑的，则应采用酶联免疫电转移印迹试验或病毒分离（见SN/T1181或GB/T18935）等方法作进一步的确证试验；当样品的结果判定为阴性反应时，则判定样品为阴性。非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验7
试剂和材料
八道孵育槽。
试验用蒸馏水为GB/T6682中的三级水。口蹄疫非结构蛋白抗体酶联免疫电转移印迹试验（EITB)检测试剂：致敏硝化纤维素条、10X缓冲液、大肠杆菌（E.coli）、脱脂奶粉、阴性对照血清、阳性对照血清1、阳性对照血清2、10o×结合物、底物稀释液、NBT底物、BCIP，试剂存放于冰箱（4℃～8℃)中。7.2
仪器和设备
温箱。
微型翘板摇床。
台式离心机。
7.2.4可调微量移液器。
7.2.5天平。
试验原理
SN/T4298—2015
将纯化的口蹄疫病毒3ABC、3D、2C、3B、3A非结构蛋白电转移印迹在硝化纤维素膜上。当加人样品时，如果样品中有特异性抗体，则与之结合，形成抗原抗体复合物，如果样品中没有特异性抗体则不发生结合，在洗涤过程中将被洗去，而结合在硝化纤维素条上的抗原抗体复合物不被洗去。当加人结合物（碱性磷酸酶标记的抗体）后，结合物与抗原抗体复合物结合，未结合的物质将被洗去。当加入底物时，底物与结合了抗原抗体复合物的结合物发生酶反应，在结合特异性抗体的非结构蛋白条带处产生肉眼可见的颜色反应。着色密度高低与样品中非结构蛋白抗体的量成正比。根据非结构蛋白条带着色的密度情况判定样品的阴、阳性。
7.4试验程序
7.4.1试验前预准备
7.4.1.1试剂的使用
在试验前1h左右，将致敏硝化纤维素条、10×浓缩的缓冲溶液、底物稀释液、大肠杆菌、脱脂奶粉从冰箱中取出，于室温（22℃～25℃）下放置，使试剂恢复至室温状态。大肠杆菌、脱脂奶粉用后放回冰箱中。对照血清、100X结合物、NBT和BCIP在使用前从冰箱中取出，用后放回冰箱中。7.4.1.2试验所需的溶液量
试验所需的溶液量见表3。
表3试验所需溶液量
样品数量
1组纤维条
（26个样品+3个对照血清）
1组纤维条
（52个样品+6个对照血清）
1组纤维条
（78个样品+9个对照血清）
7.4.1.3洗液的配制
饱和缓冲液
用蒸馏水将10×缓冲液做10倍稀释，1组纤维条约需洗液500mL（25mL10×缓冲液+475mL蒸馏水）。若10×缓冲液瓶内有晶体，可放置37℃士0.5℃水浴至晶体溶解后再配制洗液。7.4.1.4饱和缓冲液的配制
取2.5g脱脂奶粉，加入30mL蒸馏水，溶解后，加人5mL10×缓冲液，50μL大肠杆菌，混匀，用蒸馏水补至50mL。每次试验现配现用饱和溶液。5
SN/T4298—2015
结合物工作液的配制
结合物在使用前5min~10min内，按照表4配制。如1组纤维条，需配制18.5mL结合物工作液，应先将185uL100×结合物加入到18.5mL饱和缓冲液中，混匀。表4
样品数量
1组纤维条
（26个样品+3个对照血清）
2组纤维条
（52个样品+6个对照血清）
3组纤维条
（78个样品+9个对照血清）
底物工作液的配制
结合物工作液的配制
饱和缓冲溶液
100×结合物
底物在使用前5min~10min内，按照表5配制。如1组纤维条，需配制15.5mL底物工作液，应先将110uLNBT小心缓慢加人到15.5mL底物稀释液中，然后加人55uLBCIP，混匀。
表5结合物和底物工作液的配制
样品数量
1组纤维条
（26个样品+3个对照血清）
2组纤维条
（52个样品+6个对照血清）
3组纤维条
（78个样品+9个对照血清）
正式试验
条带的饱和
稀释液
底物霜
用塑料镊子将每个致敏硝化纤维素条放至孵育槽相应的槽道内，加人0.8mL饱和缓冲液至每个道内，确保条被浸润，且条上的数字可以见到。将槽放置微型翘板摇床上，室温（22℃～25℃）摇动孵育30min。摇动的速度通常设为6个循环（前后）/min。
样品的孵育
取4μL样品或对照血清加至0.8mL饱和缓冲液中，终浓度为1：200。为了使反应处于同一反应时间，在加血清时应将翘板摇床调至30°左右倾斜角，使纤维素条至槽道内上端，以使条不会接触到槽道下端的已加人血清的缓冲液
SN/T4298—2015
将槽至翘板摇床上室温摇动孵育60min，摇动时应见到条的字母端。每次试验每一组纤维素条都应设立阴性血清、阳性血清1、阳性血清2对照，每26个样品为一组纤维素条。7.4.2.3洗纤维素条
孵育结束后，将槽倾斜倒掉饱和缓冲液，注意避免从一个道污染到另一个道。翻转槽在吸水纸上吸干。用一个装有洗液的洗液瓶轻轻冲洗槽道和纤维素条，翻转槽并在吸水纸上吸干槽。加入1mL洗液至每个槽道内，将槽置翘板摇床上室温摇动洗5min，翻转槽在吸水纸上吸干；重复洗2次。洗完3次后，将槽翻转在吸水纸上扣干槽内洗液。或者选用真空泵，用1mL洗液洗纤维条，泵吸净后，再用1mL洗液洗纤维条，重复2次。最后加人1mL洗液至每个槽道内，将槽置翘板摇床室温摇动洗5min，翻转槽在吸水纸上吸干；重复洗2次。洗完3次后，将槽翻转在吸水纸上扣干槽内洗液。7.4.2.4结合物的孵育
完成洗纤维素条后，将槽放至30°左右倾斜角的翘板摇床上，以确保条的字母端可以见到。取0.6mL结合物工作液加至每个槽道内。将槽至翘板摇床上室温摇动孵育60min。7.4.2.5洗纤维素条
按7.4.2.3操作。
底物的孵育
完成洗纤维素条后，将槽放至30左右倾斜角的翘板摇床上，确保条的字母端可以见到。取0.5mL底物工作液加至每个槽道内。将槽至翘板摇床上，室温摇动孵育直至阳性对照血清1出现5个条带，大约孵育15min左右出现5个条带
7.4.2.7反应的终止
将槽倾斜倒掉或泵吸干底物工作液，用蒸馏水洗净纤维素条，将槽翻转在吸水纸上吸干槽内液体。将纤维素条留在槽道内室温下约2bh风干条或用塑料镊子将条放至吸水纸上风干。当条干好后，将每一组纤维素条粘贴在试验记录单（参见附录B）上，并可再用宽透明胶带粘牢在记录单上，可将试验记录单彩色复印或扫描后作为原始记录保存。7.4.3结果判定
试验的有效性
对照血清的检测结果在满足下列要求时，试验为成立，方可进行样品的结果判定；否则，试验应重做：
阴性对照血清：不能出现任一5种蛋白（3ABC、3D、3B、3A、2C)条带反应或只有痕迹；阳性对照血清1：5种蛋白中每一个应出现很浅的均一密度的条带；阳性对照血清2：5种蛋白中每一个应出现很清晰的比CP1深的条带。2样品的结果判定
每份样品血清的反应应比照同一个试验中同一组纤维条阳性对照血清1的反应，根据五条带的每个带的着色深浅分析判定结果。当样品有两个或更多蛋白条带的着色密度低于阳性对照血清1时，判定为阴性反应；当样品在3ABC、3A、3B、3D（土2C)蛋白带处的着色密度等于或高于阳性对照血清1时，
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